Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Resumen

La invasión de células cancerosas del tumor primario a los tejidos sanos adyacentes es un paso temprano en la metástasis. Las células cancerosas invasivas plantean un gran desafío clínico porque no existe ningún método eficiente para su eliminación una vez que su diseminación está en marcha. Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la invasión de células cancerosas puede conducir al desarrollo de nuevas terapias potentes. Debido a su parecido fisiológico con los tumores, esferoides incrustados en colágeno he sido ampliamente utilizado por los investigadores para estudiar los mecanismos que rigen la invasión de células cancerosas en la matriz extracelular (ECM). Sin embargo, este ensayo está limitado por 1) la falta de control sobre la incrustación de esferoides en el ECM; (2) alto costo de los platos inferiores de colágeno I y vidrio, (3) etiquetado inmunofluorescente poco fiable, debido a la penetración ineficiente de anticuerpos y colorantes fluorescentes y (4) procesamiento de imágenes que consume mucho tiempo y cuantificación de los datos. Para hacer frente a estos desafíos, optimizamos el protocolo esferoide tridimensional (3D) para crear imágenes de células cancerosas etiquetadas fluorescentemente incrustadas en el colágeno I, ya sea usando videos de lapso de tiempo o imágenes longitudinales, y analizamos la invasión de células cancerosas. En primer lugar, describimos la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides (SID) para incrustar esferoides de forma fiable y en un volumen mínimo de colágeno I, reduciendo el costo del ensayo. A continuación, delineamos los pasos para el etiquetado robusto de fluorescencia de esferoides vivos y fijos. Por último, ofrecemos una macro de Fiji fácil de usar para el procesamiento de imágenes y la cuantificación de datos. En conjunto, esta metodología simple proporciona una plataforma confiable y asequible para monitorear la invasión de células cancerosas en el colágeno I. Además, este protocolo se puede modificar fácilmente para adaptarse a las necesidades de los usuarios.

Introducción

Durante la progresión del cáncer, las células cancerosas pueden adquirir un fenotipo motil e invasivo, lo que les permite escapar de la masa tumoral e invadir los tejidos circundantes^1. Con el tiempo, estas células cancerosas invasivas pueden alcanzar y crecer dentro de órganos secundarios, un proceso llamado metástasis del cáncer^1. La metástasis causa más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer^2. Una de las razones de esto es que, si bien los tumores localizados son clínicamente manejables, no existen métodos eficientes para la eliminación de las células cancerosas invasivas una vez que....

Protocolo

1. Fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides (SID) para optimizar la incrustación esferoide (duración 1 día)

1. Cree el espaciador utilizando una impresora 3D(Figura 1A, B y Archivo Complementario 1).
2. Pesar una relación de 10:1 (wt/wt) de polímero base: reticulador cruzado en una taza de plástico [por ejemplo, 20 g de polímero base etilbenzene y 2 g de reticulador de resina de silicona para crear polidimetillsiloxano (PDMS)].
3. Mezcle a fondo la solución PDMS en la taza de plástico con una pipeta desechable.
4. Coloque la taza de plástico en una cámara de vacío para eliminar las ....

Resultados

Debido a su biocompatibilidad, PDMS es ampliamente utilizado para la microfabricación de pozos de confinamiento, sellos y moldes, que revolucionaron los dispositivos micropatternantes y microfluídicos. En el método descrito aquí, se utiliza para crear SIDs, pozos personalizables que optimizan el procedimiento de incrustación e imágenes esferoides. La Figura 1 ilustra los componentes principales utilizados en la fabricación de los SID. Para fundar el molde PDMS, un espaciador de 1 mm d.......

Discusión

El espaciador impreso en 3D fue diseñado para crear láminas de 1 mm de grosor de PDMS que luego se pueden utilizar para crear fácilmente varias formas de PDMS, según lo requieran las aplicaciones experimentales. Debido a la simplicidad de su fabricación y la libertad de alterar el diseño, este método de fundición PDMS fue elegido para el diseño inicial del SID. Si se requiere un alto volumen de SIDs, la producción se puede hacer más eficiente mediante la creación de un molde impreso en 3D, que ya contiene dis.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Honeywell Fluka	60-014-44
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	SH30028.LS
16% paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	43368-9M
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	20012027
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
48-well plate	Falcon	T1048
Alexa Fluor 647 phalloidin	Life Technologies	A20006
Anti cortactin antibody	Abcam	ab33333	1 to 200 dilution
Anti E-cadherin antibody	Invitrogen	13-1900	1 to 100 dilution
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)	Advanced Biomatrix	501050ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye	Invitrogen	C34552
Conical tubes	Falcon	352095
Coverslips	FisherBrand	12-548-5E
Disposable container	Staples		Plastic cups
Disposable transfer pipette	Thermo Scientific	202
DMEM	Fisher Scientific	11965118
Double-faced tape	Scotch
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bio-Techne	S11550
Fluoromount-G	eBioscience	00-4958-02
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882-100mL
Hoescht nuclear stain	Thermo Fischer	62249
Isopropanol	Thermo Fischer	S25371A
MatTek dish (glass bottom dish)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Methyl cellulose	Sigma Aldrich	M6385-100G
MilliQ water
Penicilin/streptomycin solution	Thermo Fischer	15140122
Petri dish	Corning	353003
Pipet tips	Fisherbrand	02-707
Pipets	Gilson	F167300
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Primary antibodies, user specific
Rat Tail Collagen I	Corning	47747-218
Razor Blade	Personna	74-0001
Secondary antibodies, user specific
Slides	Globe Scientific	1354W-72
Sylgard 184 Silicone	Dow Corning	4019862
Tape	Scotch
Triton X100	Sigma Aldrich	10789704001
Tween 20	Sigma Aldrich	655204-100ML