3D球形模型中癌细胞入侵的时限解荧光成像和分析

摘要

这里介绍了一个制造球形成像设备的协议。该设备可对癌细胞球体进行动态或纵向荧光成像。该协议还提供了一个简单的图像处理程序，用于分析癌细胞入侵。

摘要

癌细胞从原发性肿瘤侵入相邻的健康组织是转移的早期步骤。侵入性癌细胞构成重大临床挑战，因为一旦其传播开始，就不存在有效的消除方法。更好地了解调节癌细胞入侵的机制可能导致新疗法的发展。由于它们与肿瘤的生理相似性，嵌入胶原蛋白中的球形已被研究人员广泛利用，以研究癌细胞侵入细胞外基质（ECM）的机制。然而，这种检测受到（1）对球体嵌入ECM缺乏控制的限制：（2） 胶原蛋白 I 和玻璃底盘成本高，（3） 由于抗体和荧光染料的低效渗透以及 （4） 耗时的图像处理和数据量化，不可靠的免疫荧光标签。为了应对这些挑战，我们优化了三维 （3D） 球形协议，使用延时视频或纵向成像对嵌入胶原蛋白 I 中的荧光标记癌细胞进行成像，并分析癌细胞入侵情况。首先，我们描述了球形成像设备 （SID） 的制造，以可靠和最小的胶原蛋白 I 体积嵌入球体，从而降低了检测成本。接下来，我们为活体和固定球体的强荧光标记描述步骤。最后，我们提供了一个易于使用的斐济宏图像处理和数据量化。总之，这种简单的方法提供了一个可靠和负担得起的平台，以监测胶原蛋白I的癌细胞入侵。此外，此协议可以轻松修改，以满足用户的需求。

引言

在癌症进展过程中，癌细胞可以获得一种移动和侵入性表型，使它们能够逃离肿瘤质量并侵入周围的组织^1。最终，这些侵入性癌细胞可以在继发性器官内到达并生长，这个过程称为癌症转移^1。转移导致超过90%的癌症相关死亡^2.原因之一是，虽然局部肿瘤在临床上是可控的，但一旦发生转移性扩散，就不存在消除侵入性癌细胞的有效方法。因此，侵入性癌细胞的出现和从局部性疾病向侵入性疾病的过渡是一项重大的临床挑战。确定癌细胞如何启动和维持侵入行为可能导致新的有效疗法的发展。

3D球形模型是研究受控癌细胞的移动行为的理想平台，但生理相关条件^3。事实上，在这个测定中，癌细胞的球体嵌入细胞外基质（ECM），例如胶原蛋白I，它模仿了简化的肿瘤。然后，成像用于可视化癌细胞从球体侵入胶原蛋白基质。但是，多个挑战限制了此过程。

第一个挑战发生在嵌入步骤，液体胶原蛋白矩阵可以扩散到盘面，导致球体接触菜的底部。因此，球体中的细胞扩散到二维（2D）表面，打破了三维（3D）球形形态。增加胶原蛋白的体积是一种高效但成本高昂的解决方案。为了防止细胞在二维表面扩散，同时保持最小的胶原蛋白体积，我们开发了一个球形成像设备 （SID），将一个 1 毫米厚的 3 孔聚二甲基硅烷 （PDMS） 插入....

研究方案

1. 制造球形成像设备 （SID）， 以优化球形嵌入 （持续时间 1 天）

1. 使用 3D 打印机创建间隔器（图 1A、B和补充文件 1）。
2. 称出基聚合物的 10：1（wt/wt）比：塑料杯中的交叉链接器 [例如，20 克乙基苯基聚合物和 2 克硅树脂交叉连结剂，以创建聚二甲基硅氧烷 （PDMS）]。
3. 使用一次性移液器在塑料杯中彻底混合 PDMS 解决方案。
4. 将塑料杯放入真空室，从混合物中去除气泡。快速释放真空压力，清除困在混合物表面的少量空气，并消散剩余的气泡。
5. 在 100 °C 下孵化 3D 打印垫片 5 分钟，以提高其灵活性。
6. 用 100% 异丙醇擦拭两个玻璃板，用于彻底构建 PDMS 模具。如果玻璃板以前用于铸造 PDMS，请务必通过用剃刀刀片轻轻刮拭玻璃板并用 100% 异丙酚擦拭玻璃板来去除剩余的任何旧 PDMS。
7. 将 3D 打印隔板冲洗在两个干净的玻璃板之间，构建模具。
8. 使用玻璃板外缘的大粘合器夹密封模具。在底部边缘放置两个活页夹，在上角放置一个。
9. 检查模具的顶部，以确保垫片与玻璃板齐平。这保证了不会出现变形，并且将创建均匀的 PDMS 表。
   注意：如果产生的纸张厚度不均匀，则需要稍微调整夹子。
10. 切开一次性移液器的尖端（从尖端....

结果

由于其生物相容性，PDMS 被广泛用于限制井、邮票和模具的微压造，从而彻底改变了微模式和微流体设备。在此处描述的方法中，它用于创建 SID，可定制的井，可优化球形嵌入和成像过程。图 1说明了用于制造 SID 的主要组件。为了铸造 PDMS 模具，一个 1 毫米厚的隔板是 3D 打印（图 1A，B），放置在两个玻璃板之间，用大夹子密封。在板之?.......

讨论

3D 打印间隔器设计用于创建 1 毫米厚的 PDMS 纸张，然后可以按照实验应用的要求轻松创建各种形状的 PDMS。由于其制造的简单性和改变设计的自由度，这种 PDMS 铸造方法被选为小岛屿发展中国家的初始设计。如果需要大量 SID，则可以通过创建 3D 打印模具来提高生产效率，该模具已经包含带三个相同间隔孔的 PDMS 磁盘，并将工艺简化为一步。这将消除冲出每个磁盘以及随后的三个孔的需要，并减少.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Honeywell Fluka	60-014-44
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	SH30028.LS
16% paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	43368-9M
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	20012027
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
48-well plate	Falcon	T1048
Alexa Fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A20006
Anti cortactin antibody	Abcam	ab33333	1 to 200 dilution
Anti E-cadherin antibody	Invitrogen	13-1900	1 to 100 dilution
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)	Advanced Biomatrix	501050ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye	Invitrogen	C34552
Conical tubes	Falcon	352095
Coverslips	FisherBrand	12-548-5E
Disposable container	Staples		Plastic cups
Disposable transfer pipette	Thermo Scientific	202
DMEM	Fisher Scientific	11965118
Double-faced tape	Scotch
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bio-Techne	S11550
Fluoromount-G	eBioscience	00-4958-02
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882-100mL
Hoescht nuclear stain	Thermo Fischer	62249
Isopropanol	Thermo Fischer	S25371A
MatTek dish (glass bottom dish)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M6385-100G
MilliQ water
Penicilin/streptomycin solution	Thermo Fischer	15140122
Petri dish	Corning	353003
Pipet tips	Fisherbrand	02-707
Pipets	Gilson	F167300
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Primary antibodies, user specific
Rat Tail Collagen I	Corning	47747-218
Razor Blade	Personna	74-0001
Secondary antibodies, user specific
Slides	Globe Scientific	1354W-72
Sylgard 184 Silicone	Dow Corning	4019862
Tape	Scotch
Triton X100	Sigma Aldrich	10789704001
Tween 20	Sigma Aldrich	655204-100ML