埃及伊蚊气味受体对非洲爪蟾卵母细胞中人类气味的异源表达和功能分析

摘要

提出了一种方案，该方案使用 非洲爪蟾 卵母细胞表达系统与双电极电压钳耦合，对蚊子 OR 响应人类气味进行了功能表征，为探索蚊子 OR 对暴露于人类气味的反应提供了一种强大的新技术。

摘要

埃及伊蚊 （Linnaeus） 是许多重要人类疾病（包括黄热病、登革热和寨卡热）的媒介，与其他温血动物相比，它更偏爱人类宿主的血食。嗅觉线索对蚊子起着至关重要的作用，因为它们探索环境并寻找人类宿主以获取血餐，从而传播人类疾病。已知在嗅觉感觉神经元中表达的气味受体 （OR） 负责蚊子媒介与人类气味的相互作用。为了更深入地了解埃及非洲爪蟾的嗅觉生理学并在分子水平上研究它们与人类的相互作用，我们使用了非洲爪蟾卵母细胞异源表达的优化方案来功能分析埃及非洲蟾气味受体对人类气味的反应。提出了三个示例实验：1） 克隆和合成 4 至 6 天龄埃及 Ae. aegypti 触角的 OR 和气味受体辅助受体 （Orco） 的 cRNA;2） 非洲爪蟾卵母细胞中 ORs 和 Orco 的显微注射和表达;3） 使用双电极电压钳记录来自表达蚊子 ORs/Orco 的非洲爪蟾卵母细胞的全细胞电流。这些优化的程序为研究人员提供了一种新方法，可以研究伊蚊中人类气味的接收情况，并在分子水平上揭示控制其寻找宿主活动的潜在机制。

引言

埃及黄热病蚊子可以传播许多致命的疾病，包括黄热病、登革热和寨卡热，造成巨大的痛苦和生命损失。蚊子利用 CO₂、皮肤气味和体温等多种线索来定位它们的宿主¹。鉴于人类和其他温血动物都会产生 CO₂ 并且具有相似的体温，雌性埃及 Ae. aegypti 似乎主要依靠皮肤气味来区分宿主²。然而，这造成了一个复杂的情况，一项早期研究从人类皮肤散发物中分离出 300 多种化合物³。进一步的行为分析表明，这些化合物中的许多会引起埃及 Ae. aegypti 4,5,6,7 的行为反应，但蚊子究竟是如何检测到这些化合物的，在很大程度上仍然未知。我们小组最近的研究确定了几种可能参与埃及 Ae. aegypti 宿主寻找活动的人类气味剂，尽管它们的作用尚未通过进一步的行为测定得到证实⁸。这些必需的人类气味物质如何在 Ae. aegypti 的外周感觉系统中解码尚未确定。

昆虫通过其嗅觉附件上的化学感应感器检测气味。在每个感器内部，不同的嗅觉受体，包括气味受体 （OR）、离子型受体 （IR） 和味觉受体 （GRs），在嗅觉感觉神经元的膜上表达⁹。这些 OR 负责感应昆虫遇到的许多气味，尤其是与食物、宿主和交配伙伴相关的气味 10,11,12,13。先前的一项研究侧重于使用非洲爪蟾表达系统与双电极电压钳耦合来使冈比亚按蚊中 OR 的功能去孤儿化，发现按蚊 OR 专门针对芳烃进行调整，芳烃是人类散发中的主要成分¹⁴。最近的一项基因组研究在 Ae. aegypti 15 中发现了多达 ¹¹⁷ 个 OR 基因。因此，一种系统地解决这些伊蚊 OR 响应生物或生态学上重要的气味（如人类气味或产卵刺激）的功能的方法，将为那些寻求进一步了解埃及伊蚊的化学生态学或神经行为学的人提供有用的信息。

双电极电压钳 （TEVC） 技术最初是为了在 1990 年代中期检查膜离子通道的功能而开发的^16,17。从那时起，TEVC 已被用于研究许多不同昆虫物种的 ORs^{14、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32，33,34}。这种对 OR 的功能检查为回答昆虫中重要的生态问题做出了重大贡献，包括：1） 昆虫如何定位食物来源？2） 它们是如何被交配伴侣释放的挥发性信息素所吸引的？3） 他们如何为后代找到完美的产卵地点？4） 是否有任何植物衍生或合成化合物可以有效保护人类免受虫子叮咬？这些问题的答案对于控制蚊子等重要疾病媒介至关重要。

许多其他方法，包括基于人胚胎肾细胞系 293 （HEK293）、果蝇空神经元系统、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的方法，也已用于 OR 功能研究 12,20,35,36,37.然而，这些技术都需要经验丰富的分子生物学家的技能，并涉及多个潜在的混杂因素。TEVC/卵母细胞表达能够直接测量气味诱发的受体电流和离子电导率，并且具有从 cRNA 表达受体所需的快速设置时间的额外优势。因此，在这项研究中，我们使用 TEVC 来检查一种埃及 Ae. aegypti OR55 （AaegOR55） 对几种具有潜在生物学相关性的气味剂的反应，揭示了用 AaegOR55•AaegOrco 表达的卵母细胞对人类气味剂苯甲醛表现出剂量依赖性反应。

研究方案

该程序的方案，即实验动物的护理和使用，已获得批准和监控（奥本大学机构动物护理和使用委员会：批准的方案 # 2016-2987）。

注意：定制基因合成是蚊子 OR 基因克隆的可行替代方案。

1. 蚊子和嗅觉附属物（触角）采集

1. 将埃及蚊子（从美国农业部、ARS、蚊蝇研究单位的 James Becnel 博士那里获得）保持在 25 ± 2°C 和 12：12 （L：D） 小时（上午 8 点开灯）。
2. 使用 CO₂ 麻醉 ~800 只 4-6 天大的雌性蚊子，无需采血。用一把剪刀在显微镜 （40x） 下剪下蚊子触角（嗅组织），并收集在保存在干冰上的 1.5 mL 离心管中。
   注意：收集的天线可以存放在 -80 °C 的冰箱中或立即使用。

2. 或从埃及 Ae. aegypti 的触角克隆

1. 按照制造商的方案，使用市售的总 RNA 试剂盒从天线中提取总 RNA。
2. 使用市售的无 DNA 试剂盒消化总 RNA，以便按照制造商的方案去除 DNase 和其他离子。
3. 使用 Oligo d（T）20 引发的 SuperScript IV 第一链合成系统从 1.5 μg 不含 DNA 的 RNA 中合成 cDNA^13,30。
4. 根据 VectorBase （https://www.vectorbase.org/） 中可用的序列和酶切割位点的特殊要求，为 OR 基因设计 PCR 引物。在每个正向引物³⁰ 的切割位点和起始密码子之间添加一个 Kozak 序列 （GCCACC），该序列在大多数真核生物中启动翻译。
5. 按照制造商的方案，使用含有限制性核酸内切酶位点的基因特异性引物和 Kozak 序列，通过 PCR 克隆 OR 基因的编码序列。
6. 通过 1% 琼脂糖凝胶检测 PCR 产物，并按照制造商的方案使用市售凝胶提取试剂盒进行纯化。
7. 按照制造商的方案，在限制性内切酶消化后，通过将 PCR 产物克隆到 pT7Ts 载体中来构建重组质粒。
8. 通过 Sanger 测序验证重组质粒，并使用 VectorBase 数据库进行确认。

3. cRNA 合成

1. 用特异性限制性内切酶线性化构建的质粒。
   注：质粒 DNA 必须与待转录基因下游的限制性内切酶线性化。
2. 按照前面的描述^13,30，使用线性化质粒与市售 T7 试剂盒合成 cRNA。
3. 在离心管中预混 OR 和 Orco 的 cRNA （1：1），并将混合的 cRNA 分装成每个 PCR 管的 2 μL 体积（250 ng/μL/每个）。使用前将等分的 cRNA 储存在 -80 °C。

4. 非洲爪蟾 卵母细胞采集

注意：该程序遵循 Schneider 等人 ³⁸ 的指示。

1. 将 非洲爪蟾 在 1 L 超纯水中和 1 g 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉 20-30 分钟（图 1A）。用手指捏住青蛙的一个脚趾;如果没有反应，则青蛙被充分麻醉并准备好进行手术。将麻醉的青蛙转移到冰床上。
2. 手术
   1. 用 10% 聚维酮碘溶液擦拭青蛙腹侧区域，然后用干净的棉球擦拭溶液。重复此步骤 2 次。
   2. 用一次性手术刀做一个小的腹部切口（10-15 毫米， 图 1B）。分别穿透皮肤、筋膜肌肉层。切口位于腹部下部，中线外侧。
      注意：不要伤害内脏。
   3. 用镊子抓住卵巢叶的一部分，轻轻地向外拉。提起卵巢并用剪刀在体壁水平处将其剪断。重复几次，直到获得足够的卵巢材料（~200 个卵子， 图 1C）。将卵巢材料转移到洗涤缓冲液（96 mM NaCl、2 mM KCl、5 mM MgCl₂•6H₂O、5 mM HEPES 钠盐、10 μg/mL 庆大霉素，pH 7.6）中。
   4. 用可吸收缝合线闭合手术伤口（肌肉和皮肤），这些缝线通常会在 10-14 天内降解并自然脱落。
   5. 每次手术后，将青蛙放入1升恢复溶液（含有3.4克罐头和酸洗盐以及2克即时海洋海盐）直到它醒来，然后将其放回青蛙设施。
      注意：每只青蛙最多可以进行 4 次手术。每只青蛙的手术间隔应大于 2 个月。
3. 酶促去卵泡消化和卵母细胞培养
   1. 将卵母细胞（~200 个卵子， 图 1C）分成小块。
   2. 将所有卵母细胞转移到消化溶液中，包括 10 mL 洗涤缓冲液（第 4.2.3 节）和 2 mg/mL 胶原酶 B，在环境温度下转移 40-60 分钟，以去除滤泡细胞层。在显微镜下检查样品以确定 80% 的卵母细胞是否已完全脱卵;如果没有，请每 10 分钟检查一次，直到大多数卵母细胞准备好。
   3. 用 1x 林格氏溶液（96 mM NaCl、2 mM KCl、5 mM MgCl₂·6H₂O、5 mM HEPES 钠盐，pH 7.6）、洗涤缓冲液（第 4.2.3 节）、改良巴斯盐水（78 mM NaCl、1 mM KCl、0.33 mM Ca（NO₃）₂·4H₂O、0.41 mM CaCl₂·2H₂O、 0.82 mM MgSO₄·7H₂O、2.4 mM NaHCO₃、10 mM HEPES 钠盐、1.8 mM 丙酮酸钠、10 μg/mL 庆大霉素、10 μg/mL 链霉素，pH 7.6）（每种缓冲液 5 次，每次使用 10 mL）。用缓冲液充分冲洗卵母细胞，以去除未成熟和质量差的卵母细胞。
   4. 根据 Dumont 的分类在 V-VI 阶段收获卵母细胞。将 V-VI 期的健康/优质卵母细胞转移至含有改良巴斯盐水的 100 mm x 15 mm 培养皿中，具有清晰的白色/深色划分且没有视觉上明显的损伤（图 1D）（第 4.3.3 节）。丢弃质量差的卵母细胞（图 1E）。在显微注射前，将消化的卵母细胞在昆虫生长室中保持在 18 °C 约 24 小时。

5. 非洲爪蟾 卵母细胞中 cRNA 显微注射和气味受体 （ORs） 和 OR 辅助受体 （Orco） 的表达

1. 将金属基质放入 100 mm x 15 mm 培养皿中，加入改良的 Barth 盐水（第 4.3.3 节），直到基质浸没。在基质上转移卵母细胞，丢弃不符合大小的卵母细胞。将卵母细胞的植物极排列在上侧（图 1F）。
2. 使用微管拉拔器（热量 = 525，拉力 = 50，速度 = 50，时间 = 250）为每个样品拉动新鲜的玻璃毛细管（1.0 mm 外径 x 0.5 mm 内径，长度 = 100 mm），并用微量移液器斜面器以 25° 的角度锐化。将毛细管安装在纳升进样器上。
3. 注射前，从冰箱中取出一管 OR 和 Orco 的预混 cRNA（第 3.3 节），并将其放在冰上直至完全溶解。按下纳升进样器的 填充 按钮，用 OR/Orco 混合物填充毛细管。
4. 在无 RNAse 的工作站上，用纳升注射器为每个卵母细胞注射 10 ng（5 ng 或 + 5 ng Orco;~20 nL）预混 cRNA。（图 1F）。
   注意：注射前，我们按下 EMPTY 按钮排出少量混合物，以确保毛细管不堵塞。等待约 5 秒，让 cRNA 完全进入卵母细胞。
5. 注射后，将卵母细胞储存在无菌的 24 孔细胞培养板上，用改良的 Barth 盐水在 18°C 下保存 3-7 天，然后进行全细胞记录。

6. 使用双电极电压钳系统进行全电池电流记录（图 2）

1. 在双电极电压钳记录之前，将单个气味化合物溶解在二甲基亚砜 （DMSO） 中，以获得一系列储备溶液 （100 μg/μL）。用 1x ND96 缓冲液（91 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl₂·2H₂O、2 mM MgCl₂·6H₂O、5 mM HEPES 钠盐，pH 7.6）将这些储备溶液稀释 1000 倍，以获得一组工作溶液 （0.1 μg/μL）。
2. 确保 TMC 隔振台上的所有物品，包括金属防护罩、显微镜、光源和废液泵，都小心接地，以减少外部电噪声对全电池信号记录的影响。
3. 通过使用微管拉拔器（热量 = 525，拉力 = 50，速度 = 50，时间 = 250）拉动玻璃毛细管（1.20 mm 外径 x 0.94 mm 内径，长度 = 750 mm）来制备微电极。用 3 M KCl 填充毛细管。在 10% 氯漂白剂中氯化 Ag/AgCl 丝 2-5 分钟，直到它们变成深灰色（浅灰色 Ag/AgCl 丝需要氯化）。
4. 通过打开 Oocyte Clamp 和 Digidata Digitizer 打开机器（图 3A）。打开软件（例如 Clampex 10.3）并单击 Record 按钮。打开 1x ND96 缓冲液的开关（第 6.1 节）和废液缓冲液的泵。
5. 通过将微电极插入流动缓冲液中，然后按下 V_m 电极测试按钮和 VE 电极测试按钮来检查微电极的电阻，从而进行预测试。V_m 应< 40 mV，V_e 应< 40 μA。预测试后关闭 1x ND96 缓冲液（第 6.1 节）流量和废液泵。
6. 将每个卵母细胞放入装有 1x ND96 缓冲液（第 6.1 节）的灌注室（图 2）中，并轻轻地放置卵母细胞，使植物杆朝上，由玻璃毛虫。将电极缓慢插入卵母细胞（图 3B）。将 V_m 参数调整为 0，然后将 V_e 参数调整为 0。将 Clamp 按钮从 OFF 更改为 FAST。将 Gain（增益）按钮调整为 ~ -80 mV。
7. 检查 V_e 的值，该值应为 constant。如果没有，则两个微电极中的至少一个存在泄漏。如果发生这种情况，请用新的毛细管更换任何有故障的组件。
8. 用卵母细胞夹以 ~-80 mV 的保持电位记录来自注射卵母细胞的全细胞电流（图 2）。
9. 执行数据采集和分析。
   1. 恢复 1x ND96 缓冲液的流动（第 6.1 节）并打开废液泵。
   2. 通过灌注系统应用加臭剂溶液：关闭 1x ND96 缓冲液（第 6.1 节）并将加臭剂溶液流动 10 秒。然后记录峰值。要获得 OR 对测试加臭剂的响应，请从峰值中减去基线值。
   3. 停止加臭剂溶液的流动并切换到 1x ND96 缓冲液（第 6.1 节）。使用缓冲液洗涤卵母细胞，直到电流迹线从之前的气味刺激中恢复。然后卵母细胞准备好接受另一种加臭剂溶液的刺激。通常，一个卵母细胞可用于检测 20-30 种化学刺激。
      注：在测试浓度依赖性响应时，应始终先应用最低浓度，然后再进行较高浓度测试。

结果

使用单感器记录 （SSR） 技术，我们最近确定了被认为对埃及 Ae. aegypti 宿主寻找行为很重要的人类气味⁸。然而，驱动埃及 Ae. aegypti 外周感觉系统中感知人类气味过程的分子机制仍然未知。OR 在大多数昆虫的气味配体检测中起着重要作用 10,11,12。为了执行其功能，每个 OR...

讨论

TEVC 是一种广泛用于检查膜受体功能的经典技术。尽管已经发布了与此处介绍的程序非常相似的详细方案⁴³ ，但此处提出的方法引入了一些重要的修改。例如，在这里，将 OR 和 Orco 的 cRNA 在合成后立即预混合并等分到小体积样品中，并储存在 -80 °C 直至使用，而不是在注射前立即将它们分别混合在封口膜上⁴³。而且，在收获卵母细胞后?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	CytoOne	CC7682-7524	Used for oocyte culture
African clawed frog	Nasco	LM00535	Used to harvest Xenopus oocytes
Ag/AgCl wire electrode	Warner Instruments	64-1282	Used for microelectrodes
Clampex 10.3	Axon	N.A.	Used for signal recording
Clampfit 10.3	Axon Instruments Inc.	N.A.	Used for data analysis
Collagenase B	Sigma	11088815001	Used for oocyte digestion
Digidata Digitizer	Axon CNS	Digidata 1440A	Used for data acquisition
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kit	Omega	D6942-01	Used for plasmid preparation
Ethyl-M-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	886-86-2	Used for anesthetizing frogs
Glass capillary	FHC	30-30-1	Used for microinjection
Glass capillary	Warner Instruments	64-0801	Used for preparing microelectrodes
GyroMini Nutating Mixer	Labnet	S0500	Used for oocyte digestion
Insect Growth Chambers	Caron Products	model 6025	Used for oocyte incubation
Leica Microscope	Leica	S6 D	Used for cutting mosquito antennae
Light Source	Schott	A20500	Providing light sources for observation
Magnetic stand	Narishige	GJ-1	Used to hold the reference electrode
Micromanipulator	Leica	115378	Used for minor movement of electrode
Micropipe puller	Sutter	model P-97	Used to pull capillaries
Micropipette beveler	Sutter	model BV-10	Used to sharpen capillaries
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Invitrogen	AM1344	Used for synthesizing cRNA
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond	3-000-204	Used for microinjection
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18091050	Used for synthesizing cDNA
Olympus Microscope	Olympus	SZ61	Used for microinjection
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells	Invitrogen	C404003	Used for transformation
Oocyte clamp amplifier	Warner Instruments	model OC-725C	Used for TEVC recording
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704	Used for gel purification
TMC Vibration Isolation Table	TMC	63-500	Used for isolating the vibration from the equipment
TURBO DNA-free kit	Invitrogen	AM1907	Used to remove DNase and other ions in RNA