In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

Zusammenfassung

Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

Zusammenfassung

Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach einer Herzoperation. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet Unterkühlung erheblichen Schutz vor einer erwarteten ischämischen Beleidigung. Untersuchungen zu komplexen Hypothermie-induzierten molekularen Veränderungen halten sich jedoch in Grenzen. Daher ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die schäden ähnlich denen im klinischen Zustand in einer reproduzierbaren Weise verursachen können. Um Ischämie-ähnliche Bedingungen in vitro nachzuahmen, wurden die Zellen in diesen Modellen durch Sauerstoff-/Glukoseentzug (OGD) behandelt. Darüber hinaus haben wir ein Standard-Zeittemperaturprotokoll angewendet, das während der Herzchirurgie verwendet wird. Darüber hinaus schlagen wir einen Ansatz vor, um eine einfache, aber umfassende Methode für die quantitative Analyse von Myokardverletzungen zu verwenden. Apoptose und Expressionsniveaus von Apoptose-assoziierten Proteinen wurden durch Durchflusszytometrie und mit einem ELISA-Kit bewertet. In diesem Modell haben wir eine Hypothese über die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Kardiomyozytenapoptose in vitro getestet. Die Zuverlässigkeit dieses Modells hängt von einer strengen Temperaturregelung, kontrollierbaren experimentellen Verfahren und stabilen experimentellen Ergebnissen ab. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um den molekularen Mechanismus des hypothermischen Kardioschutzes zu untersuchen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von ergänzenden Therapien zur Verwendung mit Hypothermie haben kann.

Einleitung

Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach Herzoperationen^1,2. Während der nichtpulsatilen Durchflussdurchblutung und Perioden des gesamten Kreislaufstillstands treten immer noch Schäden bei allen Arten von Herzzellen auf. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet die therapeutische Unterkühlung (TH) einen erheblichen Schutz gegen eine erwartete ischämische Beleidigung bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen^3,4. TH ist definiert als eine Kernkörpertemperatur von 14-34 °C, obwohl es keinen Konsens über eine Definition der Kühlung während der Herzchirurgie^5,6,7gibt. Im Jahr 2013 schlug eine internationale Expertengruppe ein standardisiertes Meldesystem vor, um verschiedene Temperaturbereiche des systemischen hypothermischen Kreislaufstillstands⁸zu klassifizieren. Basierend auf Elektroenzephalographie- und Stoffwechselstudien des Gehirns teilten sie die Hypothermie in vier Ebenen auf: tiefe Hypothermie (≤ 14 °C), tiefe Hypothermie (14,1-20 °C), moderate Unterkühlung (20,1-28 °C) und leichte Hypothermie (28,1-34 °C). Der Expertenkonsens bot eine klare und einheitliche Klassifizierung, die es ermöglicht, dass Studien vergleichbarer sind und klinisch relevantere Ergebnisse liefern. Dieser Schutz durch TH basiert auf seiner Fähigkeit, die metabolische Aktivität von Zellen zu reduzieren, was ihre Rate des verbrauchshöchstenergetischen Phosphatverbrauchs weiter begrenzt^9,10. Jedoch, die Rolle der TH im Myokardschutz ist umstritten und kann mehrere Auswirkungen haben, je nach Grad der Unterkühlung.

Myokardi/R ist bekannt, dass sie von erhöhter Zellapoptisis¹¹begleitet wird. Jüngste Berichte haben beobachtet, dass programmierte KardiomyozytenTod steigt während der Operation am offenen Herzen, und kann mit Nekrose zusammenfallen, wodurch die Zahl der toten Myokardzellen¹²erhöht. Daher ist die Verringerung der Kardiomyozytenapoptose ein nützlicher therapeutischer Ansatz in der klinischen Praxis. Im Maus-Atrial-HL-1-Kardiomyozytenmodell wurde gezeigt, dass die therapeutische Hypothermie die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c und Apoptose-induzierendem Faktor (AIF) während der Reperfusion¹³reduziert. Jedoch, die Wirkung der Temperatur bei der Regulierung der Apoptose ist umstritten und scheint vom Grad der Unterkühlung abhängen. Cooper und Kollegen beobachteten, dass im Vergleich zu einer normothermen kardiopulmonalen Bypass-Kontrollgruppe die Apoptoserate des Myokardgewebes von Schweinen mit dem tiefen hypothermen Kreislaufstillstand^{um 14}erhöht wurde. Darüber hinaus haben die Ergebnisse einiger Studien darauf hindeutet, dass tiefe Hypothermie den Apoptose-Weg aktivieren kann, während weniger aggressive Hypothermie den Weg zu hemmen scheint^12,15,16. Der Grund für dieses Ergebnis kann auf verwirrende Effekte im Zusammenhang mit ischämischen Verletzungen und ein Mangelndes Verständnis der Mechanismen, durch die Temperatur wirkt sich auf Myokardgewebe. Daher sollten die Temperaturgrenzwerte, bei denen die Apoptose erhöht oder abgeschwächt wird, genau definiert werden.

Um ein besseres Verständnis der Mechanismen zu gewinnen, die mit der Wirksamkeit der Hypothermie verbunden sind, und eine rationale Grundlage für ihre Umsetzung beim Menschen zu schaffen, ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die Schäden ähnlich denen für den klinischen Zustand in reproduzierbarer Weise verursachen können. Ein wesentlicher Schritt zur Erreichung dieses Ziels ist die Schaffung der optimalen Bedingungen für die Induktion von Kardiomyozyten-Apoptose. Dementsprechend untersuchten wir in der vorliegenden Studie die methodischen Details zu Sauerstoff-Glukose-Entzugsexperimenten mit kultivierten Zellen, einem einfachen In-vitro-Modell der Ischämie-Reperfusion. Darüber hinaus haben wir die Wirkung verschiedener hypoxisch-ischämischer Zeiten auf die Kardiomyozytenapoptose bewertet und unsere Hypothese über die Wirkung unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Zellapoptose in vitro überprüft.

Protokoll

Informationen zu kommerziellen Reagenzien und Instrumenten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

Die AC16 humane Kardiomyozyten-Zelllinie wurde aus der Fusion von Primärzellen aus adultem ventrikulärem Herzgewebe mit SV40-transformierten menschlichen Fibroblasten¹⁷abgeleitet, die von BLUEFBIO (Shanghai, China) gekauft wurden. Die Zelllinie entwickelt viele biochemische und morphologische Merkmale, die für Kardiomyozyten charakteristisch sind. Darüber hinaus ist die Zelllinie weit verbreitet verwendet, um Myokardschäden und Myokardfunktion in vitro^18,19zu bewerten.

1. Zellkultur

HINWEIS: Das Basalkulturmedium besteht aus dem serumfreien Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium (DMEM), 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Herzmyozytenwachstumsergänzung und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung. Das Medium bei 4 °C aufbewahren und vor Gebrauch auf 37 °C vorwärmen.

1. Entfernen Sie die kryokonservierten menschlichen Kardiomyozytenzellen (HCM) aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie in einem Wasserbad bei 37 °C auf.
2. Die Durchstechflasche (<1 Minute) in einem 37 °C-Wasserbad vorsichtig schütteln, bis nur noch ein kleines Stück Eis in der Durchstechflasche verbleibt.
3. Die Durchstechflasche in eine sterile laminare Durchflusshaube übertragen. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit einer In 70% Alkohol getauchten Wattekugel ab.
4. Transfer 4 ml vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium tropfenweise in das Zentrifugenrohr, das die aufgetauten Zellen enthält.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in 5 ml komplettem Medium wieder aufhängen.
6. Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%_CO2auf.
   HINWEIS: Vor der Ernte der Zellen für Experimente dürfen die Zellen wachsen, bis sie etwa 60-70% Konfluenz erreichen.

2. Erstellung eines Sauerstoff-Glukose-Entzugsmodells (OGD)

HINWEIS: Ersetzen Sie zwei Stunden vor der Studienzeit das Wachstumsmedium durch ein serumfreies Medium, und die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator für 2 h bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%_CO2wieder inkubiert.

1. Das Medium von einer 6-Well-Platte absaugen und die Zellen dreimal mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) vorsichtig waschen.
2. Fügen Sie 2 ml frisches zuckerfreies DMEM pro Brunnen hinzu.
3. Kultur die Zellen bei konstanter Temperatur in einem Drei-Gas-Inkubator unter einer Atmosphäre mit einem Gemisch von 95%_N2,5%_CO2und 0,1%_O2 bei 37 °C für 1, 2, 4, 8, 12 oder 16 h.
4. Nach der Hypoxie-Behandlung das Medium von der 6-Well-Platte ansaugen und die Zellen dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.
5. Fügen Sie 2 ml komplette DMEM pro Brunnen hinzu.
6. Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%_CO2auf.

3. Zeit-Temperatur-Protokoll

HINWEIS: Ein Standard-Zeittemperaturprotokoll wird während der Herzchirurgie verwendet, wie zuvor von anderen^20,21beschrieben. Behandeln Sie HCMs nach dem folgenden Protokoll (Abbildung 1): Der Zeitpunkt 1 (T1) gibt das Ende der Induktion an, der Zeitpunkt 2 (T2) gibt das Ende der Wartung an und der Zeitpunkt 3 (T3) gibt das Ende der Rewarminganuktion an. Analysieren Sie Kontrollzellen, die unter kontinuierlichen normothermischen Bedingungen (37 °C) gehalten werden. Die Temperaturbedingungen werden mit einem Tri-Gas-Inkubator erzeugt, der eine präzise Temperaturregelung ermöglicht.

1. Zwei Stunden vor den Experimenten das Kulturmedium von einer 6-Well-Platte ansaugen und 2 ml frisches serumfreies DMEM pro Brunnen hinzufügen.
2. Die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 2 h bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%_CO2wieder inkubieren.
3. Nach 2 h das Medium von der 6-Well-Platte absaugen und die Zellen dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.
4. Fügen Sie 2 ml frisches serumfreies DMEM pro Brunnen hinzu.
5. Reinkubieren Sie die Zellen im Trigas-Inkubator.
   HINWEIS: Ersetzen Sie das Medium, um nicht angeschlossene Zellen und Schmutz zu entfernen.
6. Ändern Sie sofort die Temperatur, indem Sie die Kulturgerichte einen Tri-Gas-Inkubator platzieren.
7. Nach 1 h Abkühlung das Medium schnell von der 6-Well-Platte absaugen und 2 ml frisches, zuckerfreies DMEM pro Brunnen hinzufügen.
8. Kultur die Zellen in einem Tri-Gas-Inkubator unter einer Atmosphäre, die 95%_N2, 5%_CO2und 0,1%_O2 bei 37 °C für 12 h zur Etablierung von Hypoxie.
9. Stellen Sie die Temperatur wie unten beschrieben ein.
   HINWEIS: Das Protokoll beginnt mit 10 h einer Niedertemperaturbehandlung, gefolgt von einer Aufwärmphase für 2 h bis 37 °C und 24 h Normothermie (37 °C). Zu jedem Zeitpunkt werden drei Petrischalen zur Analyse entfernt.
10. Nach der Niedertemperaturbehandlung das Medium von der 6-Well-Platte absaugen und dreimal mit PBS (pH 7.4) waschen.
11. Fügen Sie 2 ml komplette DMEM pro Brunnen hinzu.
12. Bewahren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter einer Atmosphäre mit 95% Luft und 5%_CO2auf.

4. CCK-8-Fähigkeitstest

1. Die 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung und PBS vor der Anwendung auf 37 °C erwärmen.
2. Saugen Sie das Medium, spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und fügen Sie dann 0,5 ml von 0,25% Trypsin entlang der Wand des Brunnens hinzu. Bei 37 °C inkubieren, bis fast alle HCMs abgelöst sind (ca. 1 min).
3. Fügen Sie 1 ml DMEM-Gesamtmedium in die Brunnen ein, um das Trypsin zu neutralisieren.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und pellet die HCMs durch Zentrifugation bei 500 × g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
5. Geben Sie 100 L Aliquots der Zellsuspension (5000 Zellen/Well) in eine 96-Well-Platte. Die Platte für 24 h in einem befeuchteten Inkubator (bei 37 °C) vorinkubieren
6. Verwenden Sie die kultivierten Zellen in den 96-Well-Platten, um verschiedene Behandlungsgruppen zu erzeugen.
7. Inkubieren Sie die Platte für eine angemessene Zeitdauer (16 h) in einem Inkubator.
8. Fügen Sie jeder Bohrung der Platte 10 L CCK-8-Lösung hinzu.
9. Inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde im Inkubator.
10. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser.
    VORSICHT: Achten Sie darauf, keine Blasen in die Brunnen einzuführen, da sie die OD-Messwerte stören.

5. Durchflusszytometrie zur Apoptoseanalyse

1. Führen Sie Trypsinisierungs- und Zentrifugationsschritte durch, indem Sie die Schritte 4.2-4.4 befolgen.
   HINWEIS: Zellen werden mit Trypsin ohne EDTA geerntet. Um die Apoptose zu bewerten, werden sowohl schwimmende als auch anhimante Zellen gesammelt.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 1000 × g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf.
3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Übertragen Sie mit einer Pipette 100 l Trypan Blue-treated Cell Suspension auf ein Hämozytometer. Zählen Sie mit einem Handzähler die lebenden, ungefärbten Zellen in einem Satz von 16 Quadraten und verwenden Sie dann PBS, um eine Zellsuspension bei 1×10⁷ Zellen/ml zu erzeugen.
4. Erhalten Sie 200 l der Zellsuspension (5 × 10⁵ -1 × 10⁶ Zellen).
5. Zentrifuge für 5 min bei 1000 × g und das Pellet in der Annexin V-FITC-Bindungslösung wieder aufsetzen.
6. Fügen Sie 5 L Von Annexin V-FITC hinzu, um die Zellen zu färben.
7. Fügen Sie der Zellsuspension 10 L Propidiumjodid hinzu.
8. Mischen Sie die Zellen vorsichtig und bebrüten Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   HINWEIS: Die Zellen werden während der Inkubation 2-3 Mal resuspendiert, um die Färbung zu verbessern.
9. Starten Sie das Durchflusszytometer, und stellen Sie sicher, dass die Software ordnungsgemäß funktioniert.
10. Öffnen Sie zwei Punktdiagrammfenster in der Flow-Zytometrie-Software.
11. Wählen Sie Vorwärtsstreulicht (FSC) auf der X-Achse und seitengestreutes Licht (SSC) auf der Y-Achse aus, um Zellablagerungen bzw. Klumpen hinsichtlich ihrer Größe bzw. Granularität auszuschließen.
12. Wählen Sie den PE (590 mm) Detektionskanal und FITC (530 mm), der verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität der Zellen zu messen.
13. Legen Sie das leere (HCMs, die nicht gefärbt wurden) Probenrohr auf das Durchflusszytometer.
14. Klicken Sie auf Aufzeichnen, um Partikel aus der Suspension im leeren Probenrohr zu sammeln, und dann die Zellpopulation zur weiteren Analyse im ersten Punktdiagramm zu beaufnehmen.
15. Legen Sie die eingefärbten Proben auf den Rohrträgerarm. Klicken Sie auf Aufzeichnen, um Partikel aus der Suspension zu sammeln, und dann die Zellpopulation zur weiteren Analyse im ersten Punktdiagramm zu beorchen.
16. Sammeln Sie die HCMs in anderen Probenröhren und optimieren Sie die Messung, indem Sie die Spannungen der Fluoreszenzkanäle anpassen.
    HINWEIS: Ungefärbte und eingefärbte Proben werden während des Experiments als Kompensationskontrollen verwendet.
17. Zeigen Sie die Statistiken der einzelnen Probenröhrchen an und berechnen Sie die Apoptoserate jeder Probe.

6. Mitochondriale Depolarisationsbewertung

1. Führen Sie Trypsinisierung und Zentrifugation durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 durch.
2. Setzen Sie die Zellen in 500 l des gesamten Mediums wieder auf, und passen Sie dann die Zelldichte an 1 × 10⁵ - 6 × 10⁶ Zellen an
3. Fügen Sie 0,5 ml JC-1 Arbeitslösung zu jedem Rohr hinzu.
4. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C für 20 Minuten.
   HINWEIS: Während der Inkubationszeit 1 ml 5× JC-1 Färbepuffer zu 4 ml destilliertem Wasser hinzufügen, um den JC-1-Färbepuffer vorzubereiten.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen nach der Inkubation bei 600 × g für 3 min bei 4 °C.
6. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml JC-1-Färbepuffer wieder auf.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6.5 bis 6.6 dreimal.
8. Setzen Sie die HCMs in 1 ml eiskalten Färbepuffer in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr aus und verwenden Sie die Zellen für die Analyse innerhalb von 30 min.
9. Wählen Sie den PE (590 nm) Detektionskanal und FITC (530 nm) aus, um die Fluoreszenzintensität des JC-1-Farbstoffs in den Zellen zu messen.
   HINWEIS: Richten Sie das Durchflusszytometer mit den folgenden Schritten 5.10-5.17 ein.

7. Reaktive Sauerstoffspezies Assay

1. Führen Sie Trypsinisierung und Zentrifugation durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 durch.
2. Stainieren Sie die Zellen im Kulturmedium mit 10 M DCFDA und passen Sie die Zelldichte auf 1 × 10⁶ - 1 × 10⁷ Zellen an
3. 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
4. Pipette die Zellen alle 3-5 min nach oben/unten.
5. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit serumfreiem Zellkulturmedium.
6. Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer, indem Sie die Schritte 5.10-5.17 ausführen.
   HINWEIS: DCF wird bei 488 nm angeregt und die Emissionsintensität bei 530 nm gemessen.

8. Messung von Caspase 3/ Caspase 8 Aktivität

1. Führen Sie die Trypsinisierung durch die folgenden Schritte 4.2-4.4 aus.
2. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 600 × g bei 4 °C für 5 Minuten.
3. Fügen Sie 100 l Lysatpuffer pro 2 × 10⁶ Zellen hinzu.
4. Lyse die Zellen für 15 Minuten auf Eis.
5. Nach 15 min Inkubation in einem Eisbad zentrieren Sie die Probe bei 1,6 × 10⁴ x g bei 4 °C 15 Minuten lang.
6. Übertragen Sie den Überstand zur Verwendung in ein eiskaltes Zentrifugenrohr.
   HINWEIS: Die Proteinkonzentration in der Probe sollte mindestens 1-3 mg/ml betragen.
7. Entfernen Sie Ac-DEVD-pNA (2 mM) und legen Sie es auf ein Eisbad für den Einsatz.
8. Fügen Sie der enzymbeschriftten Platte eine Pufferlösung von 40 l genau hinzu, fügen Sie 80 l der Probe hinzu und fügen Sie schließlich 10 l Ac-DEVD-pNA (2 mM) hinzu.
9. Inkubieren Sie die Probe bei 37 °C für 120 Minuten.
10. Gemessen den A405-Wert auf einem Mikroplattenleser gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Die von der pNA erzeugte Absorption wird durch Subtraktion des A405-Wertes des Rohlingssteuerelements von dem der Probe berechnet.

Ergebnisse

Die Wirkung der OGD-Exposition auf die Lebensfähigkeit von HCM wurde durch CCK-8-Assay bestimmt. Im Vergleich zu der in der Kontrollgruppe beobachteten wurde die Zelllebensfähigkeit zeitabhängig signifikant verringert (Abbildung 2A). Die Apoptoseraten von HCM zu unterschiedlichen Zeiten nach der Reperfusion zeigten einen spezifischen Trend, bei dem die Apoptoseraten allmählich stiegen und die Höchstrate zum 16-Stunden-Zeitpunkt erreichten(Abbildung 2B). Da ...

Diskussion

Die Komplexität intakter Tiere, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, verhindert häufig detaillierte Untersuchungen spezifischer Komponenten von I/R-Verletzungen. Daher ist es notwendig, ein In-vitro-Zellmodell zu etablieren, das die molekularen Veränderungen nach Ischämie in vivo genau reflektieren kann. Forschung an OGD-Modelle wurde bereits berichtet^13,22, und viele ausgeklügelte Methoden wurden etabliert^...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056