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Resumen

El objetivo de este protocolo es mostrar el montaje de una nanomatrix biomimética (NM) con nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Cuando se co-cultivan con células madre mesenquimales humanas (hMSCs), los NMs exhiben una excelente bioactividad en el fomento de la adhesión a los hMSCs.

Resumen

Un NM biomimético fue desarrollado para servir como un andamio biológico de ingeniería de tejidos, que puede mejorar el anclaje de las células madre. El NM biomimético se forma a partir de JBNT y FN a través del autoensamblaje en una solución acuosa. Los JBNT miden 200-300 μm de longitud con canales huecos hidrofóbicos internos y superficies hidrófilos externas. Los JBNT se cobran positivamente y los FNs se cobran negativamente. Por lo tanto, cuando se inyectan en una solución acuosa neutral, se unen a través de la unión novalente para formar los paquetes NM. El proceso de autoensamblaje se completa en pocos segundos sin ningún iniciador químico, fuente de calor o luz UV. Cuando el pH de la solución NM es menor que el punto isoeléctrico de los FN (pI 5.5-6.0), los paquetes NM se auto-liberarán debido a la presencia de FN cargado positivamente.

NM es conocido por imitar la matriz extracelular (ECM) morfológicamente y por lo tanto, se puede utilizar como un andamio inyectable, que proporciona una excelente plataforma para mejorar la adhesión hMSC. El análisis de densidad celular y los experimentos de imágenes de fluorescencia indicaron que los NMs aumentaron significativamente el anclaje de los hMSC en comparación con el control negativo.

Introducción

Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) han demostrado el potencial de autorretración y auto-diferenciación a lo largo de diferentes linajes mesenquimales, lo que ayuda en la regeneración y mantenimiento de los tejidos1. Sobre la base del potencial de diferenciación, hMSCs se consideran como candidatos para lesiones de tejido mesenquimal y terapia de trastorno hematopoyético2. hMSCs han demostrado la capacidad de promover la cicatrización de heridas mediante el aumento de la reparación de tejidos, la angiogénesis, y la reducción de la inflamación3. Sin embargo, sin asistencia bioquímica o biomateriales, la eficiencia para que los hMSCs alcancen un tejido objetivo y funcionen en la ubicación deseada es baja4. Aunque se han utilizado varios andamios de ingeniería para atraer hMSCs para adherirse a las lesiones, algunos sitios como la fractura de placas de crecimiento, en medio de un hueso largo, no son fácilmente accesibles por los andamios prefabricados convencionales, que pueden no caber perfectamente en un sitio lesionado de forma irregular.

Aquí, hemos desarrollado un nanomaterial biomimético que puede autoensamblarse in situ y ser inyectado a un área objetivo de difícil acceso. El nm bio-andamio inyectable se compone de nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Los JBNT, también conocidos como los Rosette Nanotubes (RNTs), se derivan de pares de bases de ADN, específicamente timina y adenina, aquí5,6,7. Como se ve en la Figura 1,los nanotubos se forman cuando seis moléculas de la base de ADN derivada se autoensamblan a través de enlaces de hidrógeno para formar un plano6. Seis moléculas se apilan unas sobre otras en un plano a través de una fuerte interacción de pi-stacking7,que puede ser de hasta 200-300 μm de longitud. Los JBNT están diseñados para imitar morfológicamente las fibras de colágeno para que el FN reaccione con ellas.

FN es una glicoproteína adhesiva de alto peso molecular, que se puede encontrar en la matriz extracelular (ECM)9. Estos pueden mediar el apego de las células madre a otros componentes del ECM, particularmente el colágeno10. Diseñamos JBNT para imitar morfológicamente las fibras de colágeno para que FN pueda reaccionar con ellas para formar NM en pocos segundos a través de la unión no covalente. Por lo tanto, NM es un prometedor bio-andamio para ser inyectado en un sitio de fractura ósea que no podría ser accesible por los andamios fabricados convencionalmente. Aquí, el NM inyectable presenta una excelente capacidad para mejorar el anclaje hMSC in vitro, exhibiendo su potencial para servir como un andamio para la regeneración de tejidos.

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Protocolo

1. Síntesis de JBNT

NOTA: El monómero JBNT se preparó como se publicó anteriormente11.

  1. Síntesis del compuesto A1
    1. Preparar una solución que contenga 8,50 g de ácido cianoacético de 2 y 9,80 g de etilcarbamato en 25 ml de tolueno y 2,5 ml de N, N-dimetilformamida. Añadir 4,90 ml de cloruro de fósforo en sentido dropwise. A continuación, caliente la mezcla a 70 °C y siga revolviendo durante 1,5 h.
    2. Enfríe la mezcla de reacción a temperatura ambiente y vierta 100 g de agua helada. Extraiga la capa acuosa con acetato de etilo (3 x 250 ml) y lave con 100 ml de salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore volátiles bajo vacío para obtener un sólido de color amarillo pálido.
    3. Someta la cromatografía de columna flash de gel amarillo a sílice (3% metanol/diclorometano) para producir 15,61 g del compuesto A1 como polvo blanco.
  2. Síntesis del compuesto A2
    1. Mezclar 3,12 g del compuesto A1 y 2,75 g de carbonato de potasio en 50 ml de N, N-dimetilformamida. Revuelva a temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Añadir 2,6 ml de disulfuro de carbono a la suspensión de reacción. Sigue revolviendo durante 4 h.
    3. Añadir etanol absoluto a la mezcla de reacción a 0 °C. Filtre el precipitado amarillo hacia fuera y lave con éter de dietil. Secar bajo vacío durante la noche para producir 6,18 g del compuesto A2 como sólido de color amarillo pálido.
  3. Síntesis del compuesto A3
    1. Añadir 2,7 ml de yoduro de metilo en 15 ml de acetonitrilo. Además, preparar por separado una solución del compuesto A2 añadiendo 6,18 g de A2 a 80 ml de agua/acetonitrilo (relación 7:3). Mezcle las dos soluciones y revuelva a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    2. Caliente la mezcla de reacción a 95 °C y siga revolviendo durante 3 h.
    3. Enfríe la mezcla de reacción a temperatura ambiente y luego evapore los volátiles bajo vacío.
    4. Extraiga el residuo 3x con 100 ml de acetato de etilo y lávelo con salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo vacío para obtener un sólido amarillo.
    5. Someta la cromatografía de columna flash de gel amarillo a sílice (30% acetato etílico/hexanes) para producir 4,52 g del compuesto A3 como sólido amarillo claro.
  4. Síntesis del compuesto A4
    1. Preparar solución de allylamina mediante la adición de 925 μL de allylamina en 20 ml de etanol. Añada esta solución gota a gota a la solución del compuesto A3, preparado añadiendo 3,14 g de A3 en 75 ml de etanol absoluto, más de 30 min. A continuación, caliente la mezcla de reacción para reflujo durante 16 h.
    2. Enfríe la mezcla de reacción a temperatura ambiente y evapore los volátiles para dar un sólido amarillo.
    3. Someta la cromatografía de columna flash de gel amarillo a sílice (50% acetato de etilo/hexanes al 2% de metanol/diclorometano) para producir 1,80 g del compuesto A4 como cristal blanco.
  5. Síntesis del compuesto A5
    1. Añadir 2,05 g de clorhidrato de guanidinio y 7,8 ml de etóxido de sodio (21% en etanol) en 14 ml de etanol absoluto. Caliente la mezcla a 45 °C durante 15 min.
    2. Filtre el material insoluble y agregue el filtrado directamente a la solución del compuesto A4, preparado añadiendo 2,70 g de A4 en etanol absoluto de 40 ml. Caliente la mezcla de reacción para reflujo durante 16 h.
    3. Filtre el precipitado hacia fuera para obtener 2,65 g del compuesto A5 como un sólido blanquecino.
  6. Síntesis del compuesto A6
    1. Añadir 24,9 ml de trietiltamina lentamente a la mezcla de purines obtenida añadiendo 2,11 g de compuesto A5 y 1,10 g de 4-Dimetilminopyridina en 120 ml de tetrahidrofurano durante 1 min. Revuelva a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    2. Añadir 20,7 ml de di-tert-butyl dicarbonato gota a gota a la mezcla de reacción y seguir revolviendo a temperatura ambiente durante 40 h.
    3. Agregue 20 ml de agua para apagar la reacción. Evaporar los volátiles bajo vacío.
    4. Extraiga el residuo viscoso rojo con 500 ml de acetato de etilo. A continuación, lávalo con 250 ml de agua, 75 ml de ácido cítrico al 10%, 2 veces con 200 ml de agua, 200 ml de bicarbonato sódico saturado y 200 ml de salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo el vacío para dar un sólido rojo/naranja.
    5. Someta la cromatografía de columna flash de gel sólido a sílice (0-20% acetato de etilo/hexanes) para producir 3,87 g del compuesto A6 como espuma blanca.
  7. Síntesis del compuesto A7
    1. Añadir N-metilmorfina N-óxido (50 wt.% en agua, 1,64 ml) en sentido dropwise a la solución del compuesto A6 (2,93 g) en acetona / agua (8:1, 58,5 mL) y revolver a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    2. Añadir tetraóxido de osmio (4% solución acuosa) a la mezcla durante un período de 3 minutos y seguir revolviendo a temperatura ambiente durante 24 h.
    3. Encienda la reacción con sulfito de sodio acuoso de 1,0 M hasta que la solución se vuelva incolora. Retire los volátiles bajo vacío para dar lugar a un purines blancos en agua. Extraiga el residuo con 350 ml de diclorometano y luego lave con 150 ml de agua seguido de un lavado con 150 ml de salmuera.
    4. Secar la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtrar y evaporar los volátiles bajo vacío para producir 2,45 g del compuesto A7 como un sólido blanco.
  8. Síntesis del compuesto A8
    1. Añadir 760 g de perioduro de sodio a la mezcla de 1,36 g del compuesto A7 en 35 ml de diclorometano/agua (6:1, 35 ml) y revuelva a temperatura ambiente durante 42 h.
    2. Filtre el material insoluble y concentre el filtrado bajo vacío. Extraiga el residuo resultante con 250 ml de diclorometano, y luego lave con 100 ml de agua y 100 ml de salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo vacío para dar el producto crudo.
    3. Someta el producto crudo a cromatografía de columna flash de gel de sílice (5-40% acetato de etilo/hexanes, luego 5% metanol/diclorometano) para producir 1,08 g del compuesto A8.
  9. Síntesis del compuesto A9
    1. Preparar una solución de 830 mg del compuesto A8 en 15 ml de 1,2-dicloroetano. Añadir la solución de gota a gota a la mezcla de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-ácido hexanoico trimetilsilyl éster etílico (649.5 mg) y N,N-diisopropylethylamine (591 μL) en 24 ml de 1,2-dicloroetano durante 3 min y revuelve a temperatura ambiente durante 15 min.
    2. Añadir 360,3 mg de triacetoxyborohidrato sódico a la solución y seguir revolviendo a temperatura ambiente durante 24 h.
    3. Saciar la mezcla de reacción con 6 ml de agua. Extraer la mezcla de reacción 3x con 200 ml de diclorometano y lavar con 200 ml de ácido cítrico al 10% en agua, 2x con 200 ml de agua, 200 ml de bicarbonato sódico saturado y 200 ml de salmuera en ese orden. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo vacío para obtener el producto crudo.
    4. Someta el producto crudo a cromatografía de columna flash de gel de sílice (5-30% acetato de etilo/hexanes) para producir 885 mg compuesto A9.
  10. Síntesis del monómero JBNT
    1. Disolver 0,54 g del compuesto A9 (0,54 g) en 10 ml de solución de ácido trifluoroacético/tioanisole al 94% y agitar a temperatura ambiente durante 72 h.
    2. Agregue el éter de dietil (80 ml) a la mezcla de reacción y centrífuga el precipitado hacia abajo. Vierta el ácido trifluoroacético claro que contiene sobrenadante y lave el precipitado blanco con éter de dietil y metanol para producir 168,6 mg de monómero crudo JBNT(Archivo Suplementario 1).
    3. Purifique el monómero JBNT crudo mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con una columna de fase inversa. El programa de aislamiento se muestra a continuación: Disolvente A: 100% agua; disolvente B: 100% acetonitrilo; disolvente C: solución de agua pH=1 HCl; caudal: 3 mL/min (véase la Tabla 1).
    4. Recoge el pico más grande a unos 7,2 minutos.

2. Fabricación para JBNT/FN

  1. Añadir 80 μL de solución acuosa JBNT de 1 mg/ml a 40 μL de solución acuosa FN de 1 mg/ml y pipeta varias veces.
  2. Compruebe la presencia de suspensión sólida blanca después de la tubería durante unos 10 s.
    NOTA: Se tomó un video para capturar el proceso de autoensamblaje de NM (Archivo suplementario 2).

3. Observación de especímenes liofilizados

NOTA: Este paso se realiza para mostrar la estructura de andamios de NM hecha de JBNT y FN.

  1. Prepare soluciones FN, JBNT y FN/JBNT NM para la observación de materiales liofilizados. Diluir 10 μL de 100 μg/ml de FN con 40 μL de agua destilada para hacer una solución de 20 μg/ml de FN.
  2. Preparar 100 mg/ml de solución de JBNT diluyendo 5 μL de 1 mg/ml de JBNTs en 45 μL de agua di.
  3. Mezclar 10 μL de 100 μg/mL FN y 5 μL de 1 mg/ml de JBNT en 35 μL de agua DI para formar la solución NM.
  4. Cubra tres pozos de microplacas inferiores redondas transparentes de 96 pozos con el FN, la solución JBNT y la solución NM, respectivamente. Cada pozo recibe 50 μL de la solución.
  5. Realizar la liofilización, como se describe a continuación, para visualizar la estructura del andamio del NM.
    1. Congele la placa a -80 °C durante la noche.
    2. Encienda el instrumento liofilizado y la bomba de vacío.
    3. Pulse el botón de enfriamiento para reducir la temperatura del sistema a -50 °C.
    4. Coloque la placa congelada en el instrumento liofilizado y cierre todas las aberturas de los instrumentos.
    5. Haga clic en el botón de inicio para reducir la presión del sistema a 0,9 mbar.
    6. Después de las 4 h, pulse el botón de aireación y abra la válvula para aumentar la presión del sistema a la presión atmosférica.
    7. Saque el plato del instrumento liofilizado.
    8. Utilice un microscopio para observar el FN, los JBNT y el NM autoensamblado resultante. Tome varias fotografías con una cámara para los materiales.

4. Medición de espectros de absorción

NOTA: Utilice el cambio de espectros para FN y JBNT para presentar el JBNT/FN NM12autoensamblado.

  1. Mezclar 30 μL de 100 μg/mL FN con 15 μL de agua destilada y 5 μL de 1 mg/ml de JBNT para preparar la solución JBNT/FN NM. La suspensión sólida blanca se puede ver después de canalizar la solución varias veces.
    NOTA: Las concentraciones finales de JBNT y FN en la solución son 100 μg/mL y 60 μg/mL, respectivamente. Las soluciones JBNT y FN a la misma concentración a la utilizada en la solución NM también se prepararon como soluciones de control.
  2. Diluir 5 μL de 1 mg/ml de JBNT con 45 μL de agua destilada para preparar la solución de control JBNT.
  3. Diluir 30 μL de 100 μg/mL FN con 20 μL de agua destilada para preparar la solución de control FN.
  4. Mida los espectros de absorción UV-vis de las soluciones FN, JBNT y JBNT/FN NM con el espectrofotómetro (ver Tabla de materiales)para caracterizar el ensamblaje de NM.
    1. Haga clic en el botón UV-Vis. Limpie la superficie de ensayo del espectrofotómetro y deje caer 2 μL de agua destilada sobre él. Mida como en blanco de 190-850 nm.
    2. Limpie la superficie de prueba del espectrofotómetro y suelte 2 μL de solución FN en él. Mida los espectros de absorción UV-Vis de la solución FN de 190 nm a 850 nm.
    3. Limpie la superficie de prueba del espectrofotómetro y suelte 2 μL de solución JBNT sobre ella. Mida los espectros de absorción de la solución JBNT de 190 nm a 850 nm.
    4. Limpie la superficie de prueba del espectrofotómetro y suelte 2 μL de solución JBNT/FN NM en él. Mida los espectros de absorción de la solución JBNT/FN NM de 190 nm a 850 nm.

5. Preparación de JBNT/FN NM para microscopía electrónica de transmisión (TEM)

  1. Limpie varias rejillas antes de manchar negativamente con un limpiador de plasma básico (consulte Tabla de materiales).
  2. Realice la tinción negativa de las muestras siguiendo dos procesos diferentes.
    1. Gota 3 μL de 1 mg/ml de solución acuosa JBNTs y 3 μL de solución JBNT/FN NM en rejillas separadas y déjela durante 2 minutos. A continuación, enjuague cada rejilla con 100 μL de solución de acetato de urilo (UA) del 0,5%. Escurrir el exceso de solución con papel filtrante y secar el aire de las rejillas.
    2. Mezcle 9 μL de solución JBNT/FN NM con 3 μL de solución 2.0% UA y pipeta varias veces. Pipetear la solución mixta en las rejillas y mantenerla en las rejillas durante 2 minutos. Utilice un papel de filtro para eliminar la solución mixta de las rejillas y secar las rejillas a temperatura ambiente.
  3. Por último, caracterizar la muestra de JBNT, JBNT/FN NM manchada con el paso 5.2.1, y JBNT/FN NM manchada con el paso 5.2.2 con el TEM.

6. Ensayo de función biológica in vitro

  1. Añada 200 μL de controles negativos (NC, PBS), JBNT, FN y las soluciones JBNT/FN NM en un pozo de una diapositiva de 8 pozos, respectivamente.
  2. Secar el reloj de cubierta de 8 pozos con el instrumento liofilizado para recubrir materiales en la parte inferior de los pozos. El protocolo para el secado por congelación es el mismo que el paso 3.5.
  3. A continuación, añadir 10.000 células/pozos hMSCs (Pasaje 3) en los pozos e incubarlos durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2.
  4. Después de la incubación, pipetear el medio de cultivo celular de los pozos y enjuagar el cultivo con solución PBS 1x.
  5. Añadir 100 μL de la solución fija a cada pozo con células y dejar durante 5 min. Enjuague las células suavemente con 1x PBS dos veces.
  6. Diluir 1% Tritón-X 100 a 0.1%. Añadir 100 μL de 0.1% Triton-X 100 a cada pozo con células y dejar por 10 min. Enjuague las células suavemente con 1x PBS dos veces.
  7. Diluir la ródamina fhalloidina a 1,65 μM. Añadir 100 μL de ródamina faloides a cada pozo con células e incubar el reloj de cubierta de cámara manteniendo la luz a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague las células suavemente con 1x PBS dos veces.
  8. Capture las imágenes celulares con un microscopio fluorescente.
  9. Cuente los números de celda en imágenes fluorescentes para cada grupo. Calcule la densidad de adherencia celular promediando tres áreas aleatorias en cada pozo.
  10. Presente todos los datos como media ± desviación estándar (SD). Realice análisis estadísticos utilizando una prueba T de una cola, seguida de un análisis de la varianza (ANOVA) con p<0.05, que se considera estadísticamente significativa.

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Resultados

Nuestros estudios descubrieron que la formación del NM de JBNT y FN es rápida, lo que sucedió en 10 segundos. Como se muestra en la Figura 2,floccule blanco se obtuvo cuando la solución JBNT se mezcló con la solución FN y se pipeted varias veces. El proceso de formación de NM es completamente biomimético. No se necesitan estímulos externos. El proceso de fabricación es mucho más fácil que el de algunos biomateriales emergentes, que se basa en la luz ultravioleta o iniciador quím...

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Discusión

En este estudio, desarrollamos un NM biomimético autoensamblado, que se formó con JBNTs e FN inspirados en el ADN. Al preparar la solución JBNT, el polvo liofilizado JBNT debe disolverse en el agua en lugar de PBS porque PBS causará aglomeración de JBNT, lo que inhibe su montaje. Además, el NM también debe ensamblarse en agua si queremos observar las estructuras nano-fibril del NM, porque la sal en PBS se agrupará con fibras NM, lo que puede reducir en gran medida la resolución de las imágenes.

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Divulgaciones

El Dr. Yupeng Chen es cofundador de NanoDe Therapeutics, Inc.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de NIH (Becas 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) y Universidad de Connecticut.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dichloroethaneAlfa Aesar39121
2-cyanoacetic acidSigma-AldrichC88505
4-DimethylaminopyridineTCI AmericaD1450
8 wells Chambered CoverglassThermo Fisher155409
96-well plateCorning353072
absolute ethanolThermo FisherBP2818500
acetoneSigma-Aldrich179124
acetonitrileSigma-Aldrich34851
allylamineSigma-Aldrich145831
Basic Plasma CleanerHarrick PlasmaPDC32G
citric acidSigma-Aldrich251275
concentrated hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
Deionized waterThermo Fisher15230147
dichloromethaneSigma-Aldrich270997
diethyl etherSigma-Aldrich296082
Di-tert-butyl dicarbonateSigma-Aldrich361941
ethyl acetateSigma-Aldrich319902
ethylcarbamateSigma-AldrichU2500
FibronectinThermo FisherPHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)Thermo FisherR37814
guanidinium hydrochlorideAlfa AesarA13543
hexanesSigma-Aldrich227064
Human mesenchymal stem cellsLonzaPT-2501
methanolSigma-Aldrich34860
methyl iodideSigma-Aldrich289566
N,N-DiisopropylethylamineAlfa AesarA17114
N,N-dimethylformamideSigma-Aldrich227056
N-Methylmorpholine N-oxideAlfa AesarA19802
Osmium tetraoxideAlfa Aesar45385
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140163
Phosphate Buffer SolutionThermo Fisher20012050
phosphoryl chlorideSigma-Aldrich201170
potassium carbonateSigma-Aldrich347825
reverse phase columnThermo Fisher25305-154630
Rhodamine PhalloidinThermo FisherR415
silica gelTCI AmericaS0821
sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
sodium ethoxideAlfa AesarL13083
sodium periodideSigma-Aldrich71859
sodium sulfateSigma-Aldrich239313
sodium sulfiteSigma-AldrichS0505
sodium triacetoxyborohydrideAlfa AesarB22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis)Thermo FisherND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKitLonzaPT-3001
tetrahydrofuranSigma-Aldrich401757
thioanisoleSigma-AldrichT28002
tolueneSigma-Aldrich179418
triethylamineAlfa AesarA12646
trifluoroacetic acidAlfa AesarA12198
Triton X-100Thermo FisherHFH10
Trypsin-EDTA solutionThermo Fisher25200056

Referencias

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