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Résumé

Un protocole est présenté qui caractérise fonctionnellement les ROR de moustiques en réponse aux odeurs humaines à l’aide d’un système d’expression d’ovocytes de xénope couplé à une pince de tension à deux électrodes, fournissant une nouvelle technique puissante pour explorer les réponses des RO de moustiques à l’exposition aux odeurs humaines.

Résumé

Le moustique Aedes aegypti (Linnaeus), vecteur de nombreuses maladies humaines importantes, notamment la fièvre jaune, la dengue et la fièvre Zika, montre une forte préférence pour les hôtes humains par rapport à d’autres animaux à sang chaud pour les repas de sang. Les signaux olfactifs jouent un rôle essentiel pour les moustiques lorsqu’ils explorent leur environnement et recherchent un hôte humain pour obtenir des repas de sang, transmettant ainsi des maladies humaines. Les récepteurs odorants (OR) exprimés dans les neurones sensoriels olfactifs sont connus pour être responsables de l’interaction des moustiques vecteurs avec les odeurs humaines. Pour mieux comprendre la physiologie olfactive d’Ae. aegypti et étudier leurs interactions avec les humains au niveau moléculaire, nous avons utilisé un protocole optimisé d’expression hétérologue des ovocytes de xénope pour analyser fonctionnellement les récepteurs odorants d’Ae . aegypti en réponse aux odeurs humaines. Trois exemples d’expériences sont présentés : 1) clonage et synthèse d’ARNc de RO et de co-récepteur odorant (Orco) à partir d’antennes d’Ae. aegypti âgées de quatre à six jours ; 2) Micro-injection et expression des ORs et d’Orco dans les ovocytes de Xénope ; et 3) l’enregistrement du courant de cellules entières à partir d’ovocytes de xénope exprimant des OR/Orco de moustiques avec une pince de tension à deux électrodes. Ces procédures optimisées offrent aux chercheurs une nouvelle façon d’étudier la réception des odeurs humaines chez les moustiques Aedes et de révéler les mécanismes sous-jacents régissant leur activité de recherche d’hôte au niveau moléculaire.

Introduction

Le moustique de la fièvre jaune Ae. aegypti peut transmettre de nombreuses maladies mortelles, notamment la fièvre jaune, la dengue et la fièvre Zika, causant une détresse énorme et des pertes de vie. Les moustiques utilisent plusieurs indices tels que le CO2, l’odeur de la peau et la chaleur corporelle pour localiser leurs hôtes1. Étant donné que les humains et d’autres animaux à sang chaud produisent du CO2 et ont des températures corporelles similaires, il semble probable que les femelles Ae. aegypti dépendent principalement de l’odeur de la peau pour la discrimination de l’hôte2. Cela crée cependant une image complexe, avec une étude précoce isolant plus de 300 composés à partir des émanations de la peau humaine3. D’autres tests comportementaux ont indiqué qu’un certain nombre de ces composés évoquent des réponses comportementales chez Ae. aegypti4, 5, 6, 7, mais la façon précise dont ces composés sont détectés par le moustique reste largement inconnue. Des recherches récentes menées par notre groupe ont identifié plusieurs odorants humains qui pourraient être impliqués dans l’activité de recherche d’hôte d’Ae. aegypti, bien que leurs rôles n’aient pas encore été confirmés par d’autres tests comportementaux8. La façon dont ces odorants humains essentiels sont décodés dans le système sensoriel périphérique d’Ae. aegypti n’a pas encore été établie.

Les insectes détectent les odorants grâce à la sensille chimiosensorielle de leurs appendices olfactifs. À l’intérieur de chacune des sensilles, différents récepteurs olfactifs, y compris les récepteurs odorants (OR), les récepteurs ionotropiques (IR) et les récepteurs gustatifs (GR), sont exprimés sur la membrane des neurones sensoriels olfactifs9. Ces RO sont responsables de la détection de nombreux odorants rencontrés par les insectes, en particulier les odeurs associées à la nourriture, aux hôtes et aux partenaires d’accouplement 10,11,12,13. Une étude antérieure portant sur la désorphanisation de la fonction des OR chez Anopheles gambiae à l’aide du système d’expression Xenopus couplé à une pince de tension à deux électrodes a révélé que les OR d’Anopheles sont spécifiquement réglés sur les aromatiques qui sont les principaux composants des émanations humaines14. Une étude génomique récente a identifié jusqu’à 117 gènes OR chez Ae. aegypti15. Par conséquent, un moyen d’aborder systématiquement les fonctions de ces OR Aedes en réponse à des odorants biologiquement ou écologiquement importants tels que les odeurs humaines ou les stimuli de ponte fournirait des informations utiles à ceux qui cherchent à mieux comprendre l’écologie chimique ou la neuroéthologie d’Ae. aegypti.

La technique de la pince de tension à deux électrodes (TEVC) a été développée à l’origine pour examiner la fonction des canaux ioniques membranaires au milieu des années1990 16,17. Depuis lors, le TEVC a été utilisé pour étudier les RUP d’un certain nombre d’espèces d’insectes différentes 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Cet examen fonctionnel des RUP a contribué de manière substantielle à répondre à d’importantes questions écologiques chez les insectes, notamment : 1) Comment les insectes trouvent-ils les sources de nourriture ? 2) Comment sont-ils attirés par les phéromones sexuelles volatiles libérées par leurs partenaires d’accouplement ? 3) Comment trouvent-ils un site de ponte parfait pour leur progéniture ? et 4) Existe-t-il des composés, d’origine végétale ou synthétique, qui peuvent protéger efficacement les humains contre les insectes piqueurs ? Les réponses à ces questions sont cruciales pour lutter contre d’importants vecteurs de maladies tels que les moustiques.

Un certain nombre d’autres approches, y compris celles basées sur la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine 293 (HEK293), le système de neurones vides de la drosophile, la nucléase à doigts de zinc, la nucléase effectrice de type activateur de transcription et le système d’édition de gènes CRISPR/Cas9, ont également été utilisées dans des études fonctionnelles de RO 12,20,35,36,37. Cependant, ces techniques nécessitent toutes les compétences d’un biologiste moléculaire expérimenté et impliquent de multiples facteurs de confusion potentiels. L’expression TEVC/ovocytes est capable de mesurer directement les courants récepteurs évoqués par les odeurs et la conductance ionique et présente l’avantage supplémentaire du temps de configuration rapide et rapide nécessaire pour exprimer les récepteurs à partir de l’ARNc. Dans cette étude, nous avons donc utilisé TEVC pour examiner les réponses d’un Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) contre plusieurs odorants ayant une pertinence biologique potentielle, révélant que les ovocytes exprimés avec AaegOR55•AaegOrco ont montré une réponse dose-dépendante à l’odorant humain benzaldéhyde.

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Protocole

Le protocole de cette procédure, le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, est approuvé et surveillé (Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Auburn : protocole approuvé # 2016-2987).

REMARQUE : La synthèse de gènes personnalisée est une alternative viable au clonage pour les gènes de moustique OU .

1. Collection de moustiques et d’appendices olfactifs (antennes)

  1. Maintenir les moustiques Ae. aegypti (obtenus auprès du Dr James Becnel, USDA, ARS, Mosquito and Fly Research Unit) à 25 ± 2°C et une photopériode de 12:12 (L :D) h (lumières allumées à 8 h).
  2. Anesthésie ~800 moustiques femelles de 4 à 6 jours sans alimentation sanguine à l’aide de CO2. Coupez les antennes des moustiques (tissus olfactifs) au microscope (40x) à l’aide d’une paire de ciseaux et prélevez dans un tube à centrifuger de 1,5 mL maintenu sur de la glace sèche.
    REMARQUE : Les antennes collectées peuvent être stockées dans un congélateur à -80 °C ou être utilisées immédiatement.

2. OU Clonage à partir d’antennes d’Ae. aegypti

  1. Extraire l’ARN total des antennes à l’aide d’un kit d’ARN total disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant.
  2. Digérer l’ARN total à l’aide du kit commercial sans ADN afin d’éliminer la DNase et les autres ions en suivant le protocole du fabricant.
  3. Synthétisez de l’ADNc à partir de 1,5 μg d’ARN libre d’ADN à l’aide du système de synthèse du premier brinSuperScript IV amorcé par l’Oligo d(T)20 13,30.
  4. Concevez des amorces PCR pour les gènes OR en fonction des séquences disponibles chez VectorBase (https://www.vectorbase.org/) et des exigences particulières du site de coupe de l’enzyme. Ajouter une séquence de Kozak (GCCACC), qui initie la traduction chez la plupart des organismes eucaryotes, entre le site de coupe et le codon de départ dans chaque amorce30.
  5. Cloner les séquences codantes des gènes OR par PCR à l’aide d’amorces spécifiques au gène contenant des sites d’endonucléase de restriction et la séquence de Kozak en suivant le protocole du fabricant.
  6. Détectez les produits PCR à l’aide d’un gel d’agarose à 1 % et purifiez-les à l’aide d’un kit d’extraction de gel commercial en suivant le protocole du fabricant.
  7. Effectuer la construction de plasmides recombinants par clonage de produits PCR dans un vecteur pT7Ts après digestion par des enzymes de restriction selon le protocole du fabricant.
  8. Vérifiez les plasmides recombinants par séquençage de Sanger et confirmez à l’aide de la base de données VectorBase.

3. Synthèse de l’ARNc

  1. Linéariser les plasmides construits avec une ou plusieurs enzymes de restriction spécifiques.
    REMARQUE : L’ADN plasmidique doit être linéarisé à l’aide d’une enzyme de restriction en aval du gène à transcrire.
  2. Utilisez les plasmides linéarisés pour synthétiser des ARNc avec un kit T7 commercial suivant une description précédente13,30.
  3. Prémélanger l’ARNc d’OR et d’Orco (1:1) dans un tube à centrifuger et aliquote l’ARNc mélangé dans un volume de 2 μL (250 ng/μL/chacun) pour chaque tube PCR. Conservez l’ARNc aliquote à -80 °C avant utilisation.

4. Collection d’ovocytes de xénope

REMARQUE : La procédure suit les instructions de Schneider et al.38.

  1. Anesthésier Xenopus laevis pendant 20 à 30 minutes dans 1 L d’eau ultra-purifiée avec 1 g de sel de méthanesulfonate d’éthyle m-aminobenzoate (Figure 1A). Pincez l’un des orteils de la grenouille à l’aide des doigts ; S’il n’y a pas de réponse, la grenouille est suffisamment anesthésiée et prête pour la chirurgie. Transférez la grenouille anesthésiée sur le lit de glace.
  2. La chirurgie
    1. Frottez la zone ventrale de la grenouille avec une solution de povidone iodée à 10 % et essuyez la solution avec des boules de coton propres. Répétez cette étape 2 fois.
    2. Faites une petite incision abdominale (10-15 mm, Figure 1B) avec un scalpel jetable. Pénètre séparément dans la peau, la couche fascia-musculaire. L’incision se trouve dans la partie inférieure de l’abdomen, latéralement à la ligne médiane.
      REMARQUE : Ne blessez pas les organes internes.
    3. Saisissez des parties des lobes ovariens avec une pince et tirez doucement vers l’extérieur. Soulevez l’ovaire et coupez-le au niveau de la paroi du corps avec des ciseaux. Répétez l’opération plusieurs fois jusqu’à ce que vous obteniez suffisamment de matériel ovarien (~200 ovules, figure 1C). Transvaser les matières ovariennes dans un tampon de lavage (96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 5 mM de MgCl2•6H,2O, 5 mM de sel de sodium HEPES, 10 μg/mL de gentamycine, pH de 7,6).
    4. Fermez les plaies chirurgicales (à la fois musculaires et cutanées) avec des sutures résorbables qui se dégradent et tombent naturellement en 10 à 14 jours.
    5. Après chaque intervention chirurgicale, placez la grenouille dans 1 L de solution de récupération (contenant 3,4 g de sel de mise en conserve et de décapage et 2 g de sel de mer instantané) jusqu’à ce qu’elle se réveille, puis retournez-la à l’installation de grenouilles.
      REMARQUE : Jusqu’à 4 chirurgies peuvent être effectuées sur chaque grenouille. L’intervalle d’opération de chaque grenouille doit être supérieur à 2 mois.
  3. Digestion enzymatique défolliculée et culture d’ovocytes
    1. Séparez les ovocytes (~200 ovules, Figure 1C) en petits morceaux.
    2. Transvasez tous les ovocytes dans une solution de digestion, y compris 10 ml de tampon de lavage (section 4.2.3) et 2 mg/ml de collagénase B pendant 40 à 60 minutes à température ambiante afin d’éliminer les couches de cellules folliculaires. Examinez les échantillons au microscope pour déterminer si 80 % des ovocytes ont été complètement défolliculés ; Si ce n’est pas le cas, vérifiez toutes les 10 minutes jusqu’à ce que la plupart des ovocytes soient prêts.
    3. Rincer les ovocytes avec 1 solution de Ringer (96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 5 mM de MgCl2·6H2O, 5 mM de sel de sodium HEPES, pH 7,6), de tampon de lavage (Section 4.2.3), de solution saline de Barth modifiée (78 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,33 mM de Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 mM de CaCl2·2H2O, 0,82 mM de MgSO4·7H2O, 2,4 mM de NaHCO3, 10 mM de sel de sodium HEPES, 1,8 mM de pyruvate de sodium, 10 μg/mL de gentamycine, 10 μg/mL de streptomycine, pH 7,6) en séquence (5 fois pour chaque tampon, en utilisant 10 mL à chaque fois). Rincer abondamment les ovocytes avec des tampons pour éliminer les ovocytes immatures et de mauvaise qualité.
    4. Récolte des ovocytes aux stades V à VI selon la classification de Dumont. Transférez les ovocytes sains/de bonne qualité aux stades V-VI avec une division blanche/foncée claire et sans dommages visuellement évidents (figure 1D) dans une boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm contenant du sérum de Barth modifié (section 4.3.3). Jetez les ovocytes de mauvaise qualité (Figure 1E). Maintenir les ovocytes digérés dans les chambres de croissance des insectes à 18 °C pendant environ 24 heures avant la micro-injection.

5. Microinjection d’ARNc et expression des récepteurs odorants (OR) et des corécepteurs OR (Orco) dans les ovocytes de xénope

  1. Placez une matrice métallique dans la boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm, en ajoutant du sérum physiologique de Barth modifié (section 4.3.3) jusqu’à ce que la matrice soit immergée. Transférez les ovocytes sur la matrice et jetez les ovocytes qui n’atteignent pas la taille. Disposez les ovocytes avec les pôles végétaux sur la face supérieure (Figure 1F).
  2. Tirez un capillaire en verre frais (1,0 mm de diamètre extérieur x 0,5 mm de diamètre intérieur, longueur = 100 mm) pour chaque échantillon à l’aide d’un extracteur de microtubes (chaleur = 525, traction = 50, vitesse = 50, temps = 250) et affûtez avec une biseaute à micropipette à un angle de 25°. Montez le tube capillaire sur l’injecteur de nanolitre.
  3. Avant l’injection, retirez du congélateur un tube d’ARNc prémélangé d’OR et d’Orco (section 3.3) et placez-le sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous. Remplissez le tube capillaire avec le mélange OR/Orco en appuyant sur le bouton Fill de l’injecteur de nanolitres.
  4. Injectez 10 ng (5 ng OR + 5 ng Orco ; ~20 nL) de l’ARNc prémélangé pour chaque ovocyte avec un injecteur de nanolitres à une station sans RNAse. (Figure 1F).
    REMARQUE : Avant l’injection, nous appuyons sur le bouton EMPTY pour évacuer le peu de mélange afin de nous assurer que le tube capillaire n’est pas bloqué. Attendre environ 5 secondes pour laisser les ARNc pénétrer entièrement dans l’ovocyte.
  5. Après l’injection, conservez les ovocytes sur une plaque de culture cellulaire stérile à 24 puits avec une solution saline de Barth modifiée à 18 °C pendant 3 à 7 jours avant l’enregistrement sur cellules entières.

6. Enregistrement du courant de la cellule entière à l’aide d’un système de pince de tension à deux électrodes (Figure 2)

  1. Avant l’enregistrement à deux électrodes, dissoudre les composés odorisants individuels dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour obtenir une série de solutions mères (100 μg/μL). Diluer 1000 fois ces solutions mères avec 1 tampon ND96 (91 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2·2H,2O, 2 mM de MgCl,2·6H,2O, 5 mM, de sel de sodium HEPES, pH de 7,6) pour obtenir un ensemble de solutions de travail (0,1 μg/μL).
  2. Assurez-vous que tout ce qui se trouve sur la table d’isolation des vibrations TMC, y compris le bouclier métallique, le microscope, la source lumineuse et la pompe à déchets, est soigneusement mis à la terre pour réduire l’effet du bruit électrique externe sur l’enregistrement du signal de la cellule entière.
  3. Préparez des microélectrodes en tirant un capillaire en verre (1,20 mm de diamètre extérieur x 0,94 mm de diamètre intérieur, longueur = 750 mm) à l’aide d’un extracteur de microtubes (chaleur = 525, traction = 50, vitesse = 50, temps = 250). Remplissez les capillaires avec 3 M de KCl. Chlorisez les fils Ag/AgCl pendant 2 à 5 min dans de l’eau de Javel à 10 % jusqu’à ce qu’ils prennent une couleur gris foncé (les fils Ag/AgCl gris pâle doivent être chlorisés).
  4. Mettez l’appareil en marche en allumant le clamp d’ovocytes et le numériseur Digidata (Figure 3A). Ouvrez le logiciel (par exemple, Clampex 10.3) et cliquez sur le bouton Enregistrer . Allumez l’interrupteur pour le tampon 1x ND96 (Section 6.1) et la pompe pour le tampon de déchets.
  5. Effectuez un pré-test en insérant des microélectrodes dans le tampon d’écoulement, puis en appuyant sur le bouton de test d’électrode Vm et le bouton de test d’électrode Ve pour vérifier la résistance des microélectrodes. Vm doit être < 40 mV et Ve doit être < 40 μA. Coupez le débit 1x tampon ND96 (section 6.1) et la pompe à déchets après le pré-test.
  6. Placez chaque ovocyte dans la chambre de perfusion (Figure 2) remplie de 1x tampon ND96 (Section 6.1) et positionnez doucement les ovocytes avec les pôles végétaux vers le haut par la chenille de verre. Insérez lentement les électrodes dans l’ovocyte (Figure 3B). Réglez le paramètre Vm sur 0, puis le paramètre Ve sur 0. Changez le bouton de serrage de OFF à FAST. Réglez le bouton Gain sur ~ -80 mV.
  7. Vérifiez la valeur de Ve, qui doit être constante. Si ce n’est pas le cas, il y a une fuite dans au moins l’une des deux microélectrodes. Si cela se produit, remplacez tous les composants défectueux par de nouveaux capillaires.
  8. Enregistrer les courants cellulaires entiers des ovocytes injectés à l’aide d’une pince à ovocytes à un potentiel de maintien de ~−80 mV (Figure 2).
  9. Effectuer l’acquisition et l’analyse de données.
    1. Reprenez le débit du tampon 1x ND96 (Section 6.1) et allumez la pompe à déchets.
    2. Application de la solution odorante via le système de perfusion : désactiver le tampon 1x ND96 (section 6.1) et faire couler la solution odorante pendant 10 secondes. Enregistrez ensuite la valeur maximale. Pour obtenir la réponse du OR à l’odorisant d’essai, soustrayez la valeur de référence de la valeur de crête.
    3. Arrêtez l’écoulement de la solution odorante et passez au tampon 1x ND96 (Section 6.1). Lavez l’ovocyte à l’aide du tampon jusqu’à ce que la trace actuelle récupère de la stimulation odorante précédente. L’ovocyte est alors prêt à être stimulé par une autre solution odorante. Généralement, un ovocyte peut être utilisé pour détecter 20 à 30 stimulations chimiques.
      REMARQUE : Lors de l’essai de la réponse dépendante de la concentration, la concentration la plus faible doit toujours être appliquée en premier avant de passer aux concentrations plus élevées.

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Résultats

En utilisant la technique d’enregistrement du sensillum unique (SSR), nous avons récemment identifié des odorisants humains considérés comme importants pour le comportement de recherche d’hôte d’Ae. aegypti 8. Cependant, le mécanisme moléculaire qui régit le processus de détection des odorants humains dans le système sensoriel périphérique d’Ae. aegypti reste inconnu. Les RO jouent un rôle important dans la détection des lig...

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Discussion

Le TEVC est une technique classique qui est largement utilisée pour examiner la fonction des récepteurs membranaires. Bien qu’un protocole détaillé ait déjà été publié43 qui présente une grande similitude avec la procédure présentée ici, la méthode proposée ici introduit quelques modifications importantes. Par exemple, ici, les ARNc de la salle d’opération et de l’Orco sont prémélangés et alicités dans des échantillons de petit volume im...

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Déclarations de divulgation

Aucun.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par une subvention de l’Alabama Agricultural Experiment Station (AAES) Multistate/Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 et ALA015-1-16009 à Terre-Neuve-et-Labrador.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well cell culture plateCytoOneCC7682-7524Used for oocyte culture
African clawed frogNascoLM00535Used to harvest Xenopus oocytes
Ag/AgCl wire electrodeWarner Instruments64-1282Used for microelectrodes
Clampex 10.3AxonN.A.Used for signal recording
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.N.A.Used for data analysis
Collagenase BSigma11088815001Used for oocyte digestion
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440AUsed for data acquisition
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kitOmegaD6942-01Used for plasmid preparation
Ethyl-M-aminobenzoate methanesulfonate saltSigma886-86-2Used for anesthetizing frogs
Glass capillaryFHC30-30-1Used for microinjection
Glass capillaryWarner Instruments64-0801Used for preparing microelectrodes
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500Used for oocyte digestion
Insect Growth ChambersCaron Productsmodel 6025Used for oocyte incubation
Leica MicroscopeLeicaS6 DUsed for cutting mosquito antennae
Light SourceSchottA20500Providing light sources for observation
Magnetic standNarishigeGJ-1Used to hold the reference electrode
MicromanipulatorLeica115378Used for minor movement of electrode
Micropipe pullerSuttermodel P-97Used to pull capillaries
Micropipette bevelerSuttermodel BV-10Used to sharpen capillaries
mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344Used for synthesizing cRNA
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond3-000-204Used for microinjection
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18091050Used for synthesizing cDNA
Olympus MicroscopeOlympusSZ61Used for microinjection
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cellsInvitrogenC404003Used for transformation
Oocyte clamp amplifierWarner Instrumentsmodel OC-725CUsed for TEVC recording
QIAquick gel extraction kitQiagen28704Used for gel purification
TMC Vibration Isolation TableTMC63-500Used for isolating the vibration from the equipment
TURBO DNA-free kitInvitrogenAM1907Used to remove DNase and other ions in RNA

Références

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