从人内脏脂肪组织中分离出活的脂肪细胞和基质血管组分，适用于 RNA 分析和巨噬细胞表型分析

摘要

该方案提供了一种高效的胶原酶消化方法，用于在单个过程中从人内脏脂肪中分离活脂肪细胞和基质血管部分-SVF细胞，包括从脂肪细胞中获得高质量RNA的方法，以及通过对多种膜结合标记物进行染色以通过流式细胞术分析的SVF-巨噬细胞表型。

摘要

内脏脂肪组织（VAT）是一种活跃的代谢器官，主要由成熟的脂肪细胞和基质血管部分（SVF）细胞组成，它们释放不同的生物活性分子，控制代谢、激素和免疫过程;目前，尚不清楚这些过程如何在脂肪组织内调节。因此，开发评估每个细胞群对脂肪组织病理生理学贡献的方法至关重要。该方案描述了分离步骤，并提供了必要的故障排除指南，以便使用胶原酶酶消化技术在单个过程中从人VAT活检中有效分离活的成熟脂肪细胞和SVF。此外，该方案还经过优化，可识别巨噬细胞亚群并进行成熟的脂肪细胞RNA分离，用于基因表达研究，从而可以进行剖析这些细胞群之间相互作用的研究。简而言之，将 VAT 活检洗涤、机械切碎并消化以产生单细胞悬浮液。离心后，通过浮选从SVF沉淀中分离成熟的脂肪细胞。RNA 提取方案可确保从脂肪细胞中获得高产量的总 RNA（包括 miRNA），用于下游表达测定。同时，SVF细胞用于通过流式细胞术分析表征巨噬细胞亚群（促炎和抗炎表型）。

引言

白色脂肪组织不仅由脂肪细胞或脂肪细胞组成，还由称为基质血管部分 （SVF） 的非脂肪细胞组组成，它包含由巨噬细胞、其他免疫细胞（如调节性 T 细胞 （Tregs） 和嗜酸性粒细胞、前脂肪细胞和成纤维细胞组成的异质细胞群，周围环绕着血管和结缔组织 ^1,2.脂肪组织 （AT） 现在被认为是一种器官，它通过不同细胞产生并释放到组织中的脂肪因子、细胞因子和 microRNA 来调节与代谢和炎症相关的生理过程，具有自分泌、旁分泌和内分泌作用 ^3,4。在人类中，白色脂肪组织包括皮下脂肪组织 （SAT） 和内脏脂肪组织 （VAT），它们之间具有重要的解剖学、分子、细胞和生理学差异 ^2,5。SAT 占人类 AT 的 80%，而 VAT 位于腹腔内，主要在肠系膜和网膜中，代谢更活跃⁶。此外，VAT是一种内分泌器官，分泌介质对体重、胰岛素敏感性、脂质代谢和炎症有重大影响。因此，增值税累积会导致腹部肥胖和肥胖相关疾病，如 2 型糖尿病、代谢综合征、高血压和心血管疾病风险，是肥胖相关死亡率的更好预测指标 6,7,8,9。

在稳态条件下，脂肪细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞通过分泌抗炎介质来合作维持VAT代谢¹⁰。然而，过度的VAT膨胀会促进活化的T细胞、NK细胞和巨噬细胞的募集。事实上，在瘦增值税中，巨噬细胞的比例为 5%，而在肥胖症中，该比例上升到 50%，巨噬细胞从抗炎表型到促炎表型的两极分化，产生慢性炎症环境^10,11。

由于肥胖大流行，出现了数量惊人的报告，涉及不同的增值税研究主题，包括脂肪细胞生物学、表观遗传学、炎症、内分泌特性和作为细胞外囊泡的新兴领域等 8,10,12,13。然而，尽管VAT环境是由脂肪细胞与常驻或到达的巨噬细胞之间的串扰来定义的，但大多数研究只关注一个细胞群，并且关于这些细胞在VAT中的相互作用及其病理生理学后果的信息很少^11,14。此外，针对AT中脂肪细胞-巨噬细胞相互作用的有价值的研究是使用缺乏体内启动条件的细胞系^{进行的11,14,15}。剖析这些细胞在VAT中的相互作用或特定贡献的合适策略需要从同一脂肪活检中分离出两种细胞类型，以进行体外测定，以尽可能相似地反映调节VAT代谢的体内特性。

尽管基于机械力的非酶解离方法可确保最小的操作，但如果目的是研究 SVF 细胞，则不能使用这些方法，因为与酶法相比，它们的细胞回收效率较低，细胞活力较低，并且需要更大的组织体积^16,17.使用胶原酶进行酶促消化是一种温和的方法，可以充分消化纤维组织（如 WAT¹⁸）的胶原蛋白和细胞外基质蛋白，并且经常在胰蛋白酶无效或有害^时使用19。该方案提供了基本的故障排除指南，使用胶原酶消化技术，在单个过程中从人VAT活检中有效分离活的成熟脂肪细胞和SVF细胞，提供信息以确保来自成熟脂肪细胞（包括microRNA）的总RNA的高产量（数量、纯度和完整性），用于下游表达应用。同时，该方案经过优化，可通过对多个膜结合标记物进行染色来鉴定 SVF 细胞中的巨噬细胞亚群，以便通过流式细胞术²⁰ 进行进一步分析。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

该协议已获得 Instituto Nacional de Perinatologia （212250-3210-21002-06-15） 的 IRB 批准。参与是自愿的，所有登记的妇女都签署了知情同意书。

1.内脏脂肪组织收集

1. 在剖宫产期间通过部分网膜切除术对足月无产单胎妊娠的健康成年女性进行增值税活检。
2. 子宫闭合和止血后，继续确定更大的网膜并将其在湿敷上伸展。暴露的 AT 是增值税。
3. 找到最大的血管，并沿着一条 7 x 5 厘米的假想线到达大网膜底部。
4. 确定一个缺血区，并使用凯利镊子钻进VAT的外侧。
5. 使用 Ochsner 镊子夹住钻孔 VAT 区域的近端和远端，并使用 Metzenbaum 剪刀切割组织。
6. 用黑色丝绸 1 号系住大网膜。
7. 取出 Ochsner 镊子并评估止血情况。
8. 将VAT活检放入无菌容器中，并立即将其运送到实验室。

2.内脏脂肪组织的酶消化和成熟脂肪细胞和基质血管部分细胞的分离

1. 称量 VAT 活检并用 1x PBS pH 7.4 冲洗。
2. 切下 4 克增值税，用剪刀在解剖盘中将组织切成小块。
3. 将碎增值税转移到无菌的 50 mL 离心管中，加入 20 mL PBS，轻轻摇晃以除去多余的红细胞。
4. 丢弃 PBS 并重复该过程两次。
5. 将 VAT 转移到新的无菌 50 mL 离心管中，并加入 25 mL 消化溶液（0.25% II 型胶原酶、5 mM 葡萄糖、1.5% PBS 白蛋白溶液）。
6. 在37°C下以125rpm的轨道振荡器孵育60分钟。
7. 将消化的组织通过三层纱布过滤到新的无菌 50 mL 离心管中。
8. 在4°C下以200× g 离心5分钟。
9. 获得两个阶段，一个对应于成熟脂肪细胞的上阶段，而SFV细胞保留在沉淀中。使用移液管将成熟的脂肪细胞轻轻转移到新的无菌 50 mL 离心管中。
10. 加入20mL冷PBS，轻轻摇动，并在4°C下以200× g 离心5分钟。
11. 丢弃 PBS 并重复该过程两次。
12. 使用移液管将成熟的脂肪细胞轻轻转移到 1.5 mL DNase-RNase free 微量离心管中。
13. 在4°C下以200× g 离心1分钟，并使用P200微量移液管除去多余的PBS。如有必要，请重复此步骤。
14. 将 300 μL 成熟脂肪细胞悬浮液轻轻转移到 1.5 mL 无 DNase-RNase 微量离心管中。将成熟的脂肪细胞储存在-80°C直至RNA提取。
    注意:脂肪细胞不形成颗粒。
15. 分离脂肪细胞后（步骤2.9），用移液管吸出大部分消化溶液，将SVF沉淀保持在试管底部。
16. 使用移液管将装有 SVF 细胞的沉淀转移到新的 50 mL 离心管中。
17. 轻轻洗涤细胞沉淀，通过上下移液重悬于20mL冷的1x PBS中。
18. 在4°C下以800× g 离心5分钟，并通过倾析迅速弃去上清液。
19. 通过重复步骤 2.17 和 2.18 进行第二次洗涤。
20. 向 SVF 沉淀中加入 5 mL 平衡至室温 （RT） 的红细胞裂解缓冲液，并通过重复移液悬浮液。不要涡流。
21. 在室温下孵育5分钟，并以800× g离心5分钟。使用移液管小心地取出上清液并妥善处理。
22. 为了中和裂解缓冲液，加入 10 mL 冷 1x PBS 并轻轻混合，直至细胞沉淀分解。
23. 以 800 x g 离心 5 分钟以获得 SVF 沉淀并弃去 PBS。在试管底部应该可以看到一个白色颗粒。
24. 通过反复移液将细胞重悬于室温下的 5 mL 1x PBS 中，并通过三层纱布过滤到新的 50 mL 锥形管中。随后，这些细胞将用于通过流式细胞术进行巨噬细胞亚群表征。

3. 从成熟脂肪细胞中提取RNA

1. 准备一个干净的区域，使用RNase去污喷雾以避免RNA降解。使用一组为RNA程序保留的移液器。所有使用的试管和吸头都应不含 RNase。
2. 如果将成熟的脂肪细胞悬浮液（第2.14节）储存至-80°C，则将其解冻在4°C。
   注意: 避免多次冻融循环。
3. 通过加入 1,000 μL 酸-胍-苯酚基试剂裂解细胞，并与 P1000 微量移液管充分混合以匀浆。
4. 在室温下孵育5分钟以促进核蛋白复合物的解离。
5. 在室温下以12,000× g 离心细胞裂解物5分钟。将获得三个阶段:对应于脂肪细胞脂质的上相（黄色），对应于核酸的中相（粉红色）和沉淀（细胞碎片）。
6. 使用P200微量移液器小心地去除脂质层。
7. 将中间相转移到新的 2 mL 管中，避免脂质残留和沉淀干扰（约 700 μL）。

4. 纯化总RNA，包括microRNA

注:使用基于柱的总RNA纯化方法获得高质量的总RNA。

1. 从第3.7节向样品中加入等体积的乙醇（95%-100%），约700μL，并用手将试管倒置混合10秒。
2. 将 700 μL 混合物转移到插入收集管的色谱柱中，离心并弃去流出物。
3. 重新加载色谱柱并重复步骤 4.2。
4. 将色谱柱转移到新的收集管中。
5. 向色谱柱和离心机中加入 400 μL 预洗缓冲液。丢弃流通并重复此步骤。
6. 向色谱柱中加入700μL洗涤缓冲液，离心2分钟。
7. 小心地将色谱柱转移到无核酸酶的管中。
8. 将 50 μL 无核酸酶水直接加入柱基质中，并通过离心洗脱 RNA。使用 200 μL 微量离心管制备 10 μL 等分试样。
9. 立即将等分试样放在冰上，并使用其中一种来确定RNA浓度和纯度。
10. 制备 5 μL 总 RNA 的等分试样，调整至 100 ng/μL，以测量 RNA 完整性和 microRNA 浓度。
11. 储存在-80°C直至使用。

5.成熟脂肪细胞RNA浓度、纯度和完整性的测定;microRNA定量检测

注意:使用紫外-可见分光光度计进行RNA浓度和纯度测定;使用RNA质控分析仪进行RNA完整性和miRNA定量。

1. 用分子级水清洗样品读数仪并擦拭。
2. 加载 2 μL 洗脱水（空白），将设置更改为 RNA，然后单击 空白 按钮。
3. 加载 2 μL 样品，然后单击 "测量 "按钮。
4. 读数完成后，记录A260 / A280和A260 / A230比率以及RNA的量（ng / μL）（图1A）。
   注意:OD260/OD280 和 OD260/OD230 比值约为 2.0 的 RNA 被认为是纯的。
5. 按照制造商的说明使用RNA完整性试剂盒测量RNA完整性数（RIN）（图1B）。
   注意:RIN =10 对应于完整的 RNA，而 RIN ≤ 3.0 表示高度降解的 RNA。对于表达微阵列芯片或 RT-qPCR，请使用带有 RIN ≥ 6.0 的 RNA。
6. 按照制造商的说明，使用小型RNA试剂盒确定microRNA的浓度和百分比（图1C）。
   注意:为避免高估小RNA和micro RNA，请使用RIN ≥ 6.0的RNA样品。

6. 基质血管部分细胞的计数和活力

1. 将 10 μL SVF 细胞悬浮液（第 2.24 节）稀释到 90 μL 0.4% 台盼蓝溶液（最终稀释度为 1:10）中，并将 10 μL 涂入标准血细胞计数器中。
2. 在计数室角落的四个方格中仔细计数活细胞，不包括死细胞。
3. 确定原始悬浮液中存在的细胞浓度:细胞浓度 = 总细胞计数/4 x 稀释因子 （10） x 10,000 = 细胞/mL
4. 要计算获得的细胞产量（每克组织的细胞数），请将细胞浓度乘以原始总样品体积（以 mL 为单位），然后除以消化组织的重量（以克为单位）。
5. 评估细胞活力为活细胞的百分比，如下所示:%活力=（活细胞数/细胞总数）x 100。

7. 基质血管部分巨噬细胞亚群的表征

1. 将总共 1 x 10⁶ 个 SVF 细胞/mL 转移到用于流式细胞术的 5 mL 圆底聚丙烯试管中，并在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。
2. 小心涡旋以松开沉淀，并在室温下将细胞重悬于100μL 1x PBS中。
3. 添加对细胞表面抗原具有特异性的每种荧光染料偶联单克隆抗体的预滴定最佳浓度;轻轻混合，在室温下黑暗孵育15分钟。
4. 加入过量的冷1x PBS（≈1mL），并在4°C下以400× g 离心SVF5分钟。
5. 通过倾析快速弃去上清液。注意不要打扰颗粒。
6. 加入 500 μL 1x 裂解溶液，在室温下孵育 15 分钟，保护试管免受直射光照射。
7. 在4°C下以400× g 离心5分钟后除去溶液，并在2-8°C的黑暗中储存直至数据采集。
8. 在采集之前，以低速彻底涡旋细胞以减少聚集。
9. 在室温下将SVF沉淀重悬于5 mL鞘液中，然后通过三层纱布过滤到新的5 mL圆底聚丙烯试管中，然后通过流式细胞术进行分析，以减少细胞分选仪管路的堵塞。
10. 在分析之前短暂涡旋每个试管。
11. 从感兴趣的样本中获取数据。对于流分析，至少计算 10,000 个事件。
    注意:如果使用细胞分选流式细胞仪，请分离巨噬细胞以应用于后续研究。

8. 门控策略

1. 绘制高度或宽度与前向散射 （FSC） 面积的关系图，以确定单线态群体（图 2A）。
2. 选择针对FSC绘制侧散射（SSC）区域的细胞，丢弃细胞碎片（图2B）。
3. 从选定的细胞中，将表达CD45的群体鉴定为造血细胞（图2C），将CD45 / CD14双阳性细胞鉴定为巨噬细胞（图2D）。
4. 从CD45 + / CD14 +巨噬细胞中，检测阴性和阳性HLA-DR细胞（图2E）。
   注意:包括抗体检测组合的补偿控制，并调整适合检测组合的多色流式细胞仪上的光谱重叠。我们使用配备三种激光器（405 nm 紫色激光器、488 nm 蓝色激光器和 640 nm 红色激光器）的细胞仪和用于指示荧光染料的检测器进行流式细胞术分析。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

该方案描述了一种酶促方法，使用胶原酶消化，然后进行差异离心，以在单个过程中从部分网膜切除术后从健康孕妇获得的VAT活检中分离出活的成熟脂肪细胞和SVF细胞。在这种情况下，我们使用脂肪细胞进行RNA提取，使用SVF进行巨噬细胞表型分析。

RNA提取方案能够从成熟脂肪细胞中获得具有足够纯度、高完整性的RNA和microRNA（图1）。通过RNA质量控制分?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

VAT在代谢调节和炎症中起着至关重要的作用。人们对脂肪细胞和免疫细胞在与肥胖相关的慢性炎症中的作用越来越感兴趣，这导致了不同技术的发展，以分离 AT 中存在的 SVF 和脂肪细胞。然而，大多数技术不允许在一次手术中从相同的 VAT 活检中获得可用于下游应用的这两组不同的细胞，这对于脂肪细胞和 SVF 细胞之间相互作用的研究可能至关重要。因此，我们实施了该协议，该协议提供了详细的...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	-
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	-
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	-
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	-	-	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	-
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	-	-	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	-	-	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	-
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	-
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	-
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	-
Manual cell counter	-	-	-
Mayo dissecting scisors	-	-	Stainless steel
Microcentrifuge	-	-	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	-
Orbital shaker	-	-	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	-
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	-	-	-
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	-	-	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	-	-	-
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	-	-	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	-