人类心脏肌细胞模型中体温过低预科后心肌保护体外评估

摘要

不同程度的体温过低对心肌保护的明显影响尚未得到彻底评估。本研究的目标是量化人类心肌细胞基模型中不同体温过低治疗后细胞死亡水平，为未来深入的分子研究奠定基础。

摘要

缺血/输液衍生心肌功能障碍是心脏手术后患者常见的临床方案。特别是，心肌细胞对缺血性损伤的敏感性高于其他细胞群体。目前，体温过低为预期的缺血性侮辱提供了相当大的保护。然而，对复杂的体温过低引起的分子变化的调查仍然有限。因此，必须确定一种类似于体内条件的文化条件，这种病症可以诱发类似于临床状况中以可重复的方式观察到的损伤。为了模拟体外类似缺血的条件，这些模型中的细胞通过缺氧/葡萄糖剥夺（OGD）进行治疗。此外，我们还应用了心脏手术中使用的标准时间温度协议。此外，我们提出了一种方法，使用简单但全面的方法对心肌损伤进行定量分析。通过流动细胞测量和使用 ELISA 套件对凋亡相关蛋白质的凋亡和表达水平进行评估。在这个模型中，我们测试了一个关于不同温度条件对体外心肌细胞凋亡的影响的假设。该模型的可靠性取决于严格的温度控制、可控的实验程序和稳定的实验结果。此外，该模型还可用于研究体温过低心脏保护的分子机制，这可能对开发用于体温过低的补充疗法有重要影响。

引言

缺血/输液衍生心肌功能障碍是患者心脏手术后常见的临床方案^1，2。在非脉动低流量灌注和总循环阻滞期间，仍发生涉及所有类型心脏细胞的损伤。特别是，心肌细胞对缺血性损伤的敏感性高于其他细胞群体。目前，治疗性体温过低（TH）为接受心脏手术^的病人提供了实质性的保护^，防止预期的缺血性^侮辱。TH 被定义为 14-34 °C 的核心体温，尽管对于心脏手术^5、6、7期间冷却的定义没有共识。2013年，一个国际专家小组提出了一个标准化的报告系统，对系统性低温循环抑制⁸的各种温度范围进行分类。根据脑电图和大脑的新陈代谢研究，他们把体温过低分为四个层次:深度体温过低（≤14°C）、深度体温过低（14.1-20°C）、中度体温过低（20.1-28°C）和轻度体温过低（28.1-34°C）。专家共识提供了一个明确和统一的分类，使研究更具可比性，并提供更临床相关的结果。TH提供的这种保护是基于其降低细胞代谢活性的能力，进一步限制了细胞高能磷酸盐消耗^9、10的速率。然而，TH在心肌保护中的作用是有争议的，并可能具有多种影响，这取决于体温过低的程度。

心肌 I/R 是众所周知的伴随着增加的细胞凋亡¹¹.最近的报告观察到，在开放心脏手术期间，计划心肌细胞死亡增加，并可能与坏死同时发生，从而增加死亡心肌细胞^{的数量12。}因此，减少心肌细胞凋亡是临床实践中一种有用的治疗方法。在小鼠心房HL-1心肌细胞模型中，治疗性体温过低被证明可减少¹³年输液期间细胞色素c和凋亡诱导因子（AIF）的线粒体释放。然而，温度在调节凋亡方面的影响是有争议的，似乎取决于体温过低的程度。Cooper及其同事观察到，与正常热心肺旁路对照组相比，患有深温低循环阻滞的猪心肌组织凋亡率提高了^14。此外，一些研究结果表明，深度体温过低可能激活凋亡通路，而不太积极的体温过低似乎抑制通路12，15，16。造成这一结果的原因可能是与缺血性损伤相关的混淆效应和对温度影响心肌组织的机制缺乏了解。因此，应准确定义增强或衰减凋亡的温度限制。

为了更好地了解与体温过低的疗效相关的机制，并为在人类中实施这种机制提供合理的基础，必须确定一种类似于体内疾病的文化状况，这种状况能够产生类似于以可重复方式观察到的临床状况的损害。实现这一目标的一个重要步骤是建立诱导心肌细胞凋亡的最佳条件。因此，在本研究中，我们探索了有关培养细胞的缺氧-葡萄糖剥夺实验的方法细节，这是缺血-输液的一种外体模型。此外，我们评估了不同缺氧时间对心肌细胞凋亡的影响，并验证了我们关于不同温度条件对体外细胞凋亡影响的假设。

研究方案

有关商业试剂和仪器的信息列在 材料表中。

AC16人类心肌细胞系源自成人心室心脏组织的主要细胞与SV40转化的人类成纤维细胞¹⁷的融合，这些细胞是从BLEFBI（中国上海）购买的。细胞系具有心肌细胞的许多生化和形态特征。此外，细胞系被广泛用于评估心肌损伤和心肌功能体外^18，19。

1. 细胞培养

注:基础培养介质由无血清杜尔贝科改良鹰介质（DMEM）、10%胎儿牛血清（FBS）、1%心脏肌细胞生长补充剂和1%青霉素/链霉素溶液组成。在使用前将介质存储在 4 °C 和预热至 37 °C。

1. 从液氮中取出低温保存的人类心肌细胞（HCM），并在37°C的水浴中解冻。
2. 在 37 °C 的水浴中轻轻摇动小瓶（+lt:1 分钟），直到小瓶中仅剩一小块冰。
3. 将小瓶转移到无菌层流罩中。用浸入 70% 酒精的棉球擦拭小瓶的外部。
4. 将4mL预热完全生长中下垂到含有解冻细胞的离心机管中。
5. 将细胞悬浮在200×g下10分钟。 离心后，丢弃超自然物，用5mL的全中等介质重新喷射颗粒。
6. 将细胞保持在37°C的潮湿孵化器下，空气为95%，二氧化碳_为5%。
   注意:在采集细胞进行实验之前，细胞可以生长，直到达到大约60-70%的汇流。

2. 建立缺氧（OGD）模型

注:在研究期前两小时，用无血清介质取代生长介质，细胞在潮湿的孵化器中再孵化2小时，在37°C的大气中含有5%_{的二氧化碳}。

1. 从6井板中吸气介质，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻清洗细胞三次。
2. 每口井添加 2 mL 的新鲜无糖 DMEM。
3. 在大气层下的三气体孵化器中以恒定温度培养细胞，混合温度为 95% N_2、5%CO₂和 0.1% O_2， 温度为 37 °C，持续 1、2、4、8、12 或 16 小时。
4. 缺氧治疗后，从6井板吸气介质，用PBS（pH 7.4）清洗细胞三次。
5. 每口井添加2毫升完整的DMEM。
6. 将细胞保持在37°C的潮湿孵化器下，空气为95%，二氧化碳_为5%。

3. 时间温度协议

注:在心脏手术中使用标准的时间温度协议，如其他人之前描述^{的20，21。}根据以下协议（图 1） 处理 HCM : 时间点 1 （T1） 表示感应结束，时间点 2 （T2） 表示维护结束，时间点 3 （T3） 表示回暖结束。分析在连续正常热条件下保持的控制单元（37 °C）。温度条件使用三气体孵化器创建，从而允许精确的温度调节。

1. 在实验前两小时，从6井板中吸气培养介质，每口井添加2毫升的新鲜无血清DMEM。
2. 在37°C的大气中以5%_{的二氧化碳}在潮湿的孵化器中重新孵化细胞2小时。
3. 2小时后，从6井板吸气介质，用PBS（pH 7.4）清洗细胞三次。
4. 每口井添加 2 mL 的新鲜无血清 DMEM。
5. 在三气体孵化器中重新孵化细胞。
   注意:更换介质以去除未连接的单元和碎屑。
6. 立即将培养皿放入三气孵化器，从而改变温度。
7. 冷却 1 小时后，快速从 6 井板中吸气介质，每口井添加 2 mL 的新鲜无糖 DMEM。
8. 培养大气下三气体孵化器中的细胞，包括95%N 2、5%CO₂和0.1%O_2，在37°C下12小时建立缺氧。
9. 设置下面描述的温度。
   注:协议从10小时的低温治疗开始，然后是2小时至37°C的回暖阶段和24小时的正常热度（37°C）。在每个时间点，三个培养皿被移除进行分析。
10. 经过低温处理后，从6井板吸气介质，用PBS（pH 7.4）洗三次。
11. 每口井添加2毫升完整的DMEM。
12. 将细胞保持在37°C的潮湿孵化器下，空气为95%，二氧化碳_为5%。

4. CCK-8 可行性测定

1. 使用前将 0.25% 的三聚氰胺-乙酰胺乙酰氨基酸 （EDTA） 溶液和 PBS 加热至 37 °C。
2. 吸气介质，用 1 mL 的 PBS 冲洗细胞，然后沿井壁加入 0.5 mL 的 0.25% trypsin。孵化在37°C，直到几乎所有的HCM分离（约1分钟）。
3. 将 1 mL 的 DMEM 完整介质添加到井中，以中和肌氨脂。
4. 将细胞悬架转移到 15 mL 离心机管中，通过离心机在 500 × g 下颗粒 HCM 3 分钟。在不干扰颗粒的情况下吸气超自然人。
5. 将细胞悬架（5000 个细胞/井）的 100 μL 等离子分配到 96 井板中。在加湿的孵化器中预孵化板 24 小时（在 37 °C.）
6. 使用 96 井板中的培养细胞生成不同的治疗组。
7. 在孵化器中孵化板的适当时间长度（16 h）。
8. 在板的每个井中加入 10 μL 的 CCK-8 溶液。
9. 在孵化器中孵化盘子1小时。
10. 使用微板读卡器测量 450 nm 的吸收度。
    注意:小心不要将气泡引入井中，因为它们会干扰OD读数测量。

5. 用于凋亡分析的流动细胞测量

1. 按照步骤 4.2-4.4 执行尝试化和离心步骤。
   注:细胞在没有EDTA的情况下用肌氨辛收获。为了评估凋亡，收集浮动细胞和粘附细胞。
2. 在1000×克时将细胞离心5分钟。丢弃超自然物，在 1 mL 的 PBS 中重新喷射颗粒。
3. 使用血细胞计数数细胞。使用移液器，将 100 μL 的 Trypan 蓝色处理细胞悬架转移到血细胞计中。使用手计数计数计数器，在一组 16 平方中计算活的未受污染的细胞，然后使用 PBS 以 1×10⁷ 细胞/毫升生成细胞悬架。
4. 获得 200 μL 的细胞悬浮（5 × 10⁵ -1 × 10⁶ 细胞）。
5. 离心机在 1000 × g 下 5 分钟，并在附件 V-FITC 绑定解决方案中重新注入颗粒。
6. 加入 5μL 的附件 V-FITC 来染色细胞。
7. 在细胞悬架中加入 10 μL 的碘化物丙酸。
8. 在黑暗中的室温下轻轻混合细胞并孵育20分钟。
   注意:细胞在孵化过程中被再吸收2-3次，以改善染色。
9. 启动流量细胞仪，并确保软件正常工作。
10. 打开流细胞测量软件中的两个点图窗口。
11. 选择 Y 轴 X 轴上的向前散射光 （FSC） 和侧散光 （SSC），分别从大小和粒度上排除细胞碎片和/或团块。
12. 选择 PE （590 mm） 检测通道和 FITC （530 mm），用于测量细胞的荧光强度。
13. 将空白（未染色的HCM）样品管放在流动细胞仪上。
14. 单击 "记录" 从空白样品管中的悬浮物中收集粒子，然后对细胞群进行门控，以便在第一个点图中进行进一步分析。
15. 将单染色样品放在管支撑臂上。单击 "记录" 从悬架中收集粒子，然后对细胞群进行门控，以便在第一个点图中进行进一步分析。
16. 收集其他样品管中的丙肝，并通过调整荧光通道的电压来优化测量。
    注:在实验过程中，未染色和单染色样品用作补偿控制。
17. 显示每个样本管的统计数据，并计算每个样本的凋亡率。

6. 线粒体去极化评估

1. 按照步骤 4.2-4.4 执行尝试式脱脂和离心。
2. 将细胞在 500 μL 的完整介质中恢复，然后调整到 1 × 10⁵ - 6 × 10⁶ 个单元格的细胞密度
3. 为每个管添加 0.5 mL 的 JC-1 工作解决方案。
4. 在37°C的细胞孵化器中孵化细胞20分钟。
   注意:在孵化期间，将 1 mL 的 5 × JC-1 染色缓冲器添加到 4 mL 蒸馏水中，以准备 JC-1 染色缓冲。
5. 孵化后，在4°C下以600×克的离心机3分钟。
6. 丢弃超自然物，在 JC-1 染色缓冲器的 1 mL 中重新吸收颗粒。
7. 重复步骤 6.5 到 6.6 三次。
8. 在 1.5 mL 离心管中将高温计重新注入 1 mL 的冰冷染色缓冲器中，并在 30 分钟内使用电池进行分析。
9. 选择 PE （590 nm） 检测通道和 FITC （530 nm） 来测量细胞中 JC-1 染料的荧光强度。
   注意:按照步骤 5.10-5.17 设置流量细胞计。

7. 活性氧物种检测

1. 按照步骤 4.2-4.4 执行尝试式脱脂和离心。
2. 用 10μM DCFDA 在培养介质中染色细胞，并将细胞密度调整为 1 × 10⁶ - 1 × 10⁷ 细胞
3. 在37°C孵育30分钟。
4. 每 3-5 分钟轻轻将细胞向上/向下移液。
5. 孵育后，用无血清细胞培养介质清洗细胞三次。
6. 按照步骤 5.10-5.17 分析流动细胞仪上的细胞。
   注:DCF 在 488 nm 时兴奋不已，排放强度为 530 nm。

8. 测量卡斯帕斯 3/ 卡斯帕斯 8 活动

1. 按照步骤 4.2-4.4 执行尝试个性化。
2. 通过离心收集细胞，在 600 ×克，在 4 °C 5 分钟。
3. 每 2 个× 10⁶ 个细胞添加 100 μL 的利萨特缓冲器。
4. 在冰上将细胞酶化15分钟。
5. 在冰浴中孵育 15 分钟后，将样品在 1.6 × 10⁴ x g 在 4 °C 下浸泡 15 分钟。
6. 将超母体转移到冰冷离心管中使用。
   注:样品中的蛋白质浓度应至少为1-3毫克/升。
7. 取出交流-DEVD-pNA（2 mM），并将其放在冰浴中使用。
8. 准确地将 40 μL 的缓冲溶液添加到酶标记板中，加入 80 μL 的样品，最后添加 10 μL 的 Ac-DEVD-pNA （2 mM）。
9. 在 37 °C 下孵化样品 120 分钟。
10. 根据制造商的说明测量微板读卡器上的 A405 值。
    注:通过从样品中减去空白控制的 A405 值来计算 caspase-3/caspase-8 产生的 pNA 产生的吸收。

结果

OGD 暴露对高致公箱生存能力的影响由 CCK-8 检测决定。与对照组观察到的细胞存活率相比，细胞存活率在时间依赖性方面显著降低（图2A）。输液后不同时间的氟氯化物凋亡率呈特定趋势，从0至16小时，凋亡率逐渐升高，达到16小时时点的最高率（图2B）。由于OGD 12小时将细胞活性降低约50%，12 h OGD在随后的实验中用于诱导细胞损伤。

讨论

完整动物的复杂性，包括不同类型的细胞之间的相互作用，往往妨碍对I/R损伤特定成分的详细研究。因此，有必要建立一个体外细胞模型，能够准确反映体内缺血后的分子变化。关于OGD模型的研究已经报告^13，22，许多复杂的方法已经建立23，24。OGD 模型的制备过程包括两个关键步骤:缺氧和葡萄糖剥夺。在本?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056