渗透泵的植入和压力的诱导，以建立一个症状，药理学小鼠模型DYT/PARK-ATP1A3肌张

摘要

我们提供一种方案，通过将牙兰膜植入与渗透泵相连的基底神经和小脑，生成药理学 DYT/PARK-ATP1A3 肌张肌小鼠模型。我们描述了通过应用运动挑战来诱导肌张力障碍的运动，以及通过行为评分系统表型的表征。

摘要

转基因小鼠模型面临局限性，尤其是在研究运动障碍时，大多数可用的转基因啮齿动物模型没有出现类似于人类疾病临床方面的运动表型。药理学小鼠模型允许更直接地研究病理力学及其对行为表型的影响。与大脑相连的渗透泵通过局部和慢性药物输送，为创建药理小鼠模型提供了可能性。对于快速发作肌张力障碍的遗传运动障碍-帕金森病，Na⁺/K +-ATPase的β3亚单位的功能丧失突变可以通过高度特异性的封锁⁺通过糖苷 ouabain 进行模拟。为了局部阻断基底神经和小脑中的+3亚单位，这两个大脑结构被认为严重参与快速发作肌张力障碍-帕金森病的发病机制，一个双核管被立体地植入到街状体中，另外一根小管被引入到小脑中。坎努拉斯通过乙烯基管连接到两个渗透泵，这些泵被皮下植入动物的背上，并允许长期和精确的乌巴因交付。快速发作肌张力障碍-帕金森症的药理小鼠模型具有重述无症状和症状突变载体的临床和病理特征的额外优势。就像快速发作肌张力障碍帕金森症的突变载体一样，乌巴因-高融合小鼠只有在额外暴露于压力后才发展成肌张力障碍样的运动。我们演示了轻度应力范式，并引入了两个经过修改的评分系统，用于评估一个运动表型。

引言

连续的药物直接输送到大脑的好处是众多的。重复和频繁的注射，这是动物不必要的压力因素，可以避免和药物的内腹集中更恒定。当系统管理的药物不能轻易穿透血脑屏障时，这尤其有效。此外，通过渗透泵进行慢性药物输送，允许局部输送基材，否则会产生全系统的副作用。药物可以以有针对性的方式传递到所需的大脑结构，因此其结果可直接追踪。这可用于一系列应用，如治疗效果的研究以及病理机能的研究。最后一个应用程序用于本文中的项目，以创建一个药理小鼠模型的肌张力障碍。

对肌张力障碍综合征的分析和理解，代表第三最常见的运动障碍，已经严重受限的事实，遗传动物模型基本上不能重现疾病人类和病理生理学中发现的疾病表型。这个问题不仅限于肌张力障碍综合征，但事实上涉及许多转基因啮齿动物模型在运动障碍^{领域,1，2。}转基因啮齿动物模型中缺乏表型的原因可能基于高效的补偿机制^3。在肌张力障碍的情况下，这种疾病的特点是非自愿肌肉收缩导致扭曲运动和异常的姿势^4。研究肌张力障碍症状的继发原因（即脑损伤），有助于确定这些运动异常表现所涉及的结构，如基底^{神经神经。}遗传性肌张力障碍形式的脑成像研究表明，几乎所有负责运动控制和感觉运动整合的大脑区域的功能异常^6,6，7。然而，啮齿动物模型仍然需要加深对分子和大规模网络水平上神经功能障碍的理解，以及开发治疗方案。这是药理小鼠模型提供的可能性，以更精确的方式复制疾病的临床和病理特征。

快速发作肌张力障碍-帕金森病（DYT/PARK-ATP1A3;RDP;DYT12）是肌张力障碍的遗传形式之一。它是由ATP1+3基因的功能丧失突变引起的，该基因编码为 Na +^/K=-ATPase 8 的⁺³亚单位。此外，人们认识到，基因突变携带者可以无症状多年，在暴露于压力事件后急性发展持续性普遍性肌张力障碍和帕金森病。事实上，DYT/PARK-ATP1A3的切青是不完整的，压力事件作为触发范围从身体过度兴奋和极端温度到酒精和感染^{的过度消耗,9，10。}为了研究DYT/PARK-ATP1A3并寻找潜在的治疗干预措施，已经尝试了无数次，以模仿啮齿动物模型中的应激疾病发展。然而，除了现有的一个遗传DYT/PARK-ATP1A3小鼠模型，其中暂时异常和抽搐样运动是由体温过低引起的，所有公布的基因小鼠模型DYT/PARK-ATP1A3都未能产生肌张力症状^{1,1，11，12。,12}.Calderon等人先前曾证明，在野生型小鼠中，通过心脏糖苷 ouabain 将 +3 亚单位双边阻断 [3-亚单位]，导致轻度步态^{紊乱 13}。在温暖的环境中，额外的接触电脚冲击导致肌张力和心动的表型，从而证明，慢性和有针对性的灌注的乌巴因，然后压力成功地模仿DYT/PARK-ATP1A3表型。

然而，在两个小时的温暖环境中，动物在38-40°C的温暖环境中受到电脚冲击，会诱发动物的疼痛和焦虑，这代表混淆因素，特别是评估与肌张力障碍发展相关的儿茶酚胺系统的变化。因此，本文描述了一种具有高转化价值的不同类型的应激范式，这涉及到轻度到中度运动被描述为DYT/PARK-ATP1A3患者^{9中的触发器}。此外，重复运动是众所周知的动波肌张力障碍^{14的触发因素}。老鼠反复受到具有挑战性的电机任务，包括木杆的三个下降（"杆测试"）和三个运行在罗塔罗德仪器（"罗塔罗性能测试"）。动物放在50厘米长的木杆上用来强迫动物下山，Rotarod装置被用来使老鼠被迫活动，把它们放在旋转杆上。

由于缺乏预定义的测试和分数，小鼠肌张力障碍模型的运动表型的表型的表征尤其具有挑战性。然而，一种运动残疾评估的变体在很多年一再使用，以评估^{啮齿动物13、15、16,15}类肌张肌张障碍运动的严重程度^和分布情况。我们在此提出肌张力障碍分级表的修改版本，在四分钟内观察到的肌张力障碍样动物表型证明是有效的。作为评估肌张力障碍样运动的第二种方法，我们提出了一个新开发的评分系统，用于在尾部悬架测试期间评估异常运动。它允许评估前肢、后肢和躯干等肌张力障碍运动和姿势的频率和持续时间。

研究方案

所有程序都按照适用的国际、国家和/或机构指南执行，以照顾和使用动物。德国维尔茨堡雷吉隆冯·翁特弗兰肯的地方当局批准了所有动物实验。

1. 渗透泵的吸注

注:此步骤必须至少在手术前 48 小时执行。ALZET 渗透泵需要预加注，以确保泵送速率在植入前达到稳定状态。

1. 事先准备慢性灌注所需的溶液。确保溶剂和剂与渗透泵和导管兼容。对于此处的项目，在室温和涡流下解冻 10 倍的 ouabain 库存溶液（储存在 -20 °C）和涡流 10 s。
   注意:Ouabain 是有毒的:它只能用手套处理，并且只能在无菌罩下打开，以避免吸入。
2. 打开无菌罩;消毒引擎盖，以及所有所需的仪器和材料，然后再将它们放在引擎盖下。
3. 处理渗透泵前戴上手术手套。单独准备为线状体和小脑泵指定的欧巴因溶液。
   注:考虑与指定用于小脑的泵中的溶液浓度相比，压达分量在泵中的溶液浓度必须加倍。这是因为，带状的泵连接到双管，但是，流速与连接到单个管的脑膜泵的流量相同。
4. 使用以下公式计算所需的解决方案量:
   质量输送率 （k_o） = 体积输送率 （Q） x 车辆中剂的浓度 （C_d）
   对于本项目，对照组，渗透泵的注油和填充了浓度为 11.2 ng/h 或 0.9% 盐水的 ouabain 溶液。
5. Vortex 为 10 s 和无菌过滤器 （即 0.22 μm 注射器端过滤器） 提供 10 秒的 ouabain 溶液，它们分别放入单独的新型微离心管中，对每种溶液使用不同的过滤器。
6. 与流量调节器一起称量空的渗透泵（约 0.4 g）。
7. 用无菌过滤的欧巴因溶液或车辆溶液填充 1 mL 注射器（最好用钝尖端）。
8. 将所有气泡从注射器中获取，将渗透泵保持直立位置，将管杆一直插入泵中，然后缓慢地填充储液罐，直到顶部出现多余的溶液（避免快速加注，因为这可能导致泵中的气泡）。接下来，将流量调节器插入泵中（多余的溶液应显示在顶部）。
9. 将流量调节器拉出（约 5 mm），用剪刀小心地脱下白色法兰，将一块乙烯基管连接到流式调节器上。确保导管的长度约为 2 厘米，以便动物能够正常移动。
10. 再次称重填充的渗透泵，以确保加注泵和空泵的重量差异与所装载溶液的预期重量一致性。
    注:对于大多数水溶液，此重量等于微升的体积。如果重量与预期体积不一对，则空气可能被困在泵内，需要清空并重新加注。
11. 对于泵的启动，准备两个 2 mL 微离心管，一个用于线状体管，一个用于小脑。
12. 将泵淹没在半满的微离心管中，并填充 0.9% 的盐水溶液。不要将导管的开端淹没。在 37°C 下将微送心管放入热循环器中 48 小时，以确保泵在植入前达到稳定的泵送速率，并预加导管。

2. 管和渗透泵植入

1. 将小鼠（雄性，C57Bl/6N，11-12周年龄）放入专为吸入麻醉而设计的腔室;将异氟的流速设置为2-3%，将氧气的流速设置为2L/min。
2. 根据批准的规程对小鼠进行深度麻醉后，剃掉动物的头顶、背颈和背部的近侧三分之一。
3. 将动物放入立体定向框架中，然后通过专为立体定向仪器（异氟流速 1.5-2%，2 L/min 氧气）设计的小鼠麻醉面膜继续用异氟兰麻醉。
4. 使用橡胶尖端或非断裂耳杆，将动物的头部固定到立体定向框架中，注意头部被水平。
5. 为了防止体温过低，在动物下面放置加热垫，插入直肠温度探头，并将温度设置为 37°C。 使用每只眼睛的一滴眼科软膏保护动物的眼睛不干涸。
6. 在开始手术前，在皮下涂抹镇痛剂，如卡普罗芬（5毫克/千克体重）。
7. 用注射器皮下注射高达0.2毫升的布皮瓦卡因0.25%，等待30 s局部麻醉生效。
8. 使用防腐剂（如八丁二氢氯）彻底消毒剃光区域。
9. 彻底消毒手术区域后，使用手术刀在头顶放置切口，然后用剪刀将切口一起向下切到前肢。在斗牛犬夹的帮助下暴露头骨，用无菌的棉尖施用器擦拭。
10. 将一支笔或一根用黑色墨水染色的管尖与啤酒对齐，并使用适当的坐标标记头骨上脑管的三个入口点（下底节节液灌注所需的双边孔的坐标:前/后:= 0.74 mm， 中间/侧端:+/- 1.50 mm（表示右侧 - 左侧相对于啤酒）;小脑中线处孔的坐标:前/后侧:- 6.90 mm）。接下来，仔细钻孔为基底神经和单管指定为小脑指定的双管的孔（图1A）。
11. 在花条和小脑之间钻第四个孔，用一个小螺丝钉。该螺钉最终将嵌入牙科水泥中，并为牙杆提供额外保持。使用精细钳子和螺丝刀，小心地将螺钉引入小孔中，直到它牢固地固定在头骨中。不要将螺钉植入太深，因为这样会损害脑组织。
    注:建议在插入渗透泵之前继续植入渗透泵。这样，在植入泵时，可避免对泵造成任何意外损坏。
12. 为了在动物背部的每一侧为渗透泵创建一个小口袋，请使用组织钳来分离皮下组织层。向一条后腿推进钳子，并稍微打开钳子，以扩大皮下口袋。对另一侧重复相同的步骤，首先从切口中取下钳子，然后轻轻地将其推向第二条后腿。
    注意:口袋应该允许泵很容易滑入，但是，它不应该有太多的空间在皮肤下移动。
13. 在组织钳的帮助下，将第一个泵与连接的管子一起滑入一个皮下口袋。对第二个泵重复相同的步骤。
14. 使用小型泵架，将一个自定义长度为 3.0 mm 的渗透管引入小脑中线钻孔。小心地分离管头，用牙科水泥固定管子和小螺丝，注意不要盖住渗透泵的管子的连接件。在继续手术之前，确保牙管周围的牙科水泥已完全干燥。
15. 在将中到中心距离为 3.0 mm 且定制长度为 4.0 mm 的双管插入基底杆上方的双边钻孔之前，请将两块短的乙烯基管（0.5 厘米）插入双管杆的两块连接件上。使用分叉适配器连接乙烯基管，并仔细预填充整个管系统，包括使用欧巴因溶液或车辆（室温、事先无菌过滤）的适配器和管管。这可以通过1 mL注射器和27G灌装管引入分叉适配器的单后端（图1B）进行最佳处理。
16. 使用小型泵架，小心地将双管插入双边孔中。使用夹子分离管头，用牙科水泥固定双管。
17. 将渗透泵的导管分别连接到分叉适配器和单管。确保导管对导管的连接件有牢固的控制。
    注:两个泵的流速相等，因此要小心将渗透泵与双浓缩溶液连接到分叉适配器，以确保相同的浓度到达基底神经和小脑。
18. 尽可能在头骨方向上缝针，关闭动物背部的切口，小心不要过度拉伸皮肤（图1C）。
19. 皮下注射0.5 mL的0.9%盐水，应有体温，到动物背部的每一侧的皮肤褶皱，以避免小鼠脱水，小心避免泵。

3. 电机挑战

1. 使 ouabain 或车辆接触的小鼠接受具有挑战性的运动任务，作为轻度压力暴露的一种形式，手术后 4 小时，手术后每 24 小时重复一次，以诱导肌张力障碍样的运动。这不包括行为特征;其目的是诱导一个更高的压力水平相比，正常的笼保持。
2. 将鼠标放在一个 50 厘米粗糙的木杆上，木杆直径为 1 厘米，鼻子朝下。确保将杆子放入大笼子中，在坠落时有足够的床上用品。没有必要测量下降的时间，但要寻找由乌巴因被迷住了的动物在下降杆子时呈现的非自愿超外向。让老鼠下杆三次，让两分钟在下到两点。
   注: Ouabain - perin - perin 的小鼠应出现第一个症状， 如手术后 4 小时， 如布雷迪基内西亚。然而，手术后24小时小鼠应开始呈现前肢和后肢的非自愿超扩张，作为下降期间肌张力障碍运动的迹象。
3. 对于第二个电机任务，将鼠标放在旋转杆上，就像 Rotarod 性能测试一样。Rotarod仪器不被用来测量下降的延迟，目的是使老鼠被迫活动。将鼠标放在旋转杆上三次，并在测试之间留出 2 分钟的恢复时间。
   注:要增加应力暴露，请使用加速的 Rotarod 设备。对于此处描述的项目，杆在设定的 300 秒的时间段内从 5 rpm 加速到 50 rpm。
4. 让动物在杆测试和Roarod性能测试之间恢复30分钟，再让30分钟，然后根据协议步骤4所述为肌张力障碍样运动打分。在重复应力暴露之间，让小鼠恢复24小时间隔。

4. 评估肌张障碍运动评分系统

注:实验者应蒙蔽分析的组分配，以防止偏差。用于描述小鼠表型的行为测试有两个评分系统:肌张力障碍评分表评分异常，肌张力障碍样运动和使用尾部悬浮测试的行为评分。在暴露于轻度压力后30分钟的恢复时间后，评估肌张力障碍样的运动。

1. 肌张力障碍评级等级
   注:由于缺乏预定义的行为任务，肌张力障碍评分表被建立为一个基于观察者的评分系统，类似于人类肌张力障碍的临床评分量表。这是卡尔德龙等人使用肌张力障碍分级表的^修改版本。
   1. 记录动物在4分钟内的姿势和步态，在动物被放置在一个塑料或木箱。
   2. 肌张力障碍运动的频率和分布从0到4分的分数:（0）正常运动行为;（1）运动行为异常，无肌张力障碍样运动;（2） 轻度运动障碍，轻度焦点肌张力障碍样运动;（3） 中度运动损伤，具有严重焦点肌张力障碍样运动;（4） 严重损伤，具有持续、普遍的肌张力障碍样运动（图2）。将以下运动或姿势视为肌张力障碍:前肢过度扩张、宽姿势或后肢过度扩张以及基夫病。将肌张力障碍视为焦点，以防单个身体部位受到影响，并概括为在躯干和至少两个其他身体部位受到影响的情况下。
2. 尾部悬架测试
   注:尾部悬架测试通常用于观察后肢扣扣并评分。然而，这是一个高度非特异性的表型，表示运动损伤。以下协议提出了一个针对肌张力障碍运动的特定评分系统。由于DYT/PARK-ATP1A3患者肌张力障碍的泛化，应评估前肢、躯干和后肢的肌张力障碍样运动。新开发的评分系统从0-8分，总分< 2表明不存在像肌张力障碍的运动（图3）。
   1. 把老鼠从底座附近的尾巴上捡起来，把动物抬起来。录制尾部悬架测试的 2 分钟视频，并在随后对记录进行彻底分析时分配分数。
   2. 前肢从0分到4分，其中一肢或两肢重复或持续补退，以及前肢交叉的超拉伸，被归类为肌张力障碍样:（0）无异常运动;（1） 前肢运动减少，爪子超拉伸，见记录时间为50%;（2） 前肢的轻度肌张力障碍运动<50%的记录时间;（3） 前肢的轻度肌张力障碍运动 = 记录时间的 50% 或记录的 50% 严重 < 50%;（4） 前肢严重肌张力障碍运动 = 记录时间的 50%。
      注: 欣丁克扣是一种异常运动， 不应该被记为肌张力障碍。
   3. 后肢得分从0到3分，其中后肢的缩回和紧握以及持续的超扩张被评估为肌张力障碍样:（0）没有异常运动;（1） 减少后肢的运动与过度扩张的爪子看到 = 记录的 50% 的时间;（2） 一个后肢的肌张力障碍运动;（3） 两个后肢的肌张力障碍运动。
   4. 如果出现断线失真 > 80% 的记录时间，则向分数添加一个额外的点。
   5. 把动物放回笼子里。

结果

图4 已经修改了劳申贝格尔等人^17。对于肌张力障碍分级表（A）和尾部悬浮测试（B）的数据分析，计算每个动物的每个时间点的总得分。每个时间点和每个组的均值应绘制在适当的图形上。应调查值的分布，并应用适当的统计检验来确定显著性。与足够数量的动物，一个运动表型可以检测与肌张力障碍分级表，以及评估异常运动在尾部悬浮测试。与乌巴因-注入、无压力小鼠以及对照小鼠相比，在乌巴因-注入、压力组的两项评估中，这种肌张力障碍样表型的显著提高。

图1:用于管和渗透泵植入的主要手术步骤。（A） 对于指示的坐标，需要双边钻孔，用于指定为基底神经带的双管和放置在小脑中线的单管。动物的每一侧都显示两个完全构造的渗透泵。（B） 图片显示了一个植入的，单管进入小脑，用牙科水泥固定。基底钢带的双管状应连接到分叉适配器，并在植入前预填充 ouabain。（C） 完成过程的图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:肌张力障碍样运动的评估，具有肌张力障碍评分表。在4分钟的视频中，根据身体分布和持续时间对肌张力障碍样的动作进行评分。前肢的非自愿过度扩张、后部的宽姿势或过度扩张以及基夫病被评定为肌张力障碍。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:在尾部悬架测试期间对肌张力障碍样运动的评估。新开发的2分钟尾部悬架测试中异常运动的评分系统从0-8分对前肢、后肢和躯干中的运动进行评分。对于前肢，前肢的超扩张和交叉，以及对躯干的补品弯曲，限定为肌张力障碍样。对于后肢， 非自愿的超扩张以及中线延伸的缩回被评分为肌张力障碍。超过 80% 的记录时间被得分一分。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:肌张力障碍分级和尾部悬浮测试的代表性图表。（A） 该图描绘了 NaCl-perfused、有压力小鼠（点黑线）、乌巴因-注入小鼠（点橙线）和乌巴因-注入小鼠（深蓝线）的肌张力分级等级。对于每个时间点，将显示平均值 = 均值 （SEM） 的标准误差。（B） 该图显示了在 NaCl-perfused、有压力小鼠（点黑线）、乌巴因-注入小鼠（点橙线）和乌巴因-注入小鼠（深蓝色线）的 2 分钟尾部悬浮试验期间对异常运动的评估。使用双尾曼-惠特尼测试对肌张力障碍评分表和尾部悬浮测试评分进行了统计分析。p 值的邦费罗尼-霍尔姆校正 （+） 显示观测周期为 72 小时， 存在显著差异。深蓝色 * 表示乌巴因-注入小鼠、有压力小鼠和乌巴因-注入小鼠、黑色 * 表示 NaCl-注入小鼠、有压力小鼠和 ouabain 注入小鼠之间的显著差异，以及 NaCl-注入小鼠、有压力小鼠和乌巴因注入小鼠之间的显著差异。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

此 DYT/PARK-ATP1A3 药理小鼠模型允许详细分析仅由基底神经和小脑中钠-钾离子泵的抑制引起的脑内结构和神经化学变化，以及与压力暴露相关的改变。在小鼠的情况下，最多可以植入两个渗透泵皮。本文介绍一种方法，通过实现除单个管外与分叉适配器相连的双管，详细描述慢性药物传递到多个大脑结构的方法。此方法可用于任何需要同时和长期注入多个大脑结构的应用。

我们提出了一种罕见的运动障碍的小鼠模型，患者在暴露于压力后出现永久性症状。这种假定的基因-环境相互作用仍然不被很好地理解，但可能是DYT/PARK-ATP1A3开发中的关键路径机制之一。过去曾发表过不同的方法，包括电脚冲击、抑制、寒冷或温暖的环境，以及接触各种气味11、12、13。^11,12,13为了让小鼠接触具有转化值的轻度应激因子，我们本文描述了小鼠对具有挑战性的运动任务的重复性。在极点测试中，乌巴因被注入的动物揭示了前肢和后肢的非自愿超张。这些运动非常类似于在动物的4分钟录像和尾部悬浮试验中观察到的肌张力障碍样的动作。将轻度应激应用到具有挑战性的运动任务中，可能证明在显示运动症状或神经退化的其他小鼠模型中很有用，因为基因-环境相互作用对疾病进展的程度有很大影响。

普遍缺乏预定义的行为任务以及分级尺度来分类小鼠的异常运动和姿势。大多数可用的运动任务揭示了非特异性异常，如后肢夹紧，这是许多小鼠模型中众所周知的与神经退化^{18，19的运动障碍模型}。然而，为了正确描述表型，有必要分析小鼠模型是否概括了疾病的显著特征。在这里，我们提出了修改版本的肌张力障碍分级表以前用于评估运动残疾在肌张力障碍小鼠模型^{15，16。15,}此外，我们还开发了一个基于观察者的尾部悬浮测试评分系统，该系统与人类肌张力障碍的临床评分标准类似。与乌巴因-注入、无压力动物以及车辆注入动物相比，这两种评级尺度都显示，在乌巴因-注入小鼠、有压力小鼠中得分显著提高。任何基于观察者的评分系统的缺点是对评分员进行必要的培训，以确保一致的评分，减少观察者的变异性，以及如果评分员不完全对所分析的小组完全视而不见，可能产生偏差的危险。然而，基于观察者的评分系统仍然提供一种易于访问的方法来描述表型，并且可以适应所分析的小鼠模型，如本项目中对肌张力障碍运动的评估。为了确保不同评分员之间的一致评分，应提供培训视频。为了减少任何潜在的偏差，建议不同的评分员对相同的视频剪辑进行评分，并计算各个分数的平均值。这项工作中提到的两个评分系统都记录了动物中肌张力障碍运动的存在。评级尺度可以根据项目内的具体要求进行调整，正如Ip等人之前所做的那样，在小鼠肌张力障碍模型（DYT-TOR1A）20中，仅对肌张力障碍样运动进行后肢评分。²⁰评分表可以辅之以其他先前公布的评分系统，例如评估啮齿动物中与卡尔德龙等人第¹³等人的运动残疾评分一样，其程度。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresenius Kabi		PZN06178437
Alzet osmotic pumps	Durect	4317	model 1002, flowrate 0.25 μL/h
Anchor Screws	AgnTho's	MCS1x2	2 mm long with a thread of 1mm O.D.
Bulldog Clamps	AgnTho's	13-320-035	straight, 3.5 cm
Bupivacain 0.25% Jenapharm	mibe GmbH Arzneimittel
Cannula and Minipump Holder	Stoelting Co.	51636	designed to hold 3.4 mm cannula heads
Cannula Bifurcation	Plastics One	21Y	custom made
Cannula tubing	Plastics One	C312VT/PKG	vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm
Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	fine forceps
eye cream Bepanthen	Bayer Vital GmbH
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse	Stoelting Co.	56109M
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
High Speed Rotary Micromotor Kit	Foredom	K.1070-2
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL	cp-pharma	1214	prescription needed
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3	Dr. Wilfried Müller GmbH
Kallocryl A/C	Speiko	1615	dental cement, liquid
Kallocryl CPGM rot	Speiko	1692	dental cement, red powder
Mouse and neonates adaptor	Stoelting Co.	51625	adaptor for mice for a traditional U-frame
needle holder	KLS Martin Group	20-526-14
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic	Stoelting Co.	51649
Octenisept	Schülke	118211
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double	Plastics One	3280PD-3.0/SPC	28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single	Plastics One	3280PM/SPC	28, Gauge, custom length 3.0 mm
Ouabain octahydrate 250 mg	Sigma-Aldrich	03125-250MG	CAUTION: toxic
Precision balance	Kern & Sohn	PFB 6000-1
Rectal Thermal Probe	Stoelting Co.	50304
Rimadyl 50 mg/mL, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad	Stoelting Co.	53800M
RotaRod Advanced	TSE Systems
screw driver set	AgnTho's	30090-6
Stainless Steel Burrs	AgnTho's	HM71009	0.9 mm Ø burr
Stainless Steel Burrs	AgnTho's	HM71014	1.4 mm Ø burr
StereoDrive	Neurostar		software
Stereotaxic instrument	Stoelting Co.		custom made by Neurostar
Stereotaxic robot	Neurostar
suture: coated vicryl, polyglatin 910	Ethicon	V797D
ThermoMixer C	Eppendorf AG	5382000015