İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Özet

Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

Özet

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda hipotermi, beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar. Bununla birlikte, karmaşık hipotermi kaynaklı moleküler değişikliklerle ilgili araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, klinik durumda gözlemlenene benzer hasarlara neden olabilecek in vivo durumlara benzer bir kültür durumunun tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanması esastır. İn vitro iskemi benzeri durumları taklit etmek için, bu modellerdeki hücreler oksijen /glikoz yoksunluğu (OGD) ile tedavi edildi. Ayrıca kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart bir zaman-sıcaklık protokolü uyguladık. Ayrıca, miyokard hasarının nicel analizi için basit ama kapsamlı bir yöntem kullanmak için bir yaklaşım öneriyoruz. Apoptoz ilişkili proteinlerin apoptoz ve ekspresyon düzeyleri akış sitometrisi ve ELISA kiti kullanılarak değerlendirildi. Bu modelde, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili bir hipotezi test ettik. Bu modelin güvenilirliği sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve istikrarlı deneysel sonuçlara bağlıdır. Ek olarak, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.

Giriş

İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur^1,2. Zengin olmayan düşük akış perfüzyonu ve toplam dolaşım durması dönemlerinde, her türlü kalp hücresini içeren hasarlar oluşmaya devam eder. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda, terapötik hipotermi (TH), kalp cerrahisi uygulanan hastalarda beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar^3,4. TH, 14-34 ° C çekirdek vücut sıcaklığı olarak tanımlanır, ancak kalp cerrahisi sırasında soğutma tanımı ile ilgili bir fikir birliği yoktur^5,6,7. 2013 yılında, uluslararası bir uzman paneli, sistemik hipotermik dolaşım tutuklamasının çeşitli sıcaklık aralıklarını sınıflandırmak için standartlaştırılmış bir raporlama sistemi önerdi⁸. Beynin elektroensefalografisi ve metabolizma çalışmalarına dayanarak hipotermiyi dört düzeye ayırdılar: derin hipotermi (≤ 14 °C), derin hipotermi (14.1-20 °C), orta hipotermi (20.1-28 °C) ve hafif hipotermi (28.1-34 °C). Uzman konsensüsü, açık ve düzgün bir sınıflandırma sağlayarak çalışmaların daha karşılaştırılabilir olmasını ve klinik olarak daha alakalı sonuçlar vermesini sağladı. TH tarafından sağlanan bu koruma, hücrelerin metabolik aktivitesini azaltma kapasitesine dayanır ve yüksek enerjili fosfat tüketim hızlarını daha da sınırlar^9,10. Bununla birlikte, miyokard korumasında TH'nin rolü tartışmalıdır ve hipotermi dereceine bağlı olarak birden fazla etkiye sahip olabilir.

Miyokard I/R'ye artmış hücre apoptizisi¹¹eşlik ettiği bilinmektedir. Son raporlar, programlanmış kardiyomiyosit ölümünün açık kalp ameliyatı sırasında arttığını ve nekrozla çakışabileceğini ve böylece ölü miyokard hücrelerinin sayısını artırdığını gözlemlemıştır¹². Bu nedenle kardiyomiyosit apoptozun azaltılması klinik pratikte yararlı bir terapötik yaklaşımdır. Fare atriyal HL-1 kardiyomiyosit modelinde, terapötik hipotermi, reperfüzyon sırasında sitokrom c ve apoptoz indükleyici faktörün (AIF) mitokondriyal salınımını azalttığı gösterilmiştir¹³. Bununla birlikte, sıcaklığın apoptozu düzenlemedeki etkisi tartışmalıdır ve hipotermi derecesine bağlı olduğu görülmektedir. Cooper ve meslektaşları, normotermik kardiyopulmoner bypass kontrol grubuna kıyasla, derin hipotermik dolaşım durması olan domuzlardan gelen miyokard dokusunun apoptoz oranının¹⁴arttığını gözlemlediler. Ek olarak, bazı çalışmaların sonuçları derin hipotermi apoptoz yolunu aktive edebilirken, daha az agresif hipotermi^{12 , 15,16}yolunu inhibe ediyor gibi görünmektedir. Bu sonucun nedeni, iskemik yaralanma ile ilişkili kafa karıştırıcı etkilerden ve sıcaklığın miyokard dokusunu etkilediği mekanizmaların anlaşılmamasından kaynaklanabilir. Bu nedenle, apoptozun artırıldığı veya zayıfladığı sıcaklık sınırları doğru bir şekilde tanımlanmalıdır.

Hipotermi etkinliği ile ilişkili mekanizmaların daha iyi anlaşılması ve insanlarda uygulanması için rasyonel bir temel sağlamak için, klinik durum için tekrarlanabilir bir şekilde gözlemlenene benzer hasar üretebilecek in vivo koşullara benzer bir kültür durumunun tanımlanması esastır. Bu hedefe ulaşmak için önemli bir adım, kardiyomiyosit apoptozun indüklene için en uygun koşulları belirlemektir. Bu nedenle, bu çalışmada, iskemi-reperfüzyonun bir facile in vitro modeli olan kültürlü hücrelerle yapılan oksijen-glikoz yoksunluğu deneyleri ile ilgili metodolojik ayrıntıları araştırdık. Ayrıca, farklı hipoksik-iskemik zamanların kardiyomiyosit apoptoz üzerindeki etkisini değerlendirdik ve farklı sıcaklık koşullarının hücreli apoptoz in vitro üzerindeki etkisine ilişkin hipotezimizi doğruladık.

Protokol

Ticari reaktifler ve aletlerle ilgili bilgiler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.

AC16 insan kardiyomiyosit hücre hattı, yetişkin ventrikül kalp dokusundan birincil hücrelerin BLUEFBIO'dan (Şanghay, Çin) satın alınan SV40 dönüştürülmüş insan fibroblastları¹⁷ile füzyonundan türetilmiştir. Hücre hattı kardiyomiyositlerin karakteristik birçok biyokimyasal ve morfolojik özelliğini geliştirir. Ek olarak, hücre hattı miyokard hasarını ve miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır in vitro^18,19.

1. Hücre kültürü

NOT: Bazal kültür ortamı serumsuz Dulbecco'nun modifiye Eagle medium (DMEM), %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 kardiyak miyozit büyüme takviyesi ve %1 penisilin/streptomisin çözeltisi içerir. Ortamı kullanmadan önce 4 °C'de ve ön ısıtmadan 37 °C'ye saklayın.

1. Kriyoprezer korunmuş insan kardiyomiyosit (HCM) hücrelerini sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'de bir su banyosunda çözün.
2. Şişeyi (<1 dakika) 37 °C'lik bir su banyosunda şişenin içinde sadece küçük bir buz parçası kalana kadar hafifçe sallayın.
3. Şişeyi steril bir laminar akış başlığına aktarın. Şişenin dışını% 70 alkole batırılmış bir pamuk topu ile silin.
4. 4 mL önceden ısıtılmamış komple büyüme ortamını, çözülmüş hücreleri içeren santrifüj tüpüne damla yönünde aktarın.
5. Hücre süspansiyonu 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin 5 mL'lik tam orta olarak yeniden ıslatın.
6. Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO₂ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.
   NOT: Deneyler için hücreleri toplamadan önce, hücrelerin yaklaşık% 60-70 izdiah edene kadar büyümesine izin verilir.

2. Oksijen-glukoz yoksunluğu (OGD) modelinin kurulması

NOT: Çalışma döneminden iki saat önce, büyüme ortamını serumsuz ortamla değiştirin ve hücreler% 5_CO2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde yeniden kapatıldı.

1. Ortamı 6 kuyulu bir plakadan emiş ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hafifçe yıkayın.
2. Kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.
3. Hücreleri bir atmosfer altında üç gazlı bir inkübatörde% 95 N 2 , % 5 CO 2 ve 1,_2,4, 8,₁₂veya 16 saat boyunca 37 ° C'de% 0.1 O 2 karışımı ile sabit bir sıcaklıkta kültürleyin.
4. Hipoksi tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
5. Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.
6. Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO₂ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.

3. Zaman sıcaklığı protokolü

NOT: Kalp cerrahisi sırasında daha önce diğerleri tarafından açıklandığı gibi standart bir zaman sıcaklığı protokolü kullanılır^20,21. HCM'leri aşağıdaki protokole göre tedavi edin (Şekil 1): zaman noktası 1 (T1) indüksiyonun sonunu, zaman noktası 2 (T2) bakımın sonunu ve zaman noktası 3 (T3) yeniden ısıtmanın sonunu gösterir. Sürekli normotermik koşullar altında tutulan kontrol hücrelerini analiz edin (37 °C). Sıcaklık koşulları, hassas sıcaklık düzenlemesine izin veren bir üç gaz inkübatörü kullanılarak oluşturulur.

1. Deneylerden iki saat önce, kültür ortamını 6 kuyulu bir plakadan epire edin ve kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.
2. Hücreleri% 5 CO 2 ile bir atmosfer altında 37 ° C'de 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde_yenideninkübatör.
3. 2 saat sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
4. Kuyu başına 2 mL taze serumsuz DMEM ekleyin.
5. Üç gazlı inkübatördeki hücreleri yeniden kuluçkaya yatırın.
   NOT: Eklenmemiş hücreleri ve kalıntıları kaldırmak için ortamı değiştirin.
6. Kültür yemeklerini üç gazlı bir inkübatör yerleştirerek sıcaklığı hemen değiştirin.
7. 1 saat soğudktan sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan hızlı bir şekilde aspire edin ve kuyu başına 2 mL taze şekersiz DMEM ekleyin.
8. Hipoksiyi kurmak için 37 °C'de %95 N 2 ,_%5CO 2 ve_%0,1O_2'den oluşan bir atmosfer altında üç gazlı inkübatördeki hücreleri kültüre edin.
9. Sıcaklığı aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
   NOT: Protokol, düşük sıcaklıklı bir tedavinin 10 h'si ile başlar, ardından 2 h ila 37 °C ve 24 saat normotermi (37 °C) için yeniden ısıtma aşaması ile başlar. Her zaman noktasında, analiz için üç Petri kabı çıkarılır.
10. Düşük sıcaklık tedavisinden sonra, ortamı 6 kuyulu plakadan aspire edin ve PBS (pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
11. Kuyu başına 2 mL tam DMEM ekleyin.
12. Hücreleri% 95 hava ve% 5 CO₂ile bir atmosfer altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de koruyun.

4. CCK-8 uygulanabilirlik tahlilleri

1. Kullanmadan önce %0,25 tripsin-etylenediaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisini ve PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.
2. Ortamı aspire edin, hücreleri 1 mL PBS ile durulayın ve ardından kuyunun duvarı boyunca% 0,25 tripsin 0,5 mL ekleyin. Hemen hemen tüm HCM'ler ayrılana kadar 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (yaklaşık 1 dk).
3. Tripsin nötralize etmek için kuyulara 1 mL DMEM komple orta ekleyin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve HCM'leri 3 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile pelet edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
5. Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik aliquotlarını (5000 hücre/kuyu) 96 kuyu plakasına dağıtın. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C'de) 24 saat önceden kesin.
6. Farklı tedavi grupları oluşturmak için 96 kuyu plakalarındaki kültürlü hücreleri kullanın.
7. Plakayı bir inkübatörde uygun bir süre (16 saat) kuluçkaya yatırın.
8. Plakanın her kuyusuna 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.
9. Plakayı inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatırın.
10. Bir mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de ölçün.
    DİkKAT: OD okuma ölçümlerine müdahale ettikleri için kuyulara kabarcık sokmamaya dikkat edin.

5. Apoptoz analizi için akış sitometrisi

1. 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme adımlarını gerçekleştirin.
   NOT: Hücreler EDTA olmadan tripsin ile toplanır. Apoptrozu değerlendirmek için hem yüzen hem de yapışan hücreler toplanır.
2. Hücreleri 1000 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatant atın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden atın.
3. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Bir pipet kullanarak, 100 μL Trypan Mavi işlem görmüş hücre süspansiyonu hemositometreye aktarın. Bir el çetele sayacı kullanarak, canlı, lekelenmemiş hücreleri 16 karelik bir kümede sayın ve sonra PBS'yi kullanarak 1×10⁷ hücre/ml'de bir hücre süspansiyonu oluşturun.
4. Hücre süspansiyonunun 200 μL'× elde edin (5 ×^{10 5} -1 × 10⁶ hücre).
5. 1000 g'da 5 dakika santrifüj × ve peletin Ek V-FITC bağlama çözeltisinde yeniden kullanın.
6. Hücreleri boyamak için 5 μL Annexin V-FITC ekleyin.
7. Hücre süspansiyonuna 10 μL propidium iyodür ekleyin.
8. Hücreleri hafifçe karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Lekelenmeyi iyileştirmek için hücreler kuluçka sırasında 2-3 kez yeniden biriktirilir.
9. Akış sitometresini başlatın ve yazılımın uygun şekilde çalıştığından emin olun.
10. Akış sitometri yazılımında iki nokta çizim penceresi açın.
11. Hücre kalıntılarını ve/veya kümeleri sırasıyla boyutları ve tanecikleri açısından dışlamak için X ekseninde öne dağılmış ışığı (FSC) ve Y eksenindeki yan dağınık ışığı (SSC) seçin.
12. Hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan PE (590 mm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 mm) seçin.
13. Boş (boyanmamış HCM'ler) numune tüpünü akış sitometresine yerleştirin.
14. Boş örnek tüpteki süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını kapatın.
15. Tek lekeli numuneleri tüp destek koluna yerleştirin. Süspansiyondan parçacık toplamak için Kaydet'i tıklatın ve sonra ilk nokta çiziminde daha fazla analiz için hücre popülasyonunun kapısını girin.
16. Diğer numune tüplerindeki HCM'leri toplayın ve floresan kanallarının voltajlarını ayarlayarak ölçümü optimize edin.
    NOT: Deney sırasında kompanzasyon kontrolü olarak lekesiz ve tek lekeli numuneler kullanılır.
17. Her numune tüpünün istatistiklerini görüntüleyin ve her numunenin kesme oranı hesaplayın.

6. Mitokondriyal depolarizasyon değerlendirmesi

1. 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.
2. Hücreleri 500 μL tam ortamda yeniden biriktirin ve ardından 1 × 10⁵ - 6 × 10⁶ hücreye ayarlanmış hücre yoğunluğunu ayarlayın
3. Her tüpe 0,5 mL JC-1 çalışma çözümü ekleyin.
4. Hücreleri 37 °C'de bir hücre inkübatöründe 20 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kuluçka süresi boyunca, JC-1 boyama tamponunu hazırlamak için 4 mL damıtılmış suya 1 mL 5× JC-1 boyama tamponu ekleyin.
5. Kuluçkadan sonra, hücreleri 600 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.
6. Süpernatant atın ve peletin 1 mL JC-1 boyama tamponunda yeniden süzülür.
7. 6,5 ile 6,6 olan adımları üç kez yineleyin.
8. HCM'leri 1,5 mL santrifüj tüpünde 1 mL buz gibi boyama tamponunda yeniden kullanın ve hücreleri 30 dakika içinde analiz için kullanın.
9. Hücrelerdeki JC-1 boyasının floresan yoğunluğunu ölçmek için PE (590 nm) algılama kanalını ve FITC'yi (530 nm) seçin.
   NOT: 5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresini ayarlayın.

7. Reaktif oksijen türleri tahlili

1. 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization ve santrifüjleme gerçekleştirin.
2. Kültür ortamındaki hücreleri 10 μM DCFDA ile lekelenin ve hücre yoğunluğunu 1 × 10 6 -¹ × 10⁷ hücreye ayarlayın
3. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
4. Hücreleri her 3-5 dakikada bir yavaşça yukarı / aşağı borulayın.
5. Kuluçkadan sonra hücreleri serumsuz hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın.
6. 5.10-5.17 adımlarını izleyerek akış sitometresti üzerindeki hücreleri analiz edin.
   NOT: DCF 488 nm'de heyecanlanır ve emisyon yoğunluğu 530 nm olarak ölçülür.

8. Caspase Ölçümü 3/ Caspase 8 Aktivitesi

1. 4.2-4.4 adımlarını izleyerek trypsinization gerçekleştirin.
2. Hücreleri 5 dakika boyunca 4 °C'de 600 × g'da santrifüjleme ile toplayın.
3. 2 × 10⁶ hücre başına 100 μL lysate tampon ekleyin.
4. Hücreleri buzda 15 dakika boyunca yalım.
5. Bir buz banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatırtıktan sonra, numuneyi 15 dakika boyunca 4 °C'de^1,6 × 10 4 x g'da santrifüjleyin.
6. Süpernatantı kullanmak için buz gibi bir santrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Numunedeki protein konsantrasyonu en az 1-3 mg/mL olmalıdır.
7. Ac-DEVD-pNA'yı (2 mM) çıkarın ve kullanmak için bir buz banyosuna yerleştirin.
8. Enzim etiketli plakaya doğru bir şekilde 40 μL tampon çözeltisi ekleyin, numunenin 80 μL'sini ekleyin ve son olarak 10 μL Ac-DEVD-pNA (2 mM) ekleyin.
9. Numuneyi 37 °C'de 120 dakika kuluçkaya yatırın.
10. Üreticinin talimatlarına göre bir mikro plaka okuyucusunda A405 değeri ölçüldü.
    NOT: Caspase-3/caspase-8 tarafından üretilen pNA tarafından üretilen absorbans, boş kontrolün A405 değeri numuneninkinden çıkarılarak hesaplanır.

Sonuçlar

OGD maruziyetinin HCM'lerin canlılığı üzerindeki etkisi CCK-8 tahlili ile belirlendi. Kontrol grubunda gözlenenlerle karşılaştırıldığında, hücre canlılığı zamana bağlı olarak önemli ölçüde azaldı (Şekil 2A). Reperfüzyondan sonra farklı zamanlarda HCM'lerin apoptoz oranları, 0 ila 16 saat arasında, apoptoz oranlarının kademeli olarak arttığı ve 16 saat zaman noktasında maksimum orana ulaştığı belirli bir eğilim göstermiştir (Şe...

Tartışmalar

Farklı hücre türleri arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere sağlam hayvanların karmaşıklıkları, genellikle I /R yaralanmasının belirli bileşenlerinin ayrıntılı çalışmalarını önler. Bu nedenle, in vivo iskemi sonrası moleküler değişiklikleri doğru bir şekilde yansıtabilecek bir in vitro hücre modeli oluşturmak gerekir. OGD modelleri üzerinde yapılan araştırmalar daha önce^13,22ve birçok sofistike yöntem oluşturulmuştu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056