RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

요약

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

초록

내장 지방 조직(VAT)은 주로 성숙한 지방 세포와 기질 혈관 분획(SVF) 세포로 구성된 활성 대사 기관으로, 대사, 호르몬 및 면역 과정을 조절하는 다양한 생체 활성 분자를 방출합니다. 현재로서는 이러한 과정이 지방 조직 내에서 어떻게 조절되는지는 불분명합니다. 따라서 지방 조직의 병태생리학에 대한 각 세포 집단의 기여도를 평가하는 방법의 개발이 중요합니다. 이 프로토콜은 분리 단계를 설명하고 콜라겐분해효소 효소 분해 기술을 사용하여 단일 공정에서 인간 VAT 생검에서 생존 가능한 성숙 지방세포 및 SVF를 효율적으로 분리하는 데 필요한 문제 해결 지침을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 대식세포 서브세트를 식별하고 유전자 발현 연구를 위한 성숙한 지방 세포 RNA 분리를 수행하도록 최적화되어 있어 이러한 세포 집단 간의 상호 작용을 해부하는 연구를 수행할 수 있습니다. 간단히 말해서, VAT 생검은 세척하고, 기계적으로 다지고, 소화되어 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 원심분리 후, 성숙한 지방세포는 SVF 펠릿에서 부유선광에 의해 분리됩니다. RNA 추출 프로토콜은 다운스트림 발현 분석을 위해 지방세포에서 총 RNA(miRNA 포함)의 높은 수율을 보장합니다. 동시에 SVF 세포는 유세포 분석을 통해 대식세포 하위 집합(전염증 및 항염증 표현형)을 특성화하는 데 사용됩니다.

서문

백색 지방 조직은 지방 세포 또는 지방 세포뿐만 아니라 대식세포, 조절 T 세포(Tregs)와 같은 기타 면역 세포, 호산구, 지방세포, 섬유아세포로 구성된 이질적인 세포 집단을 포함하는 기질 혈관 분획(SVF)으로 알려진 비지방 세포 분획으로 구성되어 있으며 혈관 및 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다 ^1,2. 지방 조직(AT)은 이제 다른 세포에서 생성되어 조직으로 방출되는 아디포카인, 사이토카인 및 마이크로RNA를 통해 대사 및 염증과 관련된 생리적 과정을 조절하는 기관으로 간주되며 자가분비, 파라크린 및 내분비 효과 ^3,4. 인간의 경우 백색 지방 조직은 피하 지방 조직(SAT)과 내장 지방 조직(VAT)으로 구성되며 중요한 해부학적, 분자적, 세포적, 생리학적 차이가 있습니다 ^2,5. SAT는 인간 AT의 최대 80%를 차지하는 반면, VAT는 주로 장간막과 난막에 있는 복강 내에 위치하며 신진대사가 더 활발하다⁶. 또한 VAT는 체중, 인슐린 감수성, 지질 대사 및 염증에 상당한 영향을 미치는 매개체를 분비하는 내분비 기관입니다. 결과적으로, 부가가치세 누적은 복부 비만과 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈압 및 심혈관 질환 위험과 같은 비만 관련 질병을 유발하며, 이는 비만 관련 사망률을 더 잘 예측할 수 있는 지표이다 6,7,8,9.

항상성 상태에서는 지방세포, 대식세포 및 기타 면역세포가 협력하여 항염증 매개체의 분비를 통해 VAT 대사를 유지한다¹⁰. 그러나 과도한 VAT 확장은 활성화된 T 세포, NK 세포 및 대식세포의 모집을 촉진합니다. 실제로, 희박한 VAT에서 대식세포의 비율은 5%인 반면, 비만에서는 이 비율이 50%까지 상승하며, 대식세포가 항염증제에서 전염증성 표현형으로 분극되어 만성 염증 환경을 생성합니다^10,11.

비만 팬데믹의 결과로, 지방세포 생물학, 후성유전학, 염증, 내분비 특성, 세포외 소포체와 같은 신흥 부위 등 다양한 VAT 연구 주제를 다루는 보고서가 놀라울 정도로 많이 나왔습니다 8,10,12,13. 그러나 VAT 환경은 지방세포와 상주 또는 도착하는 대식세포 간의 혼선에 의해 정의되지만, 대부분의 연구는 하나의 세포 집단에만 초점을 맞추었으며 VAT에서 이러한 세포의 상호 작용과 병태생리학적 결과에 대한 정보는 부족합니다^11,14. 더욱이, AT에서 지방세포-대식세포 상호작용을 다루는 가치 있는 연구는 in vivo 프라이밍 조건 11,14,15가 결여된 세포주를 사용하여 수행되었다. VAT에서 이러한 세포의 상호 작용 또는 특정 기여도를 해부하기 위한 적절한 전략은 VAT 대사를 조절하는 생체 내 특성을 최대한 유사하게 반영하는 in vitro 분석을 수행하기 위해 동일한 지방 생검에서 두 세포 유형을 분리해야 합니다.

AT를 파괴하기 위한 기계적 힘에 기반한 비효소적 해리 방법은 최소한의 조작을 보장하지만, 이러한 방법은 효소 방법에 비해 세포 회수 효율이 낮고 세포 생존율이 낮고 더 많은 양의 조직이 필요하기 때문에 SVF 세포를 연구하는 것이 목적인 경우 사용할 수 없습니다^16,17. 콜라겐분해효소를 이용한 효소 분해는 WAT¹⁸과 같은 섬유조직의 콜라겐 및 세포외 기질 단백질을 적절하게 소화할 수 있는 부드러운 방법이며, 트립신이 효과가 없거나 손상을 줄 때 자주 사용된다¹⁹. 이 프로토콜은 콜라겐분해효소 효소 분해 기술을 사용하여 단일 공정에서 인간 VAT 생검에서 생존 가능한 성숙 지방세포 및 SVF 세포를 효율적으로 분리하기 위한 근본적인 문제 해결 지침을 제공하며, 다운스트림 발현 애플리케이션을 위해 microRNA를 포함한 성숙한 지방세포에서 총 RNA의 높은 수율(양, 순도 및 무결성)을 보장하기 위한 정보를 제공합니다. 동시에, 프로토콜은 유세포 분석법⁽²⁰)에 의한 추가 분석을 위해 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 SVF 세포에서 대식세포 하위 집합을 식별하도록 최적화되어 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15)의 IRB에 의해 승인되었습니다. 참여는 자발적이었으며, 등록된 모든 여성들은 정보에 입각한 동의서에 서명했다.

1. 내장 지방 조직 수집

1. 분만 없이 단태 임신을 한 건강한 성인 여성의 제왕절개 중 부분 자궁 절제술을 통해 VAT 생검을 받습니다.
2. 자궁을 폐쇄하고 지혈을 한 후, 더 큰 오멘텀을 확인하고 습식 찜질로 확장합니다. 노출된 AT는 VAT입니다.
3. 가장 큰 혈관을 찾아 7 x 5cm의 가상의 선을 따라 더 큰 오멘텀 기저부까지 이동합니다.
4. 혈관 구역을 식별하고 Kelly 겸자를 사용하여 VAT의 바깥쪽을 뚫습니다.
5. Ochsner 집게를 사용하여 VAT가 뚫린 영역에서 근위부 및 원위부를 고정하고 Metzenbaum 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.
6. 블랙 실크 넘버 1로 더 큰 오멘텀을 묶습니다.
7. Ochsner 겸자를 제거하고 지혈을 평가합니다.
8. VAT 생검을 멸균 용기에 넣고 즉시 실험실로 운반합니다.

2. 내장 지방 조직의 효소 소화 및 성숙한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 세포의 분리

1. VAT 생검의 무게를 측정하고 1x PBS pH 7.4로 헹굽니다.
2. 4g의 VAT를 자르고 가위를 사용하여 해부 트레이에서 조직을 작은 조각으로 다집니다.
3. 다진 VAT를 멸균 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 PBS 20mL를 추가한 다음 부드럽게 흔들어 과잉 적혈구를 제거합니다.
4. PBS를 버리고 절차를 두 번 반복합니다.
5. VAT를 새 멸균 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 25mL의 분해 용액(0.25% 콜라겐분해효소 유형 II, 5mM 포도당, PBS의 1.5% 알부민)을 추가합니다.
6. 37°C에서 125 rpm의 오비탈 쉐이커에서 60분 동안 배양합니다.
7. 3겹의 거즈를 통해 소화된 조직을 여과하여 새로운 멸균 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
8. 4 °C에서 5분 동안 200 x g 의 원심분리기.
9. 두 개의 상이 얻어지는데, 성숙한 지방 세포에 해당하는 상부 단계이고 SFV 세포는 펠릿에 남아 있습니다. 전사 피펫을 사용하여 성숙한 지방세포를 새로운 멸균 50mL 원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
10. 차가운 PBS 20mL를 넣고 부드럽게 흔든 다음 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. PBS를 버리고 절차를 두 번 반복합니다.
12. 이송 피펫을 사용하여 성숙한 지방세포를 1.5mL DNase-RNase가 없는 미세원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
13. 4°C에서 1분 동안 200 x g 으로 원심분리하고 P200 마이크로피펫을 사용하여 여분의 PBS를 제거합니다. 필요한 경우 이 단계를 반복합니다.
14. 300μL의 성숙한 지방 세포 현탁액을 1.5mL DNase-RNase가 없는 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 옮깁니다. 성숙한 지방세포는 RNA 추출까지 -80°C에서 보관합니다.
    알림: 지방 세포는 펠릿을 형성하지 않습니다.
15. 지방 세포가 분리되면(2.9단계) SVF 펠릿을 튜브 바닥에 유지하면서 이송 피펫으로 대부분의 분해 용액을 흡인합니다.
16. SVF 셀이 있는 펠릿을 이송 피펫을 사용하여 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
17. 피펫팅을 위아래로 하여 20mL의 차가운 1x PBS에 재현탁하면서 셀 펠릿을 부드럽게 세척합니다.
18. 800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 후 디캔테이션을 통해 상층액을 빠르게 제거합니다.
19. 2.17 및 2.18 단계를 반복하여 두 번째 세척을 수행하십시오.
20. 실온(RT)과 평형을 이룬 적혈구 용해 완충액 5mL를 SVF 펠릿에 추가하고 반복적인 피펫팅으로 현탁시킵니다. 소용돌이치지 마십시오.
21. 상온에서 5분간 배양하고 800 x g에서 5분간 원심분리합니다. 전사 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 적절하게 폐기하십시오.
22. 용해 완충액을 중화하기 위해 차가운 1x PBS 10mL를 추가하고 세포 펠릿이 분해될 때까지 부드럽게 혼합합니다.
23. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 SVF 펠릿을 얻고 PBS를 버립니다. 튜브 바닥에 흰색 펠릿이 보여야 합니다.
24. 반복적인 피펫팅을 통해 RT에서 5mL의 1x PBS에 세포를 재현탁시키고 3겹의 거즈를 통해 여과하여 새로운 50mL 코니컬 튜브에 넣습니다. 그 후, 이 세포는 유세포 분석에 의한 대식세포 하위 집단 특성 분석에 사용됩니다.

3. 성숙한 지방세포에서 RNA 추출

1. RNA 분해를 방지하기 위해 RNase 오염 제거 스프레이를 사용하여 깨끗한 영역을 준비합니다. RNA 절차용으로 예약된 피펫 세트를 사용하십시오. 사용된 모든 튜브와 팁은 RNase가 없어야 합니다.
2. 성숙한 지방 세포 현탁액(섹션 2.14)을 -80°C에 보관한 경우 4°C에서 해동합니다.
   알림: 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.
3. 1,000μL의 산-구아니디늄-페놀 기반 시약을 첨가하여 세포를 용해하고 P1000 마이크로피펫과 완전히 혼합하여 균질화합니다.
4. 핵단백질 복합체의 해리를 촉진하기 위해 RT에서 5분 동안 배양합니다.
5. RT에서 12,000 x g 에서 5분 동안 원심분리기 셀 용해물. 지방세포 지질에 해당하는 상부기(노란색), 핵산에 해당하는 중간기(분홍색), 펠릿(세포 파편)의 3단계가 얻어집니다.
6. P200 마이크로피펫을 사용하여 지질층을 조심스럽게 제거합니다.
7. 중간상을 새로운 2mL 튜브로 옮겨 지질 잔류물과 펠릿 교란(약 700μL)을 방지합니다.

4. microRNA를 포함한 전체 RNA의 정제

참고: 컬럼 기반 total RNA 정제 방법은 고품질 total RNA를 얻는 데 사용됩니다.

1. 섹션 3.7의 샘플에 동일한 부피의 에탄올(95%–100%)(약 700μL)을 추가하고 튜브를 10초 동안 손으로 뒤집어 혼합합니다.
2. 혼합물 700μL를 수집 튜브에 삽입된 컬럼으로 옮기고 원심분리한 후 플로우 스루를 폐기합니다.
3. 열을 다시 로드하고 4.2단계를 반복합니다.
4. 컬럼을 새 수집 튜브로 옮깁니다.
5. 400μL의 사전 세척 버퍼를 컬럼과 원심분리기에 추가합니다. 플로우 스루를 버리고 이 단계를 반복합니다.
6. 700μL의 세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 2분 동안 원심분리합니다.
7. 컬럼을 뉴클레아제가 없는 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
8. 50μL의 뉴클레아제가 없는 물을 컬럼 매트릭스에 직접 추가하고 원심분리를 통해 RNA를 용리합니다. 200μL 미세분리 튜브를 사용하여 10μL의 부분 표본을 준비합니다.
9. 즉시 부분 표본을 얼음 위에 놓고 그 중 하나를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정합니다.
10. RNA 무결성 및 microRNA 농도를 측정하기 위해 100ng/μL로 조정된 총 RNA 5μL의 부분 표본을 준비합니다.
11. 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

5. 성숙한 지방 세포 RNA 농도, 순도 및 무결성 측정; microRNA 정량 분석

참고: RNA 농도 및 순도 측정은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 수행됩니다. RNA 무결성 및 miRNA 정량화는 RNA 품질 관리 분석기를 사용하여 수행됩니다.

1. 샘플 리더를 분자 등급의 물로 씻고 닦습니다.
2. 2μL의 용출수(블랭크)를 로드하고 설정을 RNA로 변경한 다음 블랭크 버튼을 클릭합니다.
3. 2 μL의 시료를 로드하고 측정 버튼을 클릭합니다.
4. 판독이 완료되면 A260/A280 및 A260/A230 비율과 RNA 양(ng/μL)을 기록합니다(그림 1A).
   참고: OD260/OD280 및 OD260/OD230 비율이 약 2.0인 RNA는 순수한 것으로 간주됩니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 RNA 무결성 키트를 사용하여 RNA 무결성 번호(RIN)를 측정합니다(그림 1B).
   참고: RIN =10은 원형(intact) RNA에 해당하고, RIN ≤ 3.0은 강하게 분해된 RNA를 나타냅니다. 발현 마이크로어레이 또는 RT-qPCR의 경우 RIN ≥ 6.0과 함께 RNA를 사용합니다.
6. 제조업체의 지침에 따라 소형 RNA 키트를 사용하여 microRNA의 농도와 비율을 측정합니다(그림 1C).
   참고: small 및 micro RNA의 과대 평가를 피하려면 RIN ≥ 6.0의 RNA 샘플을 사용하십시오.

6. 기질 혈관 분획 세포의 수 및 생존력

1. 10μL의 SVF 세포 현탁액(섹션 2.24)을 90μL의 0.4% 트리판 블루 용액(최종 희석 1:10)에 희석하고 표준 혈구분석기에 10μL를 적용합니다.
2. 죽은 세포를 제외하고 계수 챔버 모서리에 있는 4개의 사각형으로 생존 가능한 세포를 주의 깊게 계산합니다.
3. 원래 현탁액에 존재하는 세포 농도 측정: 세포 농도 = 총 세포 수/4 x 희석 계수 (10) x 10,000 = 세포/mL
4. 얻어진 세포 수율(조직 그램당 세포)을 계산하려면 세포 농도에 원래의 총 샘플 부피(mL)를 곱하고 분해된 조직의 무게(그램)로 나눕니다.
5. 세포 생존율을 살아있는 세포의 백분율로 평가합니다: % Viability = (Number of viable cells / Total number of cells) x 100.

7. 기질 혈관 분획에서 대식세포 subset의 특성화

1. 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 원심분리하여 유세포 분석 및 펠릿 세포를 위해 총 1 x 10⁶ SVF 세포/mL를 5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관으로 옮깁니다.
2. 소용돌이를 조심스럽게 풀어 펠릿을 풀고 RT에서 1x PBS의 100μL에 세포를 재현탁시킵니다.
3. 세포 표면 항원에 특이적인 각 형광 크롬 접합 단클론 항체의 사전 적정된 최적 농도를 추가합니다. 부드럽게 섞고 RT의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.
4. 여분의 차가운 1x PBS(≈ 1mL)를 추가하고 SVF를 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 디캔테이션으로 상층액을 빠르게 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
6. 500μL의 1x 용해 용액을 추가하고 직사광선으로부터 튜브를 보호하면서 RT에서 15분 동안 배양합니다.
7. 400 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리 한 후 용액을 제거하고 데이터가 수집 될 때까지 어두운 곳에서 2-8 °C에 보관하십시오.
8. 세포를 저속으로 완전히 소용돌이쳐 수집하기 전에 응집을 줄입니다.
9. SVF 펠릿을 RT에서 5mL의 시스 유체에 재현탁시킨 다음 유세포 분석으로 분석하기 전에 3겹의 거즈를 통해 새로운 5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관으로 여과하여 세포 분류기 라인의 막힘을 줄입니다.
10. 분석하기 전에 각 튜브를 잠깐 소용돌이치십시오.
11. 관심 있는 샘플에서 데이터를 수집합니다. 흐름 분석의 경우 최소 10,000개의 이벤트를 계산합니다.
    참고: 세포 분류 유세포 분석기를 사용하는 경우 후속 연구에 적용할 수 있도록 대식세포를 분리하십시오.

8. 게이팅 전략

1. 전방 산란(FSC) 영역에 대한 높이 또는 너비를 플로팅하여 단일항 모집단을 결정합니다(그림 2A).
2. FSC에 대해 Side Scatter (SSC) 영역을 플로팅하는 세포를 선택하고 세포 파편을 버립니다(그림 2B).
3. 선택된 세포에서 CD45를 조혈 세포로 발현하는 집단을 식별하고(그림 2C), CD45/CD14 이중 양성 세포를 대식세포로 식별합니다(그림 2D).
4. CD45+/CD14+ 대식세포에서 HLA-DR 세포의 음성 및 양성 세포를 검출합니다(그림 2E).
   NOTE: 항체 패널에 대한 보정 컨트롤을 포함하고 패널에 적합한 multicolor 유세포 분석기에서 스펙트럼 겹침을 조정합니다. 3개의 레이저(405nm 보라색 레이저, 488nm 청색 레이저, 640nm 적색 레이저)가 장착된 유세포분석기와 표시된 형광색소용 검출기를 사용하여 유세포 분석을 수행합니다.

결과

이 프로토콜은 부분 자궁 절제술 후 건강한 임산부로부터 얻은 VAT 생검에서 단일 공정으로 생존 가능한 성숙 지방 세포 및 SVF 세포를 분리하기 위해 콜라겐분해효소 분해 후 차등 원심분리를 사용하는 효소 방법을 설명합니다. 이 경우 RNA 추출을 위해 지방세포를 사용하고 대식세포 표현형을 위해 SVF를 사용합니다.

RNA 추출 프로토콜을 통해 적절한 순도의 RNA와 성숙한 지방 ?...

토론

VAT는 신진대사 조절과 염증에 중요한 역할을 합니다. 비만과 관련된 만성 염증에서 지방 세포와 면역 세포의 역할에 대한 관심이 증가함에 따라 AT에 존재하는 SVF와 지방 세포를 분리하는 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나 대부분의 기술에서는 단일 절차로 동일한 VAT 생검에서 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 이 두 가지 다른 세포 세트를 얻을 수 없으며, 이는 지방 세포와 SVF 세포 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	-
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	-
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	-
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	-	-	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	-
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	-	-	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	-	-	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	-
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	-
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	-
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	-
Manual cell counter	-	-	-
Mayo dissecting scisors	-	-	Stainless steel
Microcentrifuge	-	-	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	-
Orbital shaker	-	-	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	-
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	-	-	-
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	-	-	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	-	-	-
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	-	-	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	-