オルソ電圧(40-300 kV)X線設備を用いた細胞照射用線量測定

要約

この文書は、低エネルギーX線装置を用いた細胞照射用の新しい線量測定プロトコルについて説明する。測定は、可能な限り実際の細胞照射条件をシミュレートする条件で行われます。

要約

放射線生物学的研究のためのドシメトリープロトコルと基準の重要性は自明である。低エネルギーX線設備を用いた線量決定には幾つかのプロトコルが提案されているが、照射構成、試料、材料又はビーム品質によっては、どのプロトコルが採用に最も適しているかが分かりにくい場合がある。そこで、低エネルギーX線設備を用いた細胞照射用の線量測定プロトコルを提案する。この方法の目的は、細胞単層のレベルで線量推定を行い、実際の細胞照射条件にできるだけ近づけるようにすることである。プロトコルの異なるステップは、照射パラメータ(高電圧、強度、細胞容器等)の決定、ビーム品質指標(高電圧半値層の組み合わせを含む)の決定、空気ケルマ条件で較正されたイオン化チャンバーによる線量率測定、EBT3ラジオクロムフィルムを用いた細胞培地の減衰および散乱の定量、および細胞レベルでの用量量の決定である。この方法論は、1つのパラメータのみの改変が、特に低エネルギーX線を伴う細胞単層のレベルでの実際の線量堆積に強く影響を与えることができるので、新しい細胞照射構成ごとに行われなければならない。

概要

放射線生物学の目的は、配信された用量と生物学的効果との間のリンクを確立することです。放射線実験の設計において、ドシメトリーは重要な側面である。30年以上にわたり、ドシメトリー基準の重要性と慣行の調和が強調されてきました^1,2,3,4,5.線量率の基準を確立するために、いくつかのプロトコルが存在^{する 6,7,8,9,10;}しかし、PeixotoとAndreo¹¹で示されているように、線量率決定に使用される量量に応じて最大7%の差が生じ得る。また、プロトコルが存在する場合でも、細胞の用量レートは、例えば細胞容器、細胞培養培地またはビーム品質などのパラメータに依存するため、特定のアプリケーションに最も適したプロトコルを知ることは困難な場合があります。この種の照射の散乱と後方散乱も考慮に入れるのに非常に重要なパラメータです。実際に、低エネルギーおよび中エネルギーX線については、AAPM TG-61基準プロトコル¹⁰において、水中での吸収線量は、水幻影の表面で測定される。非常に特異的な細胞照射条件を考慮すると、空気に囲まれた少量の細胞培養培地は、TG-61プロトコルのように大きな水と同等のファントムを有する吸収線量に対して定義されたものよりもケルマ条件に近い。したがって、水中で吸収された線量ではなく、基準用の量として水中のケルマを使用することを選択しました。このように、細胞に送達される実際の線量をより良く判断するための新しいアプローチを提案しています。

さらに、放射線生物学的研究のもう一つの重要な側面は、実験結果を再現、解釈、比較するために照射に使用される方法とプロトコルの完全な報告です。2016年、ペダーセンら¹² は、前臨床放射線生物学的研究におけるドシメトリーの不十分な報告を強調した。Draegerら.¹³ の大規模な最近の研究では、線量、エネルギー、またはソースタイプなどのいくつかの線量測定パラメータが報告されているにもかかわらず、照射条件を適切に複製するために不可欠な物理学および線量測定パラメータの大部分が欠落していることを強調した。過去20年間をカバーする1,000以上の出版物のこの大規模なレビューは、放射線生物学的研究における物理学と量体測定状態の報告の有意な欠如を示しています。したがって、堅牢で再現性のある実験を行うためには、放射線生物学的研究で利用されるプロトコルおよび方法の完全な記述が必須である。

これらの異なる側面を考慮して、IRSN(放射線防護・原子力安全研究所)で行われた放射線生物学的実験に対して、オルソ電圧施設での細胞照射に対して厳格なプロトコルが実施された。この線量測定プロトコルは、実際の細胞照射条件を可能な限りシミュレートし、したがって、細胞に送達される実際の線量を決定するために設計された。この目的のために、すべての照射パラメータがリストされ、ビーム品質指数は、AAPMプロトコル¹⁰ からの標準的な勧告に従うことができないとしていくつかの適応がなされた半値層(HVL)を測定することによって評価された。次に、細胞照射に用いる細胞容器内のイオン化チャンバーで絶対線量率測定を行い、細胞培養培地の減衰および散乱をEBT3放射性クロムフィルムで定量した。プロトコルの1つのパラメータのみの修飾は、線量推定に大きな影響を与えることができるので、細胞照射構成ごとに専用の線量測定が行われる。さらに、HVL 値は、各電圧フィルタの組み合わせに対して計算する必要があります。本研究では、電圧220kV、3mAの強度、および0.8mmと0.15mmの固有の濾過と0.15mmのベリウムと銅がそれぞれ使用されています。選択した細胞照射構成はT25フラスコ上にあり、そこで細胞に5mLの細胞培養培地を照射した。

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プロトコル

1. 照射プラットフォームと照射パラメータの決定

1. 低エネルギーから中エネルギーのX線を供給する照射プラットフォームを使用してください。実験のパラメータを決定し、放射線生物学的実験の堅牢性と再現性を確保する:高電圧、強度、ろ過(固有および追加)、半値層(HVL)、有効エネルギー、線量測定に使用される検出器、ソースサンプル距離(SSD)、照射場(形状、大きさ、幾何学)、線量量、線量、線量測定法、用量量、細胞量、用量量、細胞量、細胞量測定法、用量量、細胞量、細胞量測定法このプロトコルで使用されるすべてのパラメータは 、表 1に示されています。

2. ビーム品質指数:半値層の決定

注: HVL は、元の値と比較して 2 倍の係数でビームの強度を減らすために減衰器(通常は銅またはアルミニウム)の厚みとして定義されます。

1. 図 1の指示に従って、照射筐体の内部に装置 (サポート、コリメータ、ダイヤフラム、イオン化) をセットアップします。このステップでは、減衰器材料は使用されません。
2. 図 1に示す距離がすべて正しいことを確認します。これらをテープメジャーで測定します。
3. そのイオン化チャンバを水平位置に置きます。この作業では、エアケルマでキャリブレーションされた31002(31010に相当)円筒イオン化チャンバーを用いた。
4. イオン化チャンバを5分間照射し、背景を測定します(このステップはコリメータなしで行うことができます)。
5. M_生 値(クーロン)に対応する充電収集モードでそれぞれ1分の10の測定を行います。
6. 当社の場合、照射筐体の中に適切な較正された機器を使用して温度と圧力を取ります(不可能な場合は、実験の近くに置きます)。次のように温度と圧力補正係数によって、電気計のM_生 の読み取りを修正します。
   
   ここで:T(°C)とP(hPa)はそれぞれ実際の温度と圧力です。T_ref およびP_ref は、イオン化が標準実験室によって較正されたときの基準温度および圧力である。圧力と温度は、校正された機器で測定する必要があります。チャージモードで得られた値は、平均参照値M(クーロン)です。
   注: この手順は HVL 測定に厳密に必要ではありませんが、推奨されます。
7. ダイヤフラムの上に特定の厚さの減衰器を置きます。HVLセットは、異なる厚さの箔(0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10mmの銅)で構成されており、ビーム全体(ここでは80 x 80 mm)をカバーすることができます。
8. 1分(前に説明したように_KT、Pによって補正されたM_生)の測定を行う。
   1. 線量率が開始値に対して2の係数で割られる場合、HVL値が見つかる。平均線量率を推定するために1分の5つの測定を取る。
   2. 線量率が開始値に対して2の係数で割られていない場合は、減衰器の厚さを増減し、別の測定を行う。減衰器の厚さを必要に応じて調整します。
9. ビームの強度を因子2によって減少させるアッテナレータの厚さが見つかったら、5回の測定を行い、HVLを確認します。
   注:ほとんどの場合、減衰器の正確な厚さは、利用可能なホイルから見つけることはできません。この場合、二分部で進み、HVLを補間する。

3. 照射場の評価(線量推定なし)

1. 照射に使用する支持にEBT3フィルムを置きます。
2. このフィルムを照射し、十分に印示された照射場(少なくとも2Gy)を得る。
3. 専用スキャナーを使用してEBT3フィルムをスキャンします。
4. [プロファイルの分析]オプションを使用して、イメージ J を使用して線量プロファイルをプロットします (図 2)。
5. 照射の照射場の使用量の大きさを決定する(均質領域、陰茎領域を除く、 図2参照)。
6. 細胞容器が正しい位置にあることを確認するために照射に使用される支持に跡を作る。
   注:このステップでは、照射場の大きさが決定され、線量は推定されません。フィルムの読み取りと分析の完全な手順は、セクション5で与えられています。また、セルコンテナの位置によるエラーを避けるために余白を取ります。

4. イオン化チャンバーによる線量率測定

1. 細胞容器を取り、側面または底部の少し部分を壊す(使用される特定の容器およびイオン化チャンバーに依存する)イオン化チャンバーを内部(図3、上のセクション)または下(図3、下のセクション)容器に置くことができるようにする。例は、異なる電化チャンバー(円筒形または平面平行)と細胞容器を備えた 図3 に示されている。この場合、T25フラスコを使用しました(図3、赤いボックス)。
   注:はんだ付けアイロンや加熱メスは、プラスチック製品に穴を作るための良い代替手段です
2. 容器を、照射に使用する支持体のエンクロージャの内側に置きます(カーボンプレートはこちら)。
3. イオン化チャンバを容器(図3、赤い箱)に入れ、正しい位置に置き、それを電気計に接続します。
4. セクション 1 に記載されているすべての照射パラメータが正しいことを確認します(高電圧、強度、追加のろ過、ソースサンプル距離など)。
5. イオン化チャンバを5分間照射し、電気計のゼロ化を行います。
6. 1分の10回の測定を行い、空気角膜の平均用量率を決定する^{(Gy.min-1)。}K_空気 中の線量率の決定を次のように計算します。
   
   ここでMは、温度、圧力、極性効果、イオン再結合、および電気計校正によって補正された線量計の読み取り値です。N_KairとK_qは、放射線品質の校正および補正係数であり、その値は各イオン化チャンバに固有です。

5. 細胞培養培地の減衰・散乱の測定

注意:手順を通して手袋でEBT3フィルムを扱ってください。

1. 実験の準備
   1. 照射前に少なくとも24時間EBT3フィルムの小片をカットします。
   2. 放射線生物学実験に使用される細胞容器の機能としてフィルムのサイズを決定します (例えば、T25フラスコの場合は4 x 4 cm)。
      2組の放射性クロムフィルムをカット:3枚のEBT3放射性蛍色フィルムで構成されるキャリブレーション曲線用の1セット(この作品の合計9点)細胞培養培地の定量化のための1セットと、1点当たり3個も含む。
   3. すべてのフィルムに識別用の番号を付け(右上)、スキャナーの同じ位置でスキャンします。
   4. 映画を光から遠ざけてください。
   5. EBT3フィルム測定に使用する細胞容器を用意し、必要に応じてフィルムを内部に入れる部分を切り取る(図 4にT25を含む例を示す)。
2. 線量率推定
   1. 前のセクションで説明したように、構成の線量率を測定します。
   2. EBT3放射性クロムフィルムの照射のためにこの構成を維持し、同じタイプの細胞容器を使用してください。
3. 較正曲線の構築
   1. キャリブレーションカーブ用のプレカットEBT3フィルムを取ります。
   2. 3個(0Gy)を照射しないでください。
   3. 細胞容器内に第1フィルムを入れ、細胞照射と同じ構成にする。
   4. それを照射して第1の用量点を得る。
   5. この操作を繰り返して、同じ用量で照射された3枚のEBT3フィルムを得る。
   6. 図 5に示すように、この作業の各用量ポイント (0,0.25, 0.5, 0.75, 1,1.5, 2, 2.5, および 3 Gy) ごとにこれを行う。
4. 細胞培養培地の減衰と散乱の評価
   1. すべての照射に同じ照射時間(例えば60s)を選択した。
   2. 水を含まない容器に3枚のEBT3フィルムを照射します。
   3. 容器内に3枚のEBT3フィルムを水で照射する。
      1. フィルムを容器の中に入れます。
      2. 細胞培養培地を表す水の正確な量(ここでは5mL)で容器を満たします。フィルムが適切に水没したままでない場合は、テープの小片を使用してください。
      3. セル容器をエンクロージャ内に置き、フィルムが正しく浸かっていることを確認します。
      4. 照射が完了したら、EBT3フィルムを取り、吸収性紙で乾燥させ、光から離れて保管してください。

6. EBT3放射性膜の読み取り

1. 照射後24時間以上EBT3フィルムを読む。
2. 専用スキャナーでフィルムをスキャンします。
3. スキャナパラメータを、48ビットの赤緑-青のtiff形式、伝送モードで150 dpi、画像補正なしとして設定します。
4. 次のように、スキャナーのウォームアップを実行します。
   1. 非照射フィルムをスキャナーに設置します。
   2. スキャンのプレビューを起動します。
   3. タイマーを起動し、30 sを待ちます。
   4. スキャンを起動します。
   5. スキャンの最後にタイマーを起動し、90 sを待ちます。
   6. 同時に、スキャンを登録し、ImageJで画像を開き、正方形のROI(常に同じサイズと同じ位置)をトレースし、面積の平均赤ピクセルレベルの測定を行います。
   7. 90 sの終わりに、ステップ 2 から手順を繰り返します (スキャナー内のフィルムに触れることなく)。
   8. この操作を少なくとも 30 回繰り返して、スキャナーをウォームアップして安定化させます (非照射フィルムで選択された領域の平均赤ピクセル レベルにばらつきはありません)。スキャナ、すなわち平均赤ピクセル値が安定していない場合は、手順を続行する。
5. EBT3フィルムのスキャン
   1. 最初のフィルムをスキャナーベッドの中央に置きます。フィルムを常に同じ場所に同じ方向に配置する領域を区切ります。
   2. スキャンのプレビューを起動します。
   3. タイマーを起動し、30 sを待ちます。
   4. スキャンを起動します。
   5. スキャンの最後にタイマーを起動し、90 sを待ちます。これらの90の間にEBT3フィルムを変更します。
      メモ:EBT3ラジオクロミックフィルムの分析は、自己プログラムされたC++プログラムを使用して行われました。EBT3フィルム解析には、赤色チャンネル法や3チャンネル法^14,15など^、さまざまな方法を用いることができる。この場合、バックグラウンド減算のない赤チャンネル法を使用し、画像を光学密度に変換し、プログラムを使用して線量に変換しました。このメソッドは既に明確に定義されていますので、ここでは C++ プログラムは含まれていませんでした。また、専用ソフトウェア¹⁶は、EBT3フィルム分析にも使用することができる。

7. 細胞単層のレベルでの用量率の決定

1. イオン化チャンバで得られた平均用量速度を、細胞培養培地(K)の減衰および散乱によって補正された水縁に、光子フルエンススペクトル(μ en/ρ)を評価した水に対する平均質量エネルギー吸収係数の比率を用いて、水角膜に変換する。
   
   専用のソフトウェア¹⁷ を用いて、ファントムのない空気中の光子エネルギースペクトルを計算し、NIST表¹⁸ を用いて平均質量エネルギー吸収係数を算出した。

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結果

本研究では、小動物照射専用のプラットフォーム^{を使用しました。}しかし、このプラットフォームは、細胞などの他のタイプのサンプルを照射するために使用することができます。照射源は、ベリリウムの0.8mmの固有のろ過を有するVarian X線管(NDI-225-22)、3mmの大きな焦点スポーツサイズ、30〜225kVの高電圧範囲、最大強度30mAを有する。

このスタディに使?...

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ディスカッション

この研究は、低エネルギーX線設備を用いた細胞照射に使用され、実施されるプロトコルを提示する。今日では、多くの放射線生物学実験は、例えばコバルト源と比較して、使用が容易で費用対効果が高く、放射線防護上の制約が非常に少ないため、このタイプの放射線照射器で行われています。これらの設定には多くの利点がありますが、低いX線エネルギー源を使用するため、1つの照射パ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
31010 ionization chamber	PTW	ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14	https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14
EBT3 radiochromic films	Meditest	quote request	https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/
electrometer UNIDOSEwebline	PTW	online catalog, quote request	https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865
HVL material (filter, diaphragm)	PTW	online catalog, page 70, quote request	thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70
scanner for radiochromic films	Epson	quote request	Epson V700, seiko Epson corporation, Suwa, Japan
temperature and pressure measurements, Lufft OPUS20	lufft	quote request	https://www.lufft.com/products/in-room-measurements-291/opus-20-thip-1983/