Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie

Zusammenfassung

Wir bieten ein Protokoll zur Erzeugung eines pharmakologischen DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie-Mausmodells über die Implantation von Kanülen in Basalganglien und Kleinhirn, das mit osmotischen Pumpen verbunden ist. Wir beschreiben die Induktion von Dystonie-ähnlichen Bewegungen durch Anwendung einer motorischen Herausforderung und die Charakterisierung des Phänotyps über Verhaltens-Scoring-Systeme.

Zusammenfassung

Genetisch veränderte Mausmodelle sind mit Einschränkungen konfrontiert, insbesondere bei der Untersuchung von Bewegungsstörungen, bei denen die meisten verfügbaren transgenen Nagetiermodelle keinen motorischen Phänotyp aufweisen, der den klinischen Aspekten der menschlichen Krankheit ähnelt. Pharmakologische Mausmodelle ermöglichen eine direktere Untersuchung der Pathomechanismen und ihrer Wirkung auf den Verhaltensphänotyp. Osmotische Pumpen, die mit Hirnkanülen verbunden sind, eröffnen die Möglichkeit, pharmakologische Mausmodelle über lokale und chronische Medikamentenabgabe zu erstellen. Für die erbliche Bewegungsstörung des schnell aufgehenden Dystonie-Parkinsonismus kann die Funktionsverlustmutation in der Untereinheit 3 des Na⁺/K⁺-ATPase durch eine hochspezifische Blockade über das Glykosid-Ouabain simuliert werden. Um die Untereinheit 3 in den Basalganglien und dem Kleinhirn lokal zu blockieren, die beiden Hirnstrukturen sind, von denen angenommen wird, dass sie stark an der Pathogenese des schnell aufgehenden Dystonie-Parkinsonismus beteiligt sind, wird eine bilaterale Kanüle stereotaxisch in das Striatum implantiert und eine zusätzliche Einzelkanüle in das Kleinhirn eingeführt. Die Kanülen sind über Vinylschläuche mit zwei osmotischen Pumpen verbunden, die subkutan auf dem Rücken der Tiere implantiert werden und die chronische und präzise Abgabe von Ouabain ermöglichen. Das pharmakologische Mausmodell für schnell auftretende Dystonie-Parkinsonismus hat den zusätzlichen Vorteil, die klinischen und pathologischen Merkmale asymptomatischer und symptomatischer Mutationsträger zu rekapitulieren. Genau wie Mutationsträger des schnell aufgesetzten Dystonie-Parkinsonismus entwickeln die ouabain-perfundierten Mäuse dystonieartige Bewegungen erst nach zusätzlicher Belastung. Wir demonstrieren ein leichtes Stressparadigma und führen zwei modifizierte Bewertungssysteme für die Beurteilung eines Motorphänotyps ein.

Einleitung

Die Vorteile einer kontinuierlichen Medikamentenabgabe direkt ins Gehirn sind zahlreich. Wiederholte und häufige Injektionen, die einen unnötigen Stressfaktor für Tiere darstellen, können vermieden und eine konstantere intracerebrale Konzentration des Medikaments erreicht werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn systemisch verabreichte Medikamente nicht leicht in die Blut-Hirn-Schranke eindringen. Darüber hinaus ermöglicht die chronische Medikamentenabgabe über osmotische Pumpen die lokalisierte Abgabe von Substraten, die ansonsten systemweite Nebenwirkungen haben würden. Die Medikamente können gezielt an die gewünschten Hirnstrukturen abgegeben werden, so kann die resultierende Wirkung direkt nachverfolgt werden. Dies kann für eine Reihe von Anwendungen verwendet werden, wie die Untersuchung von therapeutischen Wirkungen sowie die Untersuchung von Pathomechanismen. Diese letzte Anwendung wurde im Projekt hierin verwendet, um ein pharmakologisches Mausmodell für Dystonie zu erstellen.

Die Analyse und das Verständnis von dystonischen Syndromen, die die dritthäufigste Bewegungsstörung darstellen, wurden stark durch die Tatsache eingeschränkt, dass genetische Tiermodelle den Krankheitsphänotyp, der sowohl bei kranken Menschen als auch in der Pathophysiologie vorkommt, weitgehend nicht reproduzieren. Dieses Problem beschränkt sich nicht auf dystonische Syndrome, sondern betrifft in der Tat viele transgene Nagetiermodelle im Bereich der Bewegungsstörungen^1,2. Der Grund für das Fehlen eines Phänotyps in transgenen Nagetiermodellen könnte auf hochwirksamen^{Kompensationsmechanismen}3 basieren. Im Falle von Dystonie ist die Krankheit durch unwillkürliche Muskelkontraktionen gekennzeichnet, die verdrehende Bewegungen und abnorme Haltungen^{verursachen 4}. Die Untersuchung der sekundären Ursachen (d.h. Hirnverletzungen) von dystonischen Symptomen hat dazu beigetragen, die Strukturen zu identifizieren, die an der Manifestation dieser motorischen Anomalien beteiligt sind, wie die Basalganglien⁵. Hirnbildgebungsstudien von erblichen Formen der Dystonie haben funktionelle Anomalien in fast allen Hirnregionen gezeigt, die für die motorische Steuerung und sensorimotorische Integration verantwortlich sind^6,7. Nagetiermodelle sind jedoch immer noch notwendig, um das Verständnis der neuronalen Funktionsstörungen auf molekularer und großflächiger Netzwerkebene sowie für die Entwicklung therapeutischer Optionen zu vertiefen. Hier bieten pharmakologische Mausmodelle die Möglichkeit, die klinischen und pathologischen Merkmale einer Krankheit präziser zu replizieren.

Schnelleinfalldystonie-Parkinsonismus (DYT/PARK-ATP1A3; EPEP; DYT12) ist eine der erblichen Formen der Dystonie. Es wird durch Funktionsverlustmutationen im ATP1-3-Gen verursacht, das für die Untereinheit 3 der Na⁺/K⁺-ATPase⁸kodiert. Darüber hinaus wird anerkannt, dass Genmutationsträger jahrelang frei von Symptomen sein können, bevor sie nach der Exposition gegenüber einem stressigen Ereignis eine akut generalisierte Dystonie und Parkinsonentwickeln entwickeln. Tatsächlich ist die Penetranz von DYT/PARK-ATP1A3 unvollständig und belastende Ereignisse, die als Auslöser fungieren, reichen von körperlicher Überanstrengung und extremen Temperaturen bis hin zu übermäßigem Alkoholkonsum und Infektionen^9,10. Um DYT/PARK-ATP1A3 zu untersuchen und mögliche therapeutische Interventionen zu finden, wurde mehrfach versucht, die stressabhängige Krankheitsentwicklung in Nagetiermodellen nachzuahmern. Abgesehen von dem bestehenden genetischen DYT/PARK-ATP1A3-Mausmodell, bei dem vorübergehende abnormale und krampfartige Bewegungen durch Unterkühlung induziert wurden, haben alle veröffentlichten genetischen Mausmodelle für DYT/PARK-ATP1A3 keine dystonischen Symptome^1,11,12erzeugt. Calderon et al. hatten zuvor gezeigt, dass die bilaterale Blockierung der Untereinheit 3 in den Basalganglien und im Kleinhirn über das Herzglykosid-Ouabain bei Wildmäusen zu einer leichten Gangstörung führt¹³. Die zusätzliche Exposition gegenüber elektrischen Fußschocks in einer warmen Umgebung führte zu einem dystonischen und bradykinetischen Phänotyp, was zeigt, dass chronische und gezielte Perfusion von Ouabain gefolgt von Stress den DYT/PARK-ATP1A3-Phänotyp erfolgreich imitiert.

Jedoch, Exposition der Tiere zu elektrischen Fußschocks in einer warmen Umgebung von 38-40 °C über einen Zeitraum von zwei Stunden induziert Schmerzen und Angst bei Tieren, die verwirrende Faktoren darstellen, insbesondere für die Beurteilung von Veränderungen im Katecholamin-System im Zusammenhang mit der Entwicklung von Dystonie. So beschreiben wir hierin eine andere Art von Stressparadigma mit hohem Translationswert, was auf die Tatsache zurückgeht, dass leichte bis mäßige Bewegung als Auslöser bei DYT/PARK-ATP1A3-Patienten beschrieben wurde⁹. Darüber hinaus ist repetitive Übung ein bekannter Auslöser für fokale Dystonie¹⁴. Mäuse wurden immer wieder anspruchsvollen motorischen Aufgaben unterzogen, die aus drei Absteigen eines Holzpfahls ("Poltest") und drei Läufen auf einem Rotarod-Gerät ("Rotarod-Leistungstest") bestanden. Die Platzierung der Tiere auf der Oberseite eines 50 cm großen Holzpfahls wurde verwendet, um die Tiere zum Abstieg zu zwingen, das Rotarod-Gerät wurde eingesetzt, um Mäusen Zwangsaktivität zu unterwerfen, indem sie sie auf eine rotierende Stange legten.

Die Charakterisierung des motorischen Phänotyps eines Mausmodells für Dystonie ist aufgrund des Fehlens vordefinierter Tests und Ergebnisse besonders anspruchsvoll. Allerdings wurde in den letzten Jahren wiederholt eine Variante einer Motorbehinderungsbeurteilung verwendet, um die Schwere und Verteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen bei Nagetieren^13,15,16zu bewerten. Wir stellen hierin eine modifizierte Version der Dystonie-Bewertungsskala vor, die sich bei der Bewertung des Dystonie-ähnlichen Phänotyps von Tieren als wirksam erwiesen hat, wenn sie über einen Zeitraum von vier Minuten beobachtet wird. Als zweite Methode zur Beurteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen präsentieren wir ein neu entwickeltes Bewertungssystem zur Beurteilung abnormaler Bewegungen während eines Schwanzsuspensionstests. Es ermöglicht die Beurteilung der Häufigkeit und Dauer von Dystonie-ähnlichen Bewegungen und Haltungen der vorderen Gliedmaßen, Hinterbeine sowie Rumpf.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den geltenden internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. Die Kommunen der Regierung von Unterfranken, Würzburg, genehmigten alle Tierversuche.

1. Grundierung von osmotischen Pumpen

HINWEIS: Dieser Schritt muss mindestens 48 h vor der Operation durchgeführt werden. ALZET osmotische Pumpen müssen vorgefüllt werden, um sicherzustellen, dass die Pumprate vor der Implantation einen stabilen Zustand erreicht.

1. Bereiten Sie die gewünschte Lösung für chronische Perfusion im Voraus. Stellen Sie sicher, dass das Lösungsmittel und das Mittel mit den osmotischen Pumpen und Kathetern kompatibel sind. Für das hierin vorgesehene Projekt eine 10-fache Lagerlösung von Ouabain (bei -20 °C gelagert) bei Raumtemperatur und Wirbel für 10 s auftauen.
   VORSICHT: Ouabain ist giftig: Es sollte nur mit Handschuhen behandelt und nur unter einer sterilen Kapuze geöffnet werden, um einEinatmen zu vermeiden.
2. Schalten Sie die sterile Kapuze ein; desinfizieren Sie die Kapuze sowie alle Notwendigen Instrumente und Materialien, bevor Sie sie unter die Haube legen.
3. Tragen Sie vor der Handhabung der osmotischen Pumpen chirurgische Handschuhe an. Die für die Pumpen des Striatums und des Kleinhirns vorgesehene Ouabain-Lösung separat vorbereiten.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass die Konzentration der Lösung in der Pumpe für das Striatum im Vergleich zur Konzentration der Lösung in der für das Kleinhirn vorgesehenen Pumpe verdoppelt werden muss. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Pumpe für das Striatum mit einer Doppelkanüle verbunden ist, die Durchflussrate ist jedoch die gleiche wie bei der Pumpe des Kleinhirns, die mit einer einzigen Kanüle verbunden ist.
4. Berechnen Sie die benötigte Lösungsmenge mit der folgenden Formel:
   Massenlieferrate (k_o) = Volumenlieferrate (Q) x Konzentration des Mittels im Fahrzeug (C_d)
   Für das vorliegende Projekt wurden die osmotischen Pumpen mit einer Ouabainlösung in einer Konzentration von 11,2 ng/h oder 0,9% Saline für die Kontrollgruppe grundiert und gefüllt.
5. Vortex sowohl Ouabain-Lösungen für 10 s und sterile Filter (d.h. 0,22 m Spritzen-Endfilter) sie in separaten, neuen Mikrozentrifugen-Rohren, mit einem anderen Filter für jede Lösung.
6. Wiegen Sie die leeren osmotischen Pumpen zusammen mit dem Strömungsmoderator (ca. 0,4 g).
7. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer 27 G Füllkanüle (vorzugsweise mit einer stumpfen Spitze) mit sterilgefilterter Ouabain-Lösung oder Fahrzeuglösung.
8. Holen Sie alle Luftblasen aus der Spritze, halten Sie die osmotische Pumpe in einer aufrechten Position, legen Sie die Kanüle den ganzen Weg in die Pumpe und langsam füllen Sie das Reservoir, bis überschüssige Lösung auf der Oberseite erscheint (vermeiden Sie eine schnelle Füllung, da dies zu Luftblasen in der Pumpe führen kann). Als Nächstes fügen Sie den Durchflussmoderator in die Pumpe ein (überschüssige Lösung sollte oben angezeigt werden).
9. Ziehen Sie den Strömungsmoderator heraus (ca. 5 mm), nehmen Sie vorsichtig den weißen Flansch mit der Schere ab und verbinden Sie ein Stück Vinylschlauch mit dem Strömungsmoderator. Stellen Sie sicher, dass der Katheter eine Länge von ca. 2 cm hat, um eine angemessene Beweglichkeit des Tieres zu ermöglichen.
10. Wiegen Sie die gefüllte osmotische Pumpe noch einmal, um sicherzustellen, dass der Gewichtsunterschied zwischen gefüllter und leerer Pumpe mit dem erwarteten Gewicht der geladenen Lösung übereinstimmen deiner.
    HINWEIS: Bei den meisten wässrigen Lösungen entspricht dieses Gewicht dem Volumen in Mikrolitern. Entspricht das Gewicht nicht dem erwarteten Volumen, kann Luft in der Pumpe eingeschlossen werden, die geleert und nachgefüllt werden muss.
11. Für die Grundierung der Pumpen zwei 2 ml Mikrozentrifugenrohre, ein Rohr für das Striatum und eines für das Kleinhirn vorbereiten.
12. Untertauchen Sie die Pumpen in die Mikrozentrifugenrohre, die auf halbem Weg mit 0,9% Salinelösung gefüllt sind. Tauchen Sie das offene Ende des Katheters nicht unter. Setzen Sie die Mikrozentrifugenrohre für 48 h bei 37 °C in einen Thermocycler, um sicherzustellen, dass die Pumpe vor der Implantation eine konstante Pumprate erreicht und die Katheter vorgefüllt werden.

2. Kanülen- und osmotische Pumpenimplantation

1. Die Maus (männlich, C57Bl/6N, 11-12 Wochen alt) in eine Kammer für inhalative Anästhesie legen; den Durchfluss von Isofluran auf 2-3% und den Sauerstoffdurchfluss auf 2 L/min einstellen.
2. Nachdem die Maus nach zugelassenen Protokollen tief beästhesiert ist, rasieren Sie die Oberseite des Kopfes des Tieres, den Rückenhals und das proximale Drittel des Rückens.
3. Legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und setzen Sie die Anästhesie mit Isofluran über eine Mausanästhesiemaske für das stereotaktische Instrument (Isofluran-Durchflussrate 1,5-2%, 2 L/min Sauerstoff) fort.
4. Mit Gummispitzen oder nicht gebrochenen Ohrbügeln, fixieren Sie den Kopf des Tieres in den stereotaktischen Rahmen, wobei Sie darauf achten, dass der Kopf nivelliert wird.
5. Um Unterkühlung zu vermeiden, legen Sie ein Heizkissen unter das Tier, legen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Schützen Sie die Augen des Tieres vor dem Austrocknen, indem Sie einen Tropfen ophthalmologische Salbe auf jedem Auge verwenden.
6. Tragen Sie ein Schmerzmittel wie Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht) vor Beginn der Operation subkutan auf.
7. Mit einer Spritze subkutan injizieren bis zu 0,2 ml Bupivacain 0,25% und warten Sie 30 s, bis die Lokalanästhesie wirksam wird.
8. Desinfizieren Sie die rasierten Bereiche gründlich mit einem Antiseptikum, wie Octenidindihydrochlorid.
9. Nach gründlicher Desinfektion des Operationsbereichs, verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt an der Oberseite des Kopfes zu platzieren und verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt bis zu den vorderen Gliedmaßen fortzusetzen. Den Schädel mit Hilfe von Bulldoggenklemmen aussetzen und das Periost mit einem sterilen, mit Baumwolle gekippten Applikator abwischen.
10. Richten Sie entweder einen Stift oder die Spitze einer kanüle in schwarzer Tinte mit Bregma befleckt und verwenden Sie die entsprechenden Koordinaten, um die drei Einstiegspunkte für die Hirnkanülen auf dem Schädel zu markieren (Koordinaten für die bilateralen Löcher, die für die Durchblutung der Basalganglien benötigt werden: vorder/posterior: + 0,74 mm, medial/lateral: +/- 1,50 mm (+ Anzeige der rechten Seite, - die linke Seite relativ zur Bregma); Koordinaten für das Loch an der Mittellinie des Kleinhirns: vorder/posterior: - 6,90 mm). Als nächstes bohren Sie sorgfältig die Löcher für die Doppelkanüle, die für die Basalganglien und die für das Kleinhirn vorgesehene Einzelkanüle bestimmt ist (Abbildung 1A).
11. Bohren Sie ein viertes Loch für eine kleine Schraube zwischen dem Striatum und dem Kleinhirn. Diese Schraube wird schließlich in Zahnzement eingebettet und bieten zusätzlichen Halt für die Kanülen. Mit feinen Zangen und einem Schraubenzieher, bringen Sie die Schraube vorsichtig in das kleine Loch, bis es fest im Schädel befestigt ist. Implantieren Sie die Schraube nicht zu tief, da dies das Hirngewebe schädigt.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die osmotische Pumpenimplantation fortzusetzen, bevor Sie die osmotischen Kanülen einsetzen. Dadurch wird vermieden, dass bei der Implantation der Pumpen versehentliche Schäden an den Kanülen verursacht werden.
12. Um eine kleine Tasche für die osmotische Pumpe auf jeder Seite des Tieres zurück zu schaffen, verwenden Sie Gewebezange, um die subkutanen Gewebeschichten zu trennen. Bewegen Sie die Zange auf ein Hinterbein und öffnen Sie die Zange leicht, um die subkutane Tasche zu erweitern. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die andere Seite, zuerst entfernen Sie die Zange aus dem Schnitt und schieben Sie sie dann sanft in Richtung des zweiten Hinterbeins.
    HINWEIS: Die Tasche sollte es der Pumpe ermöglichen, leicht hineinzurutschen, aber sie sollte nicht zu viel Platz haben, um sich unter der Haut zu bewegen.
13. Mit Hilfe von Gewebezangen nehmen Sie die erste Pumpe zusammen mit dem angeschlossenen Schlauchstück und schieben Sie sie in eine subkutane Tasche. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren mit der zweiten Pumpe.
14. Mit einem Minipumpenhalter, führen Sie eine einzelne osmotische Kanüle mit einer benutzerdefinierten Länge von 3,0 mm in das Loch in der Mittellinie des Kleinhirns gebohrt. Lösen Sie den Kanülenkopf sorgfältig und fixieren Sie die Kanüle sowie die kleine Schraube mit Zahnzement, wobei darauf geachtet wird, das Verbindungsstück für die Schläuche der osmotischen Pumpe nicht zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass der Zahnzement, der die Kanüle umgibt, vollständig getrocknet ist, bevor Sie mit der Operation fortfahren.
15. Bevor Sie eine Doppelkanüle mit einem Mittel-Zu-Mitte-Abstand von 3,0 mm und einer Sonderlänge von 4,0 mm in die bilateral gebohrten Löcher oberhalb der Basalganglien einsetzen, befestigen Sie zwei kurze Stücke Vinylschläuche (0,5 cm) an den beiden Verbindungsstücken der Doppelkanüle. Verbinden Sie die Vinylschläuche mit einem Bifurkationsadapter und füllen Sie das gesamte Schlauchsystem einschließlich Adapter und Kanüle sorgfältig mit Ouabain-Lösung oder Fahrzeug (Raumtemperatur, vorher steril gefiltert). Dies kann am besten mit einer 1 ml Spritze und einer 27 G Füllkanüle geschehen, die in das einzelne hintere Ende des Bifurkationsadapters eingeführt wird (Abbildung 1B).
16. Mit einem Minipumpenhalter die Doppelkanüle vorsichtig in die beidseitigen Löcher einlegen. Verwenden Sie eine Klemme, um den Kanülenkopf zu lösen und die Doppelkanüle mit Zahnzement zu fixieren.
17. Schließen Sie die Katheter der osmotischen Pumpen an den Bifurkationsadapter bzw. die einzelne Kanüle an. Stellen Sie sicher, dass die Katheter die Verbindungsstücke der Kanülen fest im Griff haben.
    HINWEIS: Beide Pumpen haben eine gleiche Durchflussrate, also seien Sie vorsichtig, die osmotische Pumpe mit der doppelkonzentrierten Lösung an den Bifurkationsadapter anzuschließen, um sicherzustellen, dass die gleiche Konzentration sowohl die Basalganglien als auch das Kleinhirn erreicht.
18. Schließen Sie den Schnitt auf dem Rücken der Tiere mit Stichen so weit wie möglich in Richtung des Schädels, wobei Sie darauf achten, die Haut nicht zu überdehnen (Abbildung 1C).
19. Subkutan 0,5 ml 0,9% Saline, die Körpertemperatur haben sollte, in eine Hautfalte auf jeder Seite des Rückens der Tiere, um eine Austrocknung der Mäuse zu vermeiden, vorsichtig vermeiden die Pumpen.

3. Motor Herausforderung

1. Unterwerfen Sie ouabain- oder fahrzeugdurchlässige Mäuse herausfordernden motorischen Aufgaben als eine Form der leichten Stressexposition 4 h nach der Operation und wiederholen sich danach alle 24 h, um Dystonie-ähnliche Bewegungen zu induzieren. Dies schließt keine Verhaltenscharakterisierung ein. sein Zweck ist es, einen höheren Stresspegel im Vergleich zu normalen Käfighaltung zu induzieren.
2. Legen Sie die Maus auf eine 50 cm grobe Holzstange mit einem Durchmesser von 1 cm, Nase nach unten. Stellen Sie sicher, dass die Stange bei Stürzen in einen großen Käfig mit ausreichend Bettwäsche gelegt wird. Es ist nicht notwendig, die Zeit des Abstiegs zu messen, aber achten Sie auf unfreiwillige Hyperextensions der vorderen Gliedmaßen und Hinterbeine von Ouabain-perfundierten Tieren beim Abstieg der Stange präsentiert. Lassen Sie Mäuse den Pol dreimal absteigen und lassen Sie 2 min Erholung zwischen absteigen.
   HINWEIS: Ouabain-perfused Mäuse sollten erste Symptome wie Bradykinesia 4 h nach der Operation präsentieren. Jedoch, 24 h nach der Operation Mäuse sollten beginnen, unwillkürliche Hyperextensions der vorderen Gliedmaßen und Hinterbeine als Zeichen der Dystonie-ähnliche Bewegungen während des Abstiegs präsentieren.
3. Legen Sie für die zweite Motoraufgabe Mäuse wie beim Rotarod-Leistungstest auf die rotierende Stange. Das Rotarod-Gerät wird nicht als Maß für die Latenz verwendet, um zu fallen, das Ziel ist es, Mäuse zwangsweise zu betätigen. Legen Sie die Mäuse dreimal auf den rotierenden Stab und lassen Sie 2 min Erholung zwischen den Tests zu.
   HINWEIS: Um die Belastungsexposition zu erhöhen, verwenden Sie ein beschleunigendes Rotarod-Gerät. Für das hier beschriebene Projekt beschleunigt die Stange über einen festgelegten Zeitraum von 300 Sek. von 5 auf 50 Umdrehungen pro Minute.
4. Lassen Sie die Tiere 30 min zwischen dem Stabtest und dem Rotarod-Leistungstest erholen und noch einmal 30 min, bevor sie für Dystonie-ähnliche Bewegungen punkten, wie unter Protokollschritt 4 beschrieben. Zwischen den sich wiederholenden Spannungsexpositionen können sich Mäuse für 24 h-Intervalle erholen.

4. Scoring-Systeme zur Beurteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen

HINWEIS: Der Experimentator sollte für die analysierte Gruppenzuweisung geblendet werden, um Verzerrungen zu verhindern. Die Verhaltenstests, die verwendet werden, um den Phänotyp der Mäuse zu charakterisieren, sind zwei Bewertungssysteme: eine Dystonie-Bewertungsskala mit abnormalen, dystonieähnlichen Bewegungen und eine Verhaltensbewertung mit dem Schwanzsuspensionstest. Bewerten Sie die Dystonie-ähnlichen Bewegungen nach einer Erholungszeit von 30 min nach der Exposition gegenüber leichtem Stress.

1. Dystonie-Bewertungsskala
   HINWEIS: Aufgrund des Fehlens vordefinierter Verhaltensaufgaben wurde die Dystonie-Bewertungsskala als beobachterbasiertes Bewertungssystem etabliert, ähnlich wie die klinische Bewertungsskala menschlicher Dystonie. Es ist eine modifizierte Version der Dystonie-Bewertungsskala, die von Calderon et al.¹³verwendet wird.
   1. Zeichnen Sie Haltung und Gang von Tieren über einen Zeitraum von 4 min auf, nachdem Tiere in eine Plastik- oder Holzkiste gelegt wurden.
   2. Ergebnis für Häufigkeit und Verteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen von 0 bis 4 Punkte: (0) normales motorisches Verhalten; (1) abnormes motorisches Verhalten, keine Dystonie-ähnliche Bewegungen; (2) leichte motorische Beeinträchtigung mit leichten fokalen Dystonie-ähnlichen Bewegungen; (3) mäßige motorische Beeinträchtigung mit schweren fokalen Dystonie-ähnlichen Bewegungen; (4) schwere Beeinträchtigung mit anhaltenden, generalisierten Dystonie-ähnlichen Bewegungen (Abbildung 2). Betrachten Sie die folgenden Bewegungen oder Haltungen als Dystonie-like: Hyperextension der vorderen Gliedmaßen, breite Haltung oder Hyperextension der Hinterbeine sowie Kyphose. Betrachten Sie Dystonie als Fokale für den Fall, dass ein einzelner Körperteil betroffen ist und als verallgemeinert, falls der Rumpf und mindestens zwei andere Körperteile betroffen sind.
2. Schwanzfederungstest
   HINWEIS: Der Schwanzsuspensionstest wird häufig verwendet, um das Umklammern der Hinterbeine zu beobachten und zu bewerten. Dies ist jedoch ein sehr unspezifischer Phänotyp, der auf eine motorische Beeinträchtigung hinweist. Das folgende Protokoll schlägt ein Bewertungssystem vor, das speziell für Dystonie-ähnliche Bewegungen spezifisch ist. Aufgrund der Verallgemeinerung der Dystonie bei DYT/PARK-ATP1A3-Patienten sollten Dystonie-ähnliche Bewegungen in vorderen Gliedmaßen, Rumpf und Hinterbeinen beurteilt werden. Ein neu entwickeltes Punktesystem von 0-8 Punkten wurde entwickelt, eine Gesamtpunktzahl < 2 deutete darauf hin, dass keine Dystonie-ähnlichen Bewegungen vorhanden waren (Abbildung 3).
   1. Nehmen Sie die Maus am Schwanz in der Nähe ihrer Basis und heben Sie das Tier nach oben. Zeichnen Sie ein 2-min-Video des Schwanzsuspensionstests auf und weisen Sie eine Punktzahl in einer anschließenden, gründlichen Analyse der Aufnahme zu.
   2. Score die vorderen Gliedmaßen von 0 bis 4 Punkte, wo wiederholte oder anhaltende tonische Rückzug von einem oder beiden vorderen Gliedmaßen, sowie eine Hyperextension kombiniert mit Kreuzung der vorderen Gliedmaßen, wurden als Dystonie-like klassifiziert: (0) keine abnormalen Bewegungen; (1) reduzierte Bewegung der vorderen Gliedmaßen mit Hyperextension der Pfoten, die 50 % der aufgezeichneten Zeit gesehen werden; (2) leichte Dystonie-ähnliche Bewegungen der vorderen Gliedmaßen < 50% der aufgezeichneten Zeit; (3) leichte dystonieartige Bewegungen der vorderen Gliedmaßen(n) 50 % der aufgezeichneten Zeit oder schwere < 50 % der aufgezeichneten Zeit; (4) schwere Dystonie-ähnliche Bewegungen der vorderen Gliedmaßen(n) 50 % der aufgezeichneten Zeit.
      HINWEIS: Hindlimb-Umklammern ist eine abnorme Bewegung, die nicht als Dystonie-ähnlich bewertet werden sollte.
   3. Erzielen Sie die Hinterbeine von 0 bis 3 Punkten, wobei das Zurückziehen und Klammern der hinteren Gliedmaßen sowie die anhaltende Hyperextension als Dystonie-ähnlich bewertet wurden: (0) keine abnormalen Bewegungen; (1) verminderte Bewegung der Hinterbeine mit Hyperextension der Pfoten, die 50 % der aufgezeichneten Zeit beträgt; (2) Dystonie-ähnliche Bewegungen eines Hinterteils; (3) Dystonie-ähnliche Bewegungen beider Hinterbeine.
   4. Bei Abschaltverzerrungen > 80% der aufgezeichneten Zeit wird der Punktzahl ein zusätzlicher Punkt hinzugefügt.
   5. Legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig.

Ergebnisse

Abbildung 4 wurde von Rauschenberger et al.¹⁷geändert. Für die Datenanalyse sowohl der Dystonie-Bewertungsskala (A) als auch des Schwanzsuspensionstests (B) wird die Gesamtpunktzahl für jeden Zeitpunkt für jedes Tier berechnet. Der Mittelwert jedes Zeitpunkts und jeder Gruppe sollte in einem entsprechenden Diagramm dargestellt werden. Die Verteilung der Werte sollte untersucht und der entsprechende statistische Test zur Bestimmung der Signifikanz angewandt werden. Bei einer ausreichenden Anzahl von Tieren kann ein motorischer Phänotyp sowohl mit der Dystonie-Bewertungsskala als auch mit der Beurteilung abnormaler Bewegungen im Schwanzsuspensionstest nachgewiesen werden. Der Dystonie-ähnliche Phänotyp wird durch den signifikant höheren motorischen Score in beiden Bewertungen in der ouabain-perfused, gestressten Gruppe im Vergleich zu Ouabain-perfused, nicht-gestressten Mäusen sowie den Kontrollmäusen nachgewiesen.

Abbildung 1: Die wichtigsten chirurgischen Schritte für kanülatische und osmotische Pumpenimplantation. (A) Für die angegebenen Koordinaten müssen beidseitig Löcher für die doppelkanüle, die für die Basalganglien und für die an der Mittellinie des Kleinhirns platzierten Einzelkanüle platziert ist, gebohrt werden. Die beiden voll konstruierten osmotischen Pumpen sind auf jeder Seite des Tieres dargestellt. (B) Das Bild zeigt eine implantierte, einzelne Kanüle in das Kleinhirn, fixiert mit Zahnzement. Die Doppelkanüle für die Basalganglien sollte vor der Implantation mit dem Bifurkationsadapter verbunden und mit Ouabain vorgefüllt werden. (C) Bild des fertigen Verfahrens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Bewertung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen mit einer Dystonie-Bewertungsskala. Während eines 4 min Video wurden Dystonie-ähnliche Bewegungen basierend auf Körperverteilung und Dauer bewertet. Eine unfreiwillige Hyperextension der vorderen Gliedmaßen, eine breite Haltung oder Hyperextension von Hinterbleibssowie sowie Kyphose wurden als Dystonie-ähnlich eingestuft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bewertung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen während eines Schwanzsuspensionstests. Das neu entwickelte Scoring-System für abnorme Bewegungen während eines 2 min Schwanzsuspensionstests bewertet Dystonie-ähnliche Bewegungen in vorderen Gliedmaßen, Hinterbeinen und Rumpf von insgesamt 0-8 Punkten. Für die vorderen Gliedmaßen qualifizieren sich eine Hyperextension und Kreuzung der vorderen Gliedmaßen sowie eine tonische Flexion zum Rumpf als Dystonie-ähnlich. Für die Hinterbeine wurde die unfreiwillige Hyperextension sowie der Rückzug mit Verlängerung über die Mittellinie als Dystonie-ähnlich gewertet. Eine Verzerrung über 80% der aufgezeichneten Zeit wurde mit einem Punkt erzielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Graphiken der Dystonie-Rating-Skala und des Schwanzsuspensionstests. (A) Die Grafik zeigt die Dystonie-Bewertungsskala für NaCl-perfused, gestresste Mäuse (gepunktete schwarze Linie), Ouabain-perfused, nicht-stressed Mäuse (gepunktete orange Linie) und Ouabain-perfused, gestresste Mäuse (dunkelblaue Linie). Für jeden Zeitpunkt werden die Mittelwerte des Mittelwerts (SEM) angezeigt. (B) Das Diagramm zeigt die Beurteilung abnormaler Bewegungen während eines 2-min Schwanzsuspensionstests für NaCl-perfused, gestresste Mäuse (gepunktete schwarze Linie), Ouabain-perfused, nicht-stressed Mäuse (gepunktete orange Linie) und Ouabain-perfused, gestresste Mäuse (dunkelblaue Linie). Statistische Auswertungen wurden für die Dystonie-Bewertungsskala und die Testbewertung der Schwanzsuspension mit dem zweischwänzigen Mann-Whitney-Test durchgeführt. Die Bonferroni-Holm-Korrektur () der p-Werte zeigte einen signifikanten Unterschied für den Beobachtungszeitraum von 72 h. Dunkelblau * bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen Ouabain-perfused, gestressten Mäusen und Ouabain-perfused, nicht-gestressten Mäusen, schwarz * bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen NaCl-perfused, gestressten Mäusen und Ouabain-perfused, gestressten Mäusen sowie zwischen NaCl-perfused, gestressten Mäusen und Ouabain-perfundierten, nicht-gestressten Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Dieses pharmakologische Mausmodell DYT/PARK-ATP1A3 ermöglicht die detaillierte Analyse inspurenrebraler struktureller und neurochemischer Veränderungen, die ausschließlich durch Hemmung der Natrium-Kalium-Ionenpumpe in den Basalganglien und Kleinhirn sowie Veränderungen im Zusammenhang mit der Stressexposition induziert werden. Bei Mäusen können maximal zwei osmotische Pumpen subkutan implantiert werden. Wir stellen hierin eine Methode vor, die die chronische Medikamentenabgabe an mehrere Gehirnstrukturen detailliert aufführt, indem wir eine Doppelkanüle implementieren, die zusätzlich zu einer einzigen Kanüle mit einem Bifurkationsadapter verbunden ist. Diese Methode kann für jede Anwendung verwendet werden, bei der mehrere Gehirnstrukturen gleichzeitig und chronisch durchsetzt werden müssen.

Wir präsentieren ein Mausmodell einer seltenen Bewegungsstörung, bei der Patienten nach der Exposition gegenüber Stress dauerhafte Symptome entwickeln. Diese vermutete Gen-Umwelt-Interaktion ist immer noch nicht gut verstanden, könnte aber einen der wichtigsten Pathomechanismen in der DYT/PARK-ATP1A3-Entwicklung darstellen. Verschiedene Methoden, um Mäuse Stress auszusetzen, wurden in der Vergangenheit veröffentlicht und umfassen elektrische Fußschläge, Zurückhaltung, kalte oder warme Umgebung und die Exposition gegenüber verschiedenen Gerüchen^11,12,13. In dem Bestreben, Mäuse einem milden Stressfaktor mit translationarischem Wert auszusetzen, beschreiben wir hier die sich wiederholende Unterwerfung von Mäusen unter herausfordernde motorische Aufgaben. Für den Pole-Test ergaben Ouabain-perfundierte Tiere eine unfreiwillige Hyperextension der vorderen Gliedmaßen und Hinterbeine. Diese Bewegungen waren den Dystonie-ähnlichen Bewegungen, die während der 4-min-Videoaufzeichnung der Tiere beobachtet wurden, sowie dem Schwanzsuspensionstest sehr ähnlich. Die Anwendung von leichtem Stress in Form von herausfordernden motorischen Aufgaben könnte sich in anderen Mausmodellen als nützlich erweisen, die motorische Symptome oder Neurodegeneration zeigen, wo Gen-Umwelt-Wechselwirkungen den Grad des Krankheitsverlaufs massiv beeinflussen.

Es gibt einen allgemeinen Mangel an vordefinierten Verhaltensaufgaben sowie Bewertungsskalen, um abnorme Bewegungen und Haltungen bei Mäusen zu klassifizieren. Die meisten verfügbaren motorischen Aufgaben zeigen unspezifische Anomalien, wie z. B. das Umklammern von Hinterbeinern, das in vielen Mausmodellen von Bewegungsstörungen mit Neurodegeneration^18,19bekannt ist. Für die richtige Charakterisierung eines Phänotyps ist es jedoch notwendig zu analysieren, ob das Mausmodell die wichtigsten Merkmale der Krankheit rekapituliert. Hierin stellen wir die modifizierte Version einer Dystonie-Bewertungsskala vor, die zuvor für die Beurteilung von motorischen Behinderungen in Dystonie-Mausmodellen^15,16verwendet wurde. Zusätzlich haben wir ein beobachterbasiertes Bewertungssystem für den Schwanzsuspensionstest entwickelt, das ähnlich wie die klinischen Bewertungsskalen menschlicher Dystonie etabliert wurde. Beide Bewertungsskalen zeigen eine deutlich höhere Punktzahl bei ouabain-perfused, gestressten Mäusen im Vergleich zu Ouabain-perfused, nicht-gestressten Tieren sowie fahrzeugdurchlässigen Tieren. Die Nachteile eines beobachterbasierten Bewertungssystems sind die notwendige Schulung von Bewertern, um eine konsistente Bewertung zu gewährleisten und die Variabilität der Beobachter zu verringern, sowie die Gefahr einer möglichen Verzerrung des Bewerters, wenn sie nicht vollständig für die analysierte Gruppe geblendet wird. Beobachter-basierte Bewertungssysteme stellen jedoch nach wie vor eine leicht zugängliche Methode zur Charakterisierung eines Phänotyps dar und können an das analysierte Mausmodell angepasst werden, wie es im vorliegenden Projekt zur Beurteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen der Fall ist. Um eine konsistente Bewertung zwischen verschiedenen Ratern zu gewährleisten, sollten Schulungsvideos zur Verfügung gestellt werden. Um mögliche Verzerrungen zu reduzieren, wird empfohlen, dass verschiedene Rater die gleichen Videoclips bewerten und dass die einzelnen Partituren gemittelt werden. Beide in dieser Arbeit erwähnten Bewertungssysteme zeichnen das Vorhandensein von Dystonie-ähnlichen Bewegungen bei Tieren auf. Die Bewertungsskalen können an die spezifischen Anforderungen innerhalb eines Projekts angepasst werden, wie zuvor von Ip et al. durchgeführt, wo nur die Hinterbeine für Dystonie-ähnliche Bewegungen in einem Mausmodell für Dystonie 1 (DYT-TOR1A)²⁰bewertet wurden. Die Bewertungsskala kann durch andere zuvor veröffentlichte Bewertungssysteme ergänzt werden, die beispielsweise den Grad der Bradykinesie bei Nagetieren bewerten, wie es mit dem Lokomotion-Behinderungs-Score von Calderon et al.¹³der Fall ist.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline	Fresenius Kabi		PZN06178437
Alzet osmotic pumps	Durect	4317	model 1002, flowrate 0.25 μL/h
Anchor Screws	AgnTho's	MCS1x2	2 mm long with a thread of 1mm O.D.
Bulldog Clamps	AgnTho's	13-320-035	straight, 3.5 cm
Bupivacain 0.25% Jenapharm	mibe GmbH Arzneimittel
Cannula and Minipump Holder	Stoelting Co.	51636	designed to hold 3.4 mm cannula heads
Cannula Bifurcation	Plastics One	21Y	custom made
Cannula tubing	Plastics One	C312VT/PKG	vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm
Dumont #5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	fine forceps
eye cream Bepanthen	Bayer Vital GmbH
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse	Stoelting Co.	56109M
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
High Speed Rotary Micromotor Kit	Foredom	K.1070-2
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL	cp-pharma	1214	prescription needed
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3	Dr. Wilfried Müller GmbH
Kallocryl A/C	Speiko	1615	dental cement, liquid
Kallocryl CPGM rot	Speiko	1692	dental cement, red powder
Mouse and neonates adaptor	Stoelting Co.	51625	adaptor for mice for a traditional U-frame
needle holder	KLS Martin Group	20-526-14
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic	Stoelting Co.	51649
Octenisept	Schülke	118211
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double	Plastics One	3280PD-3.0/SPC	28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single	Plastics One	3280PM/SPC	28, Gauge, custom length 3.0 mm
Ouabain octahydrate 250 mg	Sigma-Aldrich	03125-250MG	CAUTION: toxic
Precision balance	Kern & Sohn	PFB 6000-1
Rectal Thermal Probe	Stoelting Co.	50304
Rimadyl 50 mg/mL, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad	Stoelting Co.	53800M
RotaRod Advanced	TSE Systems
screw driver set	AgnTho's	30090-6
Stainless Steel Burrs	AgnTho's	HM71009	0.9 mm Ø burr
Stainless Steel Burrs	AgnTho's	HM71014	1.4 mm Ø burr
StereoDrive	Neurostar		software
Stereotaxic instrument	Stoelting Co.		custom made by Neurostar
Stereotaxic robot	Neurostar
suture: coated vicryl, polyglatin 910	Ethicon	V797D
ThermoMixer C	Eppendorf AG	5382000015