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Resumo

É apresentado um protocolo que caracteriza funcionalmente as salas de cirurgia de mosquitos em resposta a odores humanos usando um sistema de expressão de oócitos Xenopus acoplado a uma pinça de tensão de dois eletrodos, fornecendo uma nova técnica poderosa para explorar as respostas das salas de cirurgia de mosquitos à exposição a odores humanos.

Resumo

O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), vetor de muitas doenças humanas importantes, incluindo febre amarela, dengue e febre Zika, mostra uma forte preferência por hospedeiros humanos em relação a outros animais de sangue quente para refeições de sangue. As pistas olfativas desempenham um papel crítico para os mosquitos enquanto exploram seu ambiente e procuram um hospedeiro humano para obter refeições de sangue, transmitindo doenças humanas. Sabe-se que os receptores de odor (ORs) expressos nos neurônios sensoriais olfativos são responsáveis pela interação dos mosquitos vetores com os odores humanos. Para obter insights mais profundos sobre a fisiologia olfativa do Ae. aegypti e investigar suas interações com humanos em nível molecular, usamos um protocolo otimizado de expressão heteróloga de oócitos de Xenopus para analisar funcionalmente os receptores de odor de Ae. aegypti em resposta a odores humanos. Três exemplos de experimentos são apresentados: 1) Clonagem e síntese de cRNAs de ORs e co-receptor de receptor de odor (Orco) de antenas de Ae. aegypti com quatro a seis dias de idade; 2) Microinjeção e expressão de ORs e Orco em oócitos de Xenopus ; e 3) Registro de corrente de célula inteira de oócitos de Xenopus expressando ORs de mosquito / Orco com um grampo de voltagem de dois eletrodos. Esses procedimentos otimizados fornecem uma nova maneira para os pesquisadores investigarem a recepção do odor humano em mosquitos Aedes e revelarem os mecanismos subjacentes que governam sua atividade de busca de hospedeiros em nível molecular.

Introdução

O mosquito da febre amarela Ae. aegypti pode transmitir muitas doenças mortais, incluindo febre amarela, dengue e febre Zika, causando tremenda angústia e perda de vidas. Os mosquitos fazem uso de vários sinais, como CO2, odor da pele e calor do corpo para localizar seus hospedeiros1. Dado que tanto os humanos quanto outros animais de sangue quente produzem CO2 e têm temperaturas corporais semelhantes, parece provável que as fêmeas de Ae. aegypti dependam principalmente do odor da pele para discriminação do hospedeiro2. Isso cria um quadro complexo, no entanto, com um estudo inicial isolando mais de 300 compostos das emanações da pele humana3. Outros ensaios comportamentais indicaram que vários desses compostos evocam respostas comportamentais em Ae. aegypti 4,5,6,7, mas precisamente como esses compostos são detectados pelo mosquito permanece em grande parte desconhecido. Pesquisas recentes de nosso grupo identificaram vários odores humanos que podem estar envolvidos na atividade de busca de hospedeiros do Ae. aegypti, embora seus papéis ainda não tenham sido confirmados por outros ensaios comportamentais8. Como esses odores humanos essenciais são decodificados no sistema sensorial periférico do Ae. aegypti ainda não foi estabelecido.

Os insetos detectam odores através da sensila quimiossensorial em seus apêndices olfativos. Dentro de cada uma das sensilas, diferentes receptores olfativos, incluindo receptores de odor (ORs), receptores ionotrópicos (IRs) e receptores gustativos (GRs), são expressos na membrana dos neurônios sensoriais olfatórios9. Esses ORs são responsáveis por detectar muitos odores encontrados pelos insetos, especialmente os odores associados a alimentos, hospedeiros e parceiros de acasalamento 10,11,12,13. Um estudo anterior com foco na desorfanização da função de ORs em Anopheles gambiae usando o sistema de expressão Xenopus acoplado a uma pinça de tensão de dois eletrodos descobriu que os ORs de Anopheles são especificamente sintonizados com os aromáticos que são os principais componentes nas emanações humanas14. Um estudo genômico recente identificou até 117 genes OR em Ae. aegypti15. Consequentemente, uma maneira de abordar sistematicamente as funções desses Aedes ORs em resposta a odores biológica ou ecologicamente importantes, como odores humanos ou estímulos de oviposição, forneceria informações úteis para aqueles que buscam entender melhor a ecologia química ou neuroetologia de Ae. aegypti.

A técnica de grampo de tensão de dois eletrodos (TEVC) foi originalmente desenvolvida para examinar a função dos canais de íons de membrana em meados da década de 199016,17. Desde então, o TEVC tem sido usado para investigar ORs de várias espécies diferentes de insetos 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Este exame funcional de ORs contribuiu substancialmente para responder a importantes questões ecológicas em insetos, incluindo: 1) Como os insetos localizam fontes de alimento? 2) Como eles são atraídos pelos feromônios sexuais voláteis liberados por seus parceiros de acasalamento? 3) Como eles encontram um local de oviposição perfeito para seus filhotes? e 4) Existem compostos, derivados de plantas ou sintéticos, que podem proteger eficientemente os humanos de insetos que picam? As respostas a essas perguntas são cruciais para controlar vetores de doenças importantes, como os mosquitos.

Várias outras abordagens, incluindo aquelas baseadas na linha celular renal embrionária humana 293 (HEK293), o sistema de neurônios vazios de Drosophila, nuclease dedo de zinco, nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição e o sistema de edição de genes CRISPR / Cas9, também foram usados em estudos funcionais de sala de cirurgia12 , 20 , 35 , 36 , 37. No entanto, todas essas técnicas exigem as habilidades de um biólogo molecular experiente e envolvem vários fatores potencialmente confusos. A expressão de TEVC/oócitos é capaz de medir diretamente as correntes de receptores evocadas por odor e a condutância iônica e tem a vantagem adicional do tempo de configuração rápido e rápido necessário para expressar receptores de cRNA. Neste estudo, portanto, usamos TEVC para examinar as respostas de um Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) contra vários odores com potencial relevância biológica, revelando que os oócitos expressos com AaegOR55•AaegOrco mostraram uma resposta dose-dependente ao odorante humano benzaldeído.

Protocolo

O protocolo para este procedimento, o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, é aprovado e monitorado (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Auburn: protocolo aprovado # 2016-2987).

NOTA: A síntese de genes personalizados é uma alternativa viável à clonagem de genes OR de mosquitos.

1. Coleta de mosquitos e apêndices olfatórios (antenas)

  1. Manter mosquitos Ae. aegypti (obtidos do Dr. James Becnel, USDA, ARS, Unidade de Pesquisa de Mosquitos e Moscas) a 25 ± 2°C e um fotoperíodo de 12: 12 (L:D) h (luzes acesas às 8h).
  2. Anestesiar ~ 800 mosquitos fêmeas de 4-6 dias sem alimentação de sangue usando CO2. Corte as antenas do mosquito (tecidos olfatórios) ao microscópio (40x) usando uma tesoura e colete em um tubo de centrífuga de 1,5 mL mantido em gelo seco.
    NOTA: As antenas coletadas podem ser armazenadas em um freezer a -80 °C ou ser usadas imediatamente.

2. Clonagem de OR de antenas de Ae. aegypti

  1. Extraia o RNA total das antenas usando um kit de RNA total disponível comercialmente seguindo o protocolo do fabricante.
  2. Digerir o RNA total usando o kit comercial livre de DNA para remover DNase e outros íons seguindo o protocolo do fabricante.
  3. Sintetize cDNA a partir de 1,5 μg de RNA livre de DNA usando o Sistema de Síntese de Primeira Fita SuperScript IV com Oligo d (T) 2013,30.
  4. Projete primers de PCR para os genes OR de acordo com as sequências disponíveis no VectorBase (https://www.vectorbase.org/) e os requisitos especiais do local de corte da enzima. Adicione uma sequência de Kozak (GCCACC), que inicia a tradução na maioria dos organismos eucarióticos, entre o local de corte e o códon inicial em cada primer direto30.
  5. Clonar as sequências codificantes dos genes OR por PCR usando primers específicos do gene contendo locais de endonuclease de restrição e a sequência Kozak seguindo o protocolo do fabricante.
  6. Detecte produtos de PCR através de um gel de agarose a 1% e purifique usando um kit comercial de extração de gel seguindo o protocolo do fabricante.
  7. Realizar a construção de plasmídeo recombinante por meio da clonagem de produtos de PCR em um vetor pT7Ts após digestão por enzimas de restrição seguindo o protocolo do fabricante.
  8. Verifique os plasmídeos recombinantes por sequenciamento Sanger e confirme usando o banco de dados VectorBase.

3. Síntese de cRNA

  1. Linearizar os plasmídeos construídos com enzima(s) de restrição específica(s).
    NOTA: O DNA do plasmídeo deve ser linearizado com uma enzima de restrição a jusante do gene a ser transcrito.
  2. Use os plasmídeos linearizados para sintetizar cRNAs com um kit T7 comercial seguindo uma descrição anterior13,30.
  3. Pré-misture o cRNA de OR e Orco (1:1) em um tubo de centrífuga e aliquote o cRNA misturado em um volume de 2 μL (250 ng/μL/cada) para cada tubo de PCR. Conservar o ARNc aliquotado a -80 °C antes da utilização.

4. Coleção de oócitos Xenopus

NOTA: O procedimento segue as instruções de Schneider et al.38.

  1. Anestesiar Xenopus laevis por 20-30 min em 1 L de água ultrapurificada com 1 g de sal de metanossulfonato de m-aminobenzoato de etila (Figura 1A). Aperte um dos dedos do sapo usando os dedos; Se não houver resposta, o sapo está suficientemente anestesiado e pronto para a cirurgia. Transfira o sapo anestesiado para o leito de gelo.
  2. A cirurgia
    1. Esfregue a área ventral da rã com solução de iodopovidona a 10% e limpe a solução com bolas de algodão limpas. Repita esta etapa 2 vezes.
    2. Faça uma pequena incisão abdominal (10-15 mm, Figura 1B) com um bisturi descartável. Penetre na pele, camada fáscia-músculo separadamente. A incisão é na parte inferior do abdômen, lateral à linha média.
      NOTA: Não machuque os órgãos internos.
    3. Segure partes dos lobos ovarianos com uma pinça e puxe para o exterior suavemente. Levante o ovário e corte-o ao nível da parede do corpo com uma tesoura. Repita várias vezes até obter materiais ovarianos suficientes (~ 200 óvulos, Figura 1C). Transfira os materiais ovarianos para o tampão de lavagem (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2•6H2O, 5 mM HEPES sal de sódio, 10 μg/mL de gentamicina, pH 7,6).
    4. Feche as feridas da cirurgia (músculos e pele) com suturas absorvíveis que normalmente se degradam e caem naturalmente em 10 a 14 dias.
    5. Após cada cirurgia, coloque o sapo em 1 L de solução de recuperação (contendo 3,4 g de sal de conserva e decapagem e 2 g de sal marinho oceânico instantâneo) até que acorde e depois devolva-o à instalação do sapo.
      NOTA: Até 4 cirurgias podem ser realizadas em cada rã. O intervalo de operação de cada rã deve ser superior a 2 meses.
  3. Digestão enzimática desfoliculada e cultura de oócitos
    1. Separe os oócitos (~ 200 óvulos, Figura 1C) em pequenos pedaços.
    2. Transfira todos os oócitos para uma solução de digestão, incluindo 10 mL de tampão de lavagem (Seção 4.2.3) e 2 mg / mL de colagenase B por 40-60 min em temperatura ambiente para remover as camadas de células foliculares. Examine as amostras ao microscópio para determinar se 80% dos oócitos foram totalmente desfoliculados; Caso contrário, verifique a cada 10 minutos até que a maioria dos oócitos esteja pronta.
    3. Enxágue os oócitos com 1x solução de Ringer (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2 · 6H2O, 5 mM de sal de sódio HEPES, pH 7,6), tampão de lavagem (Seção 4.2.3), solução salina de Barth modificada (78 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,33 mM Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 mM CaCl2·2H2O, 0,82 mM MgSO4 · 7H2O, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM de sal de sódio HEPES, 1,8 mM de piruvato de sódio, 10 μg / mL de gentamicina, 10 μg / mL de estreptomicina, pH 7,6) em sequência (5 vezes para cada tampão, usando 10 mL de cada vez). Enxaguar os oócitos extensivamente com tampões para remover oócitos imaturos e de baixa qualidade.
    4. Colher oócitos no estágio V-VI de acordo com a classificação de Dumont. Transfira oócitos saudáveis/de boa qualidade no estágio V-VI com uma divisão clara branca/escura e sem danos visualmente óbvios (Figura 1D) para uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm contendo solução salina de Barth modificada (Seção 4.3.3). Descarte os oócitos de má qualidade (Figura 1E). Manter os ovócitos digeridos em câmaras de crescimento de insetos a 18 °C durante cerca de 24 horas antes da microinjeção.

5. Microinjeção de cRNA e expressão de receptores de odor (ORs) e co-receptores de OR (Orco) em oócitos de Xenopus

  1. Colocar uma matriz metálica na placa de Petri de 100 mm x 15 mm, adicionando solução salina de Barth modificada (Secção 4.3.3) até que a matriz esteja submersa. Transfira os oócitos na matriz e descarte os oócitos que não atingirem o tamanho. Disponha os oócitos com os pólos vegetais na parte superior (Figura 1F).
  2. Puxe um capilar de vidro novo (1.0 mm OD x 0.5 mm ID, comprimento = 100 mm) para cada sample usando um extrator de microtubos (Calor = 525, Tração = 50, Velocidade = 50, Tempo = 250) e afie com um chanfrador de micropipeta em um ângulo de 25°. Monte o tubo capilar no injetor de nanolitros.
  3. Antes da injeção, remova um tubo de cRNAs pré-misturados de OR e Orco (Seção 3.3) do freezer e coloque-o no gelo até que esteja completamente dissolvido. Encha o tubo capilar com a mistura OR/Orco pressionando o botão Fill do injetor de nanolitros.
  4. Injete 10 ng (5ng OR + 5ng Orco; ~ 20 nL) do cRNA pré-misturado para cada oócito com um injetor de nanolitro em uma estação livre de RNAse. (Figura 1F).
    NOTA: Antes da injeção, pressionamos o botão VAZIO para descarregar a pequena mistura para garantir que o tubo capilar não esteja bloqueado. Aguarde cerca de 5 segundos para permitir que os cRNAs entrem totalmente no oócito.
  5. Após a injeção, armazene os oócitos em uma placa de cultura de células estéril de 24 poços com solução salina de Barth modificada a 18 ° C por 3-7 dias antes do registro de células inteiras.

6. Registro de corrente de célula inteira usando um sistema de grampo de tensão de dois eletrodos (Figura 2)

  1. Antes do registro de grampo de tensão de dois eletrodos, dissolva os compostos odorantes individuais em dimetilsulfóxido (DMSO) para obter uma série de soluções de estoque (100 μg / μL). Dilua essas soluções estoque com 1x tampão ND96 (91 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2 · 2H2O, 2 mM MgCl2 · 6H2O, 5 mM HEPES sal de sódio, pH 7,6) 1000 vezes para obter um conjunto de soluções de trabalho (0,1 μg / μL).
  2. Certifique-se de que tudo na mesa de isolamento de vibração TMC, incluindo a blindagem de metal, microscópio, fonte de luz e bomba de resíduos, esteja cuidadosamente aterrado para reduzir o efeito do ruído elétrico externo na gravação do sinal de toda a célula.
  3. Prepare microeletrodos puxando um capilar de vidro (1.20 mm OD x 0.94 mm ID, comprimento = 750 mm) usando um extrator de microtubos (Calor = 525, Tração = 50, Velocidade = 50, Tempo = 250). Encha os capilares com 3 M KCl. Cloridize os fios Ag / AgCl por 2-5 min em alvejante a 10% de cloro até que fiquem com uma cor cinza escura (os fios Ag / AgCl cinza claro precisam ser clordados).
  4. Ligue a máquina ligando o Oocyte Clamp e o Digidata Digitizer (Figura 3A). Abra o software (por exemplo, Clampex 10.3) e clique no botão Gravar . Ligue o interruptor para o buffer 1x ND96 (Seção 6.1) e a bomba para o buffer de resíduos.
  5. Realize um pré-teste inserindo microeletrodos no tampão de fluxo e, em seguida, pressionando o botão Vm Electrode Test e o botão Ve Electrode Test para verificar a resistência dos microeletrodos. Vm deve ser < 40 mV e Ve deve ser < 40 μA. Desligue o fluxo do tampão 1x ND96 (Seção 6.1) e a bomba de resíduos após o pré-teste.
  6. Coloque cada oócito na câmara de perfusão (Figura 2) preenchida com 1x tampão ND96 (Seção 6.1) e posicione suavemente os oócitos com os pólos vegetais voltados para cima pela lagarta de vidro. Insira os eletrodos lentamente no oócito (Figura 3B). Ajuste o parâmetro Vm para 0 e, em seguida, o parâmetro Ve para 0. Altere o botão Clamp de OFF para FAST. Ajuste o botão Ganho para ~ -80 mV.
  7. Verifique o valor de Ve, que deve ser constante. Caso contrário, há um vazamento em pelo menos um dos dois microeletrodos. Se isso acontecer, substitua todos os componentes defeituosos por novos capilares.
  8. Registre as correntes de células inteiras dos oócitos injetados com uma pinça de oócito com um potencial de retenção de ~ −80 mV (Figura 2).
  9. Realizar aquisição e análise de dados.
    1. Retome o fluxo do buffer 1x ND96 (Seção 6.1) e ligue a bomba de resíduos.
    2. Aplicação de solução odorífera através do sistema de perfusão: desligue o tampão 1x ND96 (Seção 6.1) e flua a solução odorante por 10 segundos. Em seguida, registre o valor de pico. Para obter a resposta da sala cirúrgica ao odor de teste, subtraia o valor basal do valor de pico.
    3. Pare o fluxo da solução odorante e mude para o tampão 1x ND96 (Seção 6.1). Lave o oócito usando o tampão até que o traço de corrente se recupere da estimulação anterior do odor. O oócito está então pronto para estimulação por outra solução odorífera. Geralmente, um oócito pode ser usado para detectar 20-30 estímulos químicos.
      NOTA: Ao testar a resposta dependente da concentração, a concentração mais baixa deve sempre ser aplicada antes de passar para as concentrações mais altas.

Resultados

Usando a técnica de registro de sensillum único (SSR), recentemente identificamos odores humanos considerados importantes para o comportamento de busca de hospedeiros de Ae. aegypti 8. No entanto, o mecanismo molecular que impulsiona o processo de detecção de odores humanos no sistema sensorial periférico do Ae. aegypti permanece desconhecido. Os ORs desempenham um papel importante na detecção de ligantes odoríferos na maioria dos insetos...

Discussão

O TEVC é uma técnica clássica amplamente utilizada para examinar a função dos receptores de membrana. Embora já tenha sido publicado um protocolo detalhado43 que compartilha considerável semelhança com o procedimento aqui apresentado, o método aqui proposto introduz algumas modificações importantes. Por exemplo, aqui, o cRNA de OR e Orco é pré-misturado e aliquotado em amostras de pequeno volume imediatamente após a síntese e armazenado a -80 ° C a...

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado por um prêmio da Estação Experimental Agrícola do Alabama (AAES) Multistate / Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 e ALA015-1-16009 para NL

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well cell culture plateCytoOneCC7682-7524Used for oocyte culture
African clawed frogNascoLM00535Used to harvest Xenopus oocytes
Ag/AgCl wire electrodeWarner Instruments64-1282Used for microelectrodes
Clampex 10.3AxonN.A.Used for signal recording
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.N.A.Used for data analysis
Collagenase BSigma11088815001Used for oocyte digestion
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440AUsed for data acquisition
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kitOmegaD6942-01Used for plasmid preparation
Ethyl-M-aminobenzoate methanesulfonate saltSigma886-86-2Used for anesthetizing frogs
Glass capillaryFHC30-30-1Used for microinjection
Glass capillaryWarner Instruments64-0801Used for preparing microelectrodes
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500Used for oocyte digestion
Insect Growth ChambersCaron Productsmodel 6025Used for oocyte incubation
Leica MicroscopeLeicaS6 DUsed for cutting mosquito antennae
Light SourceSchottA20500Providing light sources for observation
Magnetic standNarishigeGJ-1Used to hold the reference electrode
MicromanipulatorLeica115378Used for minor movement of electrode
Micropipe pullerSuttermodel P-97Used to pull capillaries
Micropipette bevelerSuttermodel BV-10Used to sharpen capillaries
mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344Used for synthesizing cRNA
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond3-000-204Used for microinjection
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18091050Used for synthesizing cDNA
Olympus MicroscopeOlympusSZ61Used for microinjection
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cellsInvitrogenC404003Used for transformation
Oocyte clamp amplifierWarner Instrumentsmodel OC-725CUsed for TEVC recording
QIAquick gel extraction kitQiagen28704Used for gel purification
TMC Vibration Isolation TableTMC63-500Used for isolating the vibration from the equipment
TURBO DNA-free kitInvitrogenAM1907Used to remove DNase and other ions in RNA

Referências

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