使用矫形器（40-300 kV）X射线设施进行细胞辐照的测定

摘要

本文档描述了使用低能耗 X 射线设备进行细胞辐照的新档案协议。测量是在尽可能模拟真实细胞辐照条件的条件下进行的。

摘要

放射生物学研究的量程协议和标准的重要性是不言而喻的。已提出几项使用低能X射线设施确定剂量的协议，但根据辐照配置、样品、材料或光束质量，有时很难知道采用哪种方案最合适。因此，我们提出了一个使用低能X射线设施进行细胞照射的量程协议。该方法的目的是在细胞单层水平上执行剂量估计，使其尽可能接近真实的细胞辐照条件。协议的不同步骤如下:确定辐照参数（高压、强度、电池容器等）、确定光束质量指数（高压半值层耦合）、在空气角瘤条件下校准电离室的剂量率测量、用EBT3放射性色素膜对细胞培养介质的衰减和散射进行量化，以及确定细胞水平的剂量率。这种方法必须针对每个新的细胞辐照配置执行，因为仅修改一个参数可以强烈地影响细胞单层水平的实际剂量沉积，特别是涉及低能量 X 射线。

引言

放射生物学的目的是在交付剂量和生物效应之间建立联系:放射测量是放射性生物实验设计中的一个关键方面。30多年来，测量标准的重要性和实践的统一性被强调为^{1、2、3、4、5。}为了建立剂量率参考，有几个协议存在^{6，7，8，9，10:}然而，正如Peexoto和安德烈奥¹¹所示，根据剂量率测定所用的剂量，差异可能高达7%。此外，即使存在协议，有时也很难知道哪个协议最适合特定应用（如果有的话），因为细胞的剂量率取决于诸如细胞容器、细胞培养介质数量或光束质量等参数。这种类型的辐照的散射和后散射也是一个非常重要的参数要考虑。事实上，对于中低能量X射线，在AAPM TG-61参考协议¹⁰中，水中的吸收剂量是在水幽灵表面测量的。考虑到非常特殊的细胞辐照条件，与TG-61协议中定义的具有大水当量幻象的吸收剂量相比，被空气包围的少量细胞培养介质更接近角膜条件。因此，我们选择将水中的克玛作为剂量供参考，而不是在水中吸收剂量。因此，我们建议采用一种新的方法，以便更好地确定交付给细胞的实际剂量。

此外，放射生物学研究的另一个关键方面是全面报告用于辐照的方法和协议，以便能够复制、解释和比较实验结果。2016年，Pedersen等人¹² 日强调，在药物前放射生物学研究中，对量子学的报告不足。Draeger等人最近进行的一项较大规模的研究^强调， 尽管报告了一些剂量参数，如剂量、能量或来源类型，但缺少对正确复制辐照条件至关重要的大部分物理和剂量参数。这项对过去20年1 000多份出版物的大规模审查表明，放射生物学研究中对物理和文量条件的报告严重缺乏。因此，为了进行可靠和可重复的实验，必须全面描述议定书和放射性生物学研究中采用的方法。

考虑到这些不同的方面，在国税局（辐射防护和核安全研究所）进行的放射性生物实验中，对矫形器设施中的细胞照射实施了严格的规程。此剂量计协议旨在尽可能模拟真实的细胞辐照条件，从而确定交付给细胞的实际剂量。为此，列出了所有辐照参数，并通过测量半值层 （HVL） 来评估光束质量指数，因为无法遵循 AAPM 协议¹⁰ 的标准建议，因此对该层进行了一些调整。然后用用于细胞辐照的细胞容器内的电传室进行绝对剂量率测量，细胞培养介质的衰减和散射也用EBT3放射性色素薄膜进行量化。由于协议中只有一个参数的修改会显著影响剂量估计，因此为每个细胞辐照配置执行专用剂量计。此外，必须计算每个电压过滤器组合的高压L值。在目前的工作中，分别使用220千伏、3 mA的强度以及0.8毫米和0.15毫米的氦和铜的固有和附加过滤。选择的细胞辐照配置位于 T25 烧瓶上，其中细胞通过 5 mL 的细胞培养介质进行辐照。

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研究方案

1. 辐照平台和辐照参数的确定

1. 使用提供中低能量 X 射线的辐照平台。确定实验参数，确保放射生物学实验的坚固性和可重复性:高压、强度、过滤（固有和附加）、半值层（HVL）、有效能量、用于剂量测量的探测器、源样本距离（SSD）、辐照场（形状、大小、几何）、剂量量、剂量法、剂量率、细胞容器和细胞培养介质数量。本协议中使用的所有参数均在表 1中提供。

2. 光束质量指数:确定半值层

注:HVL 的定义是衰减器（通常是铜或铝）的厚度，与原始值相比，可将光束的强度降低 2 倍。

1. 按照 图 1中的说明，在辐照外壳内设置设备（支撑、结膜、隔膜、电传）。在此步骤中不使用衰减材料。
2. 确保 图 1 中报告的所有距离都正确。用卷尺测量这些。
3. 将电化室置于水平位置。对于这项工作，我们使用了31002（相当于31010）圆柱形电传室校准在空气角膜。
4. 预辐照电传室 5 分钟，测量背景（此步骤无需共生器即可执行）。
5. 执行 10 个 1 分钟的测量，每个充电收集模式对应于 M_原始 值（在库伦布斯）。
6. 以温度和压力为例，在辐照外壳内放置适当的校准设备（如果不可能，请将其放置在实验附近）。通过以下温度和压力校正因子更正电表上的 M_原始 读数:
   
   其中:T（°C）和P（hPa）分别是实际温度和压力。T_参考 和 P_参考 是标准实验室校准电离子化时的参考温度和压力。压力和温度必须用校准仪器测量。获得的费用模式值是平均参考值 M（在库伦布斯）。
   注意:此步骤对于 HVL 测量来说不是绝对必要的，但建议这样做。
7. 在隔膜上方放置一定厚度的衰减器。HVL 组由不同厚度的铝箔（0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 和 10 mm 铜）组成，尺寸允许覆盖整个光束（此处为 80 x 80 mm）。
8. 测量1分钟（M_原始 更正由K_T，P 如前所述）。
   1. 如果剂量率除以起始值的 2 倍，则发现 HVL 值。采取5测量1分钟，以估计平均剂量率。
   2. 如果剂量速率不除以起始值的 2 因子，则增加或减少衰减器厚度并进行其他测量。根据需要调整衰减器的厚度。
9. 一旦发现衰减器的厚度将光束的强度降低 2 因子，请进行 5 次 1 分钟的测量以确认 HVL。
   注意:在大多数情况下，衰减器的确切厚度无法从可用的铝箔中找到。在这种情况下，分两截并插值 HVL。

3. 辐照场评估（无剂量估计）

1. 将 EBT3 薄膜放在用于辐照的支持上。
2. 辐照此薄膜以获得标记良好的辐照场（至少 2 Gy）。
3. 使用专用扫描仪扫描 EBT3 胶片。
4. 使用 "分析 "绘制剂量配置文件，然后 使用"绘图配置文件 "选项（图 2）绘制剂量配置文件。
5. 确定辐照场用于辐照的大小（同质区域，不包括区域，见图 2 ）。
6. 在用于辐照的支撑上打上标记，以确保细胞容器处于正确的位置。
   注意:在此步骤中，确定辐照场的大小，并且不估计剂量。电影阅读和分析的完整程序在第5节中给出。此外，采取利润，以避免由于细胞容器定位的错误。

4. 电化室的剂量率测量

1. 取下细胞容器，在侧面或底部（取决于使用的特定容器和电离室）打破一小部分，以便能够将电离室放置在容器内部（图3，上部）或下方（图3，下部）。示例在图 3 中给出，其中具有不同的电传室（圆柱形或平面平行）和单元格容器。在这种情况下，使用了 T25 烧瓶（图3，红色框）。
   注意:焊接铁或加热手术刀是塑料器皿孔的一个很好的替代品
2. 将容器放在外壳内用于辐照（此处为碳板）的支撑上。
3. 将电传室放在容器中（图3，红色框），处于正确的位置，并将其连接到电表。
4. 确保第 1 节中列出的所有辐照参数都正确（高压、强度、附加过滤、源样本距离等）。
5. 预辐照电传室5分钟，执行电表零化。
6. 采取10测量1分钟，以确定在空气kerma的平均剂量率（Gy.min-1）。计算 K_空气中剂量率的确定如下:
   
   其中 M是按温度、压力、极性效应、离子重组和电表校准更正的剂量计读数。N_Kair和K_q是辐射质量的校准和校正因子，其值特定于每个电化室。

5. 细胞培养介质衰减和散射的测量

注:在整个过程中，用手套处理 EBT3 薄膜。

1. 准备实验
   1. 在辐照前至少 24 小时切割小块 EBT3 薄膜。
   2. 确定薄膜的大小作为用于放射生物学实验的细胞容器的函数（例如，T25 烧瓶为 4 x 4 厘米）。
      切两套放射色素薄膜:一套用于由三片EBT3放射性色素薄膜组成的校准曲线，按剂量或时间点（本工作共9分）:和一套用于量化细胞培养媒体衰减，也每点三件。
   3. 对所有胶片进行编号（此处为右上角），并在扫描仪上的相同位置扫描它们。
   4. 让电影远离光线。
   5. 准备用于 EBT3 薄膜测量的单元容器，并在必要时切开一个部分，将薄膜放入其中（ 图 4中给出了带有 T25 的示例）。
2. 剂量率估计
   1. 测量上一节中描述的配置的剂量率。
   2. 保持此配置，用于 EBT3 放射性色素薄膜的辐照，并使用同类型的细胞容器。
3. 校准曲线的构造
   1. 以预切割的 EBT3 薄膜作为校准曲线。
   2. 不要照射三块（0 Gy）。
   3. 将第一片薄膜放在细胞容器内，其配置与细胞照射的配置相同。
   4. 照射它以获得第一剂积分。
   5. 重复此操作以获得三片 EBT3 薄膜，以相同的剂量进行辐照。
   6. 执行此每个剂量点（此工作中的 9 个剂量点（如 图5 所示的 0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2.5 和 3 Gy）。
4. 细胞培养介质衰减和散射的评价。
   1. 为所有辐照选择相同的辐照时间（例如 60s）。
   2. 在没有水的容器中照射三片 EBT3 薄膜。
   3. 在容器中用以下水照射三片 EBT3 薄膜。
      1. 将薄膜放在容器内。
      2. 用水的确切水量填充容器，以表示细胞培养介质（此处为 5 mL）。如果薄膜不能保持适当的水下，请使用小块胶带。
      3. 将细胞容器放在外壳内，确保膜正确浸入。
      4. 辐照完成后，取出 EBT3 薄膜，用吸附纸干燥，并将其存放在远离光线的地方。

6. 阅读 EBT3 放射性色素薄膜

1. 照射后至少24小时阅读EBT3电影。
2. 在专用扫描仪上扫描胶片。
3. 将扫描仪参数设置为:48 位红绿蓝蒂夫格式，传输模式下 150 dpi，且无图像校正。
4. 对扫描仪进行如下热身。
   1. 在扫描仪上放置非辐照膜。
   2. 启动扫描预览。
   3. 启动一个分时器，等待30s。
   4. 启动扫描。
   5. 在扫描结束时，启动一个分时器，并等待90年代。
   6. 同时，注册扫描，用 ImageJ 打开图像，跟踪方形投资回报率（始终相同大小和位置相同），并测量该区域的平均红色像素水平。
   7. 在 90 年代末，重复第 2 步的程序（无需触摸扫描仪内的薄膜）。
   8. 重复至少 30 次以加热和稳定扫描仪（非辐照膜上选择的区域的平均红色像素水平没有变化）。如果扫描仪（即平均红色像素值）未稳定，请继续操作。
5. EBT3 电影的扫描
   1. 将第一部电影放在扫描仪床的中心。划定一个区域，始终将胶片放置在同一位置和相同的方向。
   2. 启动扫描预览。
   3. 启动一个分时器，等待30s。
   4. 启动扫描。
   5. 在扫描结束时，启动一个分时器，并等待90年代。在这90年代改变EBT3电影。
      注:使用自编程的C++程序对EBT3放射性色素薄膜进行了分析。不同的方法可用于EBT3薄膜分析，如红色通道法或三通道法^14、15。在这种情况下，我们使用了没有背景减法的红色通道方法，图像被转换为光学密度，然后使用我们的程序转换为剂量。由于此方法已定义明确，此处未包括我们的C++计划。此外，专用软件¹⁶还可用于 EBT3 薄膜分析。

7. 确定细胞单层水平的剂量率

1. 使用水的平均质量能量吸收系数与光子流利谱（μ_en/ρ）空气评价的比例，将通过细胞培养介质 （K） 衰减和分散纠正的电化室获得的平均剂量率转换为水角。
   
   一个专用软件¹⁷ 用于计算空气中没有幻影的光子能量谱，我们使用NIST表¹⁸ 计算平均质量能量吸收系数。

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结果

在这项工作中，我们使用了一个平台，致力于小型动物辐照^19:但是，此平台可用于辐照其他类型的样品，如细胞。辐照源是一个瓦里安X射线管（NDI-225-22），具有固有的过滤0.8毫米的氦，大焦运动大小3毫米，高压范围约30至225千伏和最大强度30毫安。

用于这项研究的参数报告在 表1中。我们选择展示在 T25 烧瓶中使用此协议进行细胞辐照的示例，?...

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讨论

本工作介绍了使用低能 X 射线设施用于细胞辐照和实施的协议。如今，与钴源相比，许多放射生物学实验都是用这种辐照器进行的，因为它们易于使用、经济高效且具有很少的无线电保护约束。虽然这些设置有许多优点，因为它们使用低 X 射线能量源，但仅修改一个辐照参数可以显著影响文量。一些研究已经强调了放射生物学研究^{2、5、20、21}

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
31010 ionization chamber	PTW	ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14	https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14
EBT3 radiochromic films	Meditest	quote request	https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/
electrometer UNIDOSEwebline	PTW	online catalog, quote request	https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865
HVL material (filter, diaphragm)	PTW	online catalog, page 70, quote request	thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70
scanner for radiochromic films	Epson	quote request	Epson V700, seiko Epson corporation, Suwa, Japan
temperature and pressure measurements, Lufft OPUS20	lufft	quote request	https://www.lufft.com/products/in-room-measurements-291/opus-20-thip-1983/