使用有机催化工艺分馏木质纤维素生物质

摘要

OrganoCat 是一种在温和条件下将木质纤维素预处理和分馏成木质素、可发酵糖和纤维素果肉的方法。在以2，5-呋喃羧酸为催化剂的水和2-甲基四氢呋喃的生物双相溶剂体系中，有机Cat产物 被原位 分离，以实现直接的产品回收。

摘要

从石油基经济向更具可持续性和生物基经济的转变需要开发新的炼油厂概念，以维持原材料和能源的供应。对于这些新颖且可持续的生物精炼概念，使用符合绿色化学原理的催化剂和溶剂非常重要。因此，实施生物替代品可以是一个有希望的解决方案。本文介绍的木质纤维素预处理和分馏工艺-OrganoCat-是使用生物酸（例如2，5-呋喃二甲酸）作为催化剂将木质纤维素整合到其主要组分中的。半纤维素和其他非纤维素多糖通过稀释的酸选择性地解聚并溶解，而结晶纤维素则保留在固体纸浆中。在由生物2-甲基四氢呋喃组成的第二有机相存在 下，原位提取分离的木质素。该过程允许三种主要成分的高效分馏 - 木质素，纤维素和非纤维素糖。这有助于专注于木质素的质量，改善富含纤维素的纸浆的酶水解，以及具有低降解的温和非纤维素糖提取。

引言

化石资源的使用带来了巨大的技术进步，因为它们构成了许多对日常生活至关重要的产品的基础。然而，地球上石油和天然气等资源的限制以及与其开采有关的环境破坏，迫切需要替代品。木质纤维素生物质是碳基化学品的有希望的来源，因为它是可再生的，多功能的和碳中性的¹。木质纤维素基本上由三个主要部分组成:半纤维素，纤维素和木质素。其工业加工历史悠久。然而，已建立和广泛的工艺，例如造纸工业的亚硫酸盐和牛皮纸工艺，主要集中在纤维素在纸浆和造纸工业中的利用^2。从经济和环境的角度来看，需要对所有三种木质纤维素馏分进行全面估值，以使木质纤维素加工成化学品更有利可图。

在许多木质纤维素价值化策略中，木质素仅仅是一种副产品，经常被燃烧用于能量回收。目前，只有1-2%的工业生产的木质素用于生产混凝土添加剂，表面活性剂和香兰素³等增值产品。然而，它是芳烃的最大可再生来源，因此具有作为聚合物^4，碳纤维⁵和燃料²的基础的有希望的应用性能。木质素价值化的挑战在于其复杂的结构和多样性，这取决于源材料和提取条件。此外，由于其工艺条件，最普遍的木质纤维素分馏工艺在单体单元之间提供具有大量C-C键的磺化木质素。因此，市售木质素很难解聚。

已经开发了一系列不同的方法，这些方法侧重于所有三种馏分的整体利用，用于木质纤维素分馏。大多数工艺依赖于半纤维素的水解，无论是用稀释的酸和碱，还是利用水在高温下的自解。作为最探索的选择之一，有机溶剂工艺使用低沸点的有机溶剂，通常与水结合使用。该工艺的众所周知的变体包括使用50%乙醇的Alcell工艺和Organocell工艺，其在第一步中使用甲醇并在第二步中添加NaOH。使用甲酸或乙酸的酸性有机溶剂过程也被描述为^2。由于最近人们关注木质素作为主要生物精炼产品的升值，已经开发了新的方法，将木质素提取与后续或集成的转化步骤相结合，以产生更小的木质素化合物和更稳定和有价值的产品^6，7，8。

OrganoCat 木质纤维素分馏工艺 （OrganoCat） 基于水和 2-甲基四氢呋喃 （2-MTHF） 的两相体系⁹。此外，可回收的有机酸被用作催化剂，其在温和的温度下选择性地水解半纤维素。所有工艺化学品都可以以相对便宜的生物方式生产，这根据绿色化学¹⁰的原则降低了工艺对环境的影响。该工艺提供三个独立的产品流，有机相中含有木质素，水相中含有解聚的半纤维素糖，以及作为固体残留物的富纤维素纸浆。由于产品流可以很容易地分离，因此与单相方法相比，下游步骤、能源需求和材料成本可以显著降低。木质素具有相对较低的分子量和高数量的β-O-4键^11。所述解聚的半纤维素糖可用于发酵或转化为精细化学品^12。纤维素纸浆对于酶解聚非常容易获得^9。

最初的OrganoCat工艺使用草酸作为催化剂来分馏木质纤维素。然后草酸可以通过结晶⁹回收。然而，这增加了冷却反应和部分蒸发水的工艺成本。草酸的部分分解将进一步减少收入^13。因此，通过引入2，5-呋喃二甲酸（FDCA）作为催化剂^11来改进OrganoCat工艺。FDCA不仅具有足够的酸性来催化反应，而且还可以从葡萄糖中通过脱水得到5-羟甲基糠醛，然后用金属基催化剂或生物催化剂14，15，16，17氧化。虽然FDCA的酸度略低，但它具有比草酸更高的热稳定性。FDCA在室温下在水中的溶解度较低，这使得其在反应后可以从水相中直接回收。

OrganoCat工艺的放大生产成功发展到3L反应器^18。对OrganoCat木质素的进一步研究发现，与 n-己烷或 n-戊烷一起沉淀的反溶剂允许节能的木质素回收^19。可以获得具有不同分子量²⁰的木质素级分。本文提出了一种以FDCA为催化剂的木质纤维素生物质的可扩展一步法的完整制备方法。该过程在三个易于分离的产品流中产生提取的木质素，解聚的半纤维素和纤维素纸浆。

研究方案

注意:该过程可以在任何时候暂停，方法是将样品留在室温（几天）或冰箱中（长时间）。有关此协议中使用的材料的详细信息，请参阅材料 表 。

1. 山毛榉木颗粒

1. 使用带有10毫米筛子的切割机生成所需粒度的山毛榉木（Fagus sp.），并将颗粒在50°C下干燥至恒定质量（〜24小时），留下约10%的水的残留水分含量。

2. 木质纤维素分馏和病情检查

1. 木质纤维素预处理和分馏
   1. 在25 mL不锈钢高压反应器中，将500毫克山毛榉木（Fagus sp.）颗粒和78.0毫克（0.5毫摩尔，0.1米）FDCA悬浮在5毫升超纯水中，室温下。向悬浮液中加入5 mL 2-MTHF和搅拌棒，并关闭反应器。在加热板上以1500rpm的搅拌速度将反应器加热至160°C1小时。
   2. 让反应在冰水中冷却至室温，持续约10分钟。打开反应器，加入52.5μLNaOH溶液（蒸馏水中50重量%NaOH），并在室温和500rpm下在搅拌板上搅拌15分钟。
2. 有机相分离和木质素定量
   1. 离心混合物（室温，5分钟，1880× 克）。使用移液器将有机相（2-MTHF）转移到50 mL圆底烧瓶中。
   2. 在旋转蒸发器（40°C，200rpm，180 mbar）中蒸发有机相，直到获得固体和干燥的木质素级分。用分析天平称量确定木质素产量。将固体木质素储存在室温下以进行进一步分析。
3. 固体富纤维素纸浆和水相的分离
   1. 在漏斗中使用纤维素滤纸（孔径为17-30μm）过滤水相以分离富纤维素的纸浆，并将水相转移到5mL小瓶中。用3 x 25 mL水洗涤纸浆至中性pH值，并将洗涤溶液单独存放在100 mL烧杯中。将纸浆在80°C下干燥至恒定质量（〜24小时）。
   2. 用分析天平称量，确定干燥的纸浆产量。
4. FDCA水相的回收和分离
   1. 在恒定搅拌下分别调节水相和洗涤溶液的pH值，使用浓缩的HCl将溶液从步骤2.3分别调节至pH 1，同时在冰浴中冷却溶液。使用通用指示纸控制pH值。
   2. 过滤两种溶液中的沉淀固体（FDCA），混合残留物，并在80°C下干燥至恒定质量（〜24小时）。丢弃洗涤物。通过用分析天平称量来确定 FDCA 产量。
   3. 将水相转移到25 mL烧瓶中，并将其储存在4°C进行分析。
5. 用于糠醛定量的样品制备
   1. 执行单独的实验以确定糠醛的数量。重复步骤 2.1.1-2.2.1。
   2. 向收集的有机溶剂馏分中加入40mg 正癸烷作为内标，并储存进行分析。

3. 分析

1. 通过高效阴离子交换色谱和脉冲电化学检测（HPAEC-PAD）分析水相中的糖
   1. 用190μL蒸馏水稀释步骤2.4.3中收集的10μL水相。向稀释的样品中加入10μL2mM 2-脱氧-D-葡萄糖。
   2. 在流速为0.5 mL∙min^-1的单糖分离柱上进行单糖分离，并在用2 mM NaOH平衡10分钟后注入样品。用2 mM NaOH在18分钟内分离中性糖。之后，使用550 mM NaOH10分钟以分离糖醛酸。用800 mM NaOH冲洗色谱柱10分钟。
      注:软件将单糖的量标准化为内标的量，并使用不同单糖的标准校准曲线对其进行量化。
2. 木质素分析通过^1H-13C异核单量子相关核磁共振（^1H-13C-HSQC NMR）
   1. 将约50mg木质素溶解在0.5mL氘化二甲基亚砜（[d_6]DMSO）中，并将混合物转移到NMR管中。使用 400 MHz 光谱仪进行 ¹H-¹³C HSQC（测量时间为 220 分钟）NMR 测量。
   2. 使用光谱确定木质素中存在的键的类型。
      1. 将光谱的化学位移参考DMSO信号^（δ（1H）= 2.500 ppm;δ（13 C）= 39.52 ppm）。
      2. 在两个轴上执行手动相位校正，直到所有信号都为正，然后执行基线校正。
      3. 整合芳香族单元的信号和木质素的连接;化学位移见表1。
   3. 使用以下公式计算芳香单位（arom.）的总和:
      Σ（亚罗姆） = （S_2，6 / 2） + （（G₂ + G₅） / 2） + （H_2，6 / 2） （1）
      S_i 是对应于 2 和 6 个丁香基质子的信号上的积分，G_i 是对应于 2 和 5 个愈创木酚质子的信号上的积分，H_i 是对应于 2 和 6 个 p-羟基苯基质子的信号上的积分。
   4. 使用以下公式计算每个单位的百分比:
      S = （S_2，6/ 2） / Σ（亚罗姆） × 100% （2）
      G = （（G₂ + G₅） / 2） / Σ（亚胺） × 100% （3）
      H = （H_2，6 / 2） / Σ（亚胺） × 100% （4）
      S，G和H是每个100个单体单元中各自单体 - 丁香基-（S），愈创二酰基-（G）和对 -羟基苯基（H）-单体单元的百分比。
   5. 使用以下公式计算每 100 个单位的链接数:
      β-O-4连杆 = α β-O -4 / Σ（亚罗姆） × 100% （5）
      联动 = （α β-β + β β-β + γ β-β） / Σ（arom.） × 100% （6）
      联轴 = （α β-5 + β β-5 + γ β-5） / Σ（罗姆） × 100% （7）
      α、β和γ是对应于相应β-O-4-、β-β和β-5键的α、β和γ质子信号的信号上的积分。
      注:联动以每100个单体单元的联动形式给出。由于峰的重叠，仅使用质子信号α计算β- O-4。β-β和β-5连杆是使用相应连杆的所有信号计算的。
3. 凝胶渗透色谱 （GPC） 分析
   1. 将10mg干木质素和1mg葡萄糖（作为内标）溶解在1mL0.1M NaOH和0.01重量%NaN₃ 水溶液中，在1.5mL气相色谱（GC）-小瓶中。使用带隔膜的盖子关闭GC小瓶。
   2. 将100μL样品注入配备紫外检测器的高效液相色谱（HPLC）系统中，并监测λ = 280nm的波长。使用由预列编程温度分体/无分流注射器系统组成的系统，该系统具有极性二氧化硅（8 mm x 50 mm）和三个凝胶柱（8 mm x 300 mm，粒径:5 μm，标称孔宽:1000 Å），流速为1 mL min^-1。将获得的数据参考内标（葡萄糖）的信号。使用软件计算质量分布，参考266至65000 Da范围内的聚苯乙烯磺酸盐的外部校准。
4. 通过气相色谱进行糠醛定量
   1. 将20mg n-癸烷作为内标加入OrganoCat预处理的有机相中。将1 mL有机相转移到1.5 mL GC小瓶中。
   2. 使用30m柱将1μL该溶液注入气相色谱仪中，该柱具有极性聚氨酯乙二醇固定相和氦气作为载气，流速为1.5mL min^-1 和火焰电离检测器。将初始温度设置为50°C，然后以8°C升至¹ 至250°C，并在250°C下保持5分钟。
   3. 使用软件给出的积分 （Int） 和外部计算的校正因子 （cf） 对糠醛进行量化。
      1. 在1 mL 2-MTHF中制备1mg糠醛和5mg 正癸烷的样品，并使用上述程序将其注入GC中。修正系数计算如下:
         cf = （Int（n-癸烷） / m（n-癸烷）） / （Int（糠醛） / Int（糠醛）） （8）
      2. 使用校正因子通过以下公式计算未知样品中的糠醛量:
         m（糠醛） = m（n-癸烷） / int（n-癸烷） × cf × Int（糠醛） （9）
5. 富纤维素纸浆水解
   1. 使用1.5 mL小瓶在加热块中混合（见 材料表）对从OrganoCat预处理中获得的富纤维素残留物进行纸浆水解。
   2. 在1.5 mL小瓶中加入20mg富纤维素纸浆和10μL纤维素酶（60滤纸单位（FPU）mL^-1 和82个纤维素酶单位（CBU）mL^-1）到1mL柠檬酸盐缓冲液（pH = 4.5），并在50°C下摇动0小时，1小时或72小时。之后，将样品加热至99°C10分钟以使酶变性。
   3. 使用葡萄糖（己糖激酶）测定试剂盒测定葡萄糖浓度。

结果

木质纤维素预处理和分馏过程的一组典型条件OrganoCat（OrganoCat）使用0.1 M FDCA作为催化剂，生物质负载量为100g L^-1（ 山毛榉木，与水相相比），1小时的反应时间和160°C作为反应温度。山毛榉木的成分已在其他地方发表^21（ 约48%纤维素，27%半纤维素，26%木质素）。 图1 显示了在这组条件下提取的半纤维素水解物以及更长的反应时间（3小时）和更低的温度（140°C）。

使用更苛刻的条件， 例如，更高的温度和更长的反应时间，可能导致更高的提取收率，但也导致更多的产物降解 - 糠醛是木糖的降解产物，而5-（羟甲基）糠醛（5-HMF）是葡萄糖的相应降解产物。在产物中注意到更大量的糠醛（分布在水相和有机相之间），在160°C下的反应时间为3小时。 由于糖降解产物具有高度反应性，并且倾向于形成呋喃和糖的腐殖质低聚物 - 在较高温度下较短的反应时间可能被认为是高提取效率和低糖降解之间的良好折衷。

提取的木质素的量也与反应温度和时间直接相关。图2显示了提取的木质素的量，β-O-4-键合含量以及提取的木质素的质量平均摩尔质量。虽然提取的木质素产率随着反应时间的延长而增加，但当反应3小时而不是1小时时，完整的β-O-4-键的数量减少约一半。将反应温度从160°C降低到140°C对木质素的影响要小得多，导致产量略低，质量平均摩尔质量更小，β-O-4含量更高。

由于（行话）纤维素的酶解是制浆效率的常用指标，因此将商业纤维素混合物应用于由上述OrganoCat反应条件集产生的不同OrganoCat纸浆（图3）。由于纤维素酶没有针对底物进行优化，因此整体纤维素转化率无法与最先进的性能相提并论;但是，它允许将不同的纸浆相互比较。较长的反应时间对72小时后的初始反应时间和葡萄糖产率有显着影响，提高了约2.5倍。降低温度似乎显示出更小的影响，这意味着导致这种处理中酶消化率差异的主要因素是去木质化程度。

图1:以0.1 M 2，5-呋喃二甲酸为催化剂，100 g L^-1山毛榉木（与水相相比）在x轴¹¹上指示的不同反应温度和时间下，OrganoCat工艺中的糖提取和糠醛生产。所有实验一式三份进行。平均值以标准偏差显示。请点击此处查看此图的放大版本。

图2:以0.1 M 2，5-呋喃二甲酸为催化剂和100 g L^-1山毛榉木（与水相相比）在x轴¹¹上指示的不同反应温度和时间下，通过OrganoCat工艺提取的木质素的量和分析。木质素产量一式三份计算。平均值以标准偏差显示。分子质量和连锁来自具有代表性的单一实验。请点击此处查看此图的放大版本。

图3:纸浆的酶水解。在x轴上指示的不同反应温度和时间下，从OrganoCat水解未经处理的山毛榉木材和富纤维素纸浆的72小时（蓝色条）和100 g L^-1山毛榉木（与水相相比）72小时后的葡萄糖产量（蓝色条）和第一小时内的反应速率（灰条）。将纤维素酶在50°C下在Contrite缓冲液（pH 4.5）11中施加到不同的底物上长达72小时。所有实验一式三份进行。平均值以标准偏差显示。请点击此处查看此图的放大版本。

单位	移位δ （1H）（13C）	联动	移位δ （1H）（13C）
	[页码]		[页码]
S2，6	(6.95–6.46)(106.8–101.9)	α β-O-4	(5.08–4.69)(75.8–69.9)
G2	(7.12–6.72)(113.4–108.7)	α β-β	(4.72–4.58)(87.46–84.0)
G5	(7.04–6.51)(117.8–113.4)	β β-β	(3.35–3.11)(62.0–57.9)
H2，6	(7.01–6.8)(129.1–123.2)	γ β-β 1	(4.26–4.09)(73.0–70.0)
		γ β-β 2	(3.87–3.71)(73.0–70.0)
		α β-5	(5.51–5.41)(88.8–86.6)
		β β-5	(3.52–3.42)(54.0–52.1)
		γ β-5	(3.80–3.67)(64.1–62.1)

表1:通过^{1 H-13}C异核单量子相关核磁共振^（1H-13C-HSQC NMR）确定的化学位移，用于木质素中不同键。缩写:S =丁香基单元，G =愈创木酚单元，H =对羟基苯基单元。

讨论

所述的木质纤维素的分馏显示了半纤维素水解效率和选择性之间的权衡，以避免糖降解为呋喃，这取决于反应时间和温度（图1）。木质素提取同样受到更恶劣条件的影响。特别是β-O-4-键的减少和由于在较高温度和反应时间下的再冷凝而导致的质均分子量的提高，强调了必须做出的这种妥协。因此，反应时间和温度的选择是该木质纤维素分馏工艺的关键步骤。由于酶水解的效率似乎主要由FDCA催化的OrganoCat工艺中的去中成矿决定，因此最恶劣的加工条件提供了最容易获得的纸浆。工艺^{9、11、18、22}的其它变化，例如，使用不同的催化剂，表明催化剂的强度和反应溶液中的最终pH值对工艺效率的影响最大。对程序的修改，例如，用磷酸预膨胀，已被证明也具有有益的效果²²。然而，由于成分的多样性，工艺需要优化，这取决于不同的原料^21。考虑到整体工艺性能，必须考虑分离馏分的下游纯化，这就是为什么选择性起着重要作用的原因。与其他类似有机溶剂的工艺相比，OrganoCat使用双相水/ 2-MTHF系统，该系统在三个相对简单，独立的流中提供主要组件。这样，下游又可以进一步降低能源和设备成本，降低13、18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1200 HPLC system	Agilent	n.a.	was used for size exclusion chomatogaphy
2,5-furandicarboxylic acid	TCI Deutschland GmbH	F0710	Purity: >98.0%(T)(HPLC)
2-methyltetrahydrofuran	Carl Roth GmbH	6845.4	SOLVAGREEN ≥99 %, extra pure
Accellerase 1500	Provided by Genencor (60 FPU mL-1 and 82 CBU mL-1; 2300 AE Leiden, Netherlands)	n.a.	cellulase for pulp hydrolysis
beech wood (Fagus sp.)	local supplier	n.a.
BioTek Power Wave HT UV-Vis Spectrometer	BioTek Germany, 74177 Bad Friedrichshall, Germany	BT-RPRWI
Bruker AS400 (400 MHz) Spectrometer	Bruker, Billerica, MA 01821, USA	n.a.	HSQC-NMR analysis
CarboPac PA20 column	Dionex	302747	monosaccharide separator column for high-performance anion-exchange chromatography
centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000610
Focus GC	Thermo Fischer	n.a.	gas chromatograph
Glucose (hexokinase) assay kit	Sigma-Aldrich	GAHK20-1KT
GPC- precolumn PSS PolarSil in DMAc	PSS Polymer Strandards Service GmbH	PSA080505	precolumn with polar silica (8 x 50 mm)
HP-INNOwax column 30 m	Agilent J & W	19091N-213IE	GC column with a polar polyethylene glycol stationary phase
PSS MCX	PSS Polymer Strandards Service GmbH	MCA0830051E3	gel columns (8 x 300 mm, particle diameter: 5 µm, nominal pore width: 1000 Å
ThermoMixer	Eppendorf	n.a.	mixing and heating block
tinyclave steel Typ 3 / 25 mL	Büchi	49,33,45,10,000	100 bar, 200 °C