蚊子电图分步指南

摘要

本文详细介绍了在几个蚊子属（包括雌性和雄性）中成功和低噪声电图的分步方案。

摘要

雌性蚊子是地球上最致命的动物，由于它们在获取血粉时传播的病原体，每年夺走超过100万人的生命。为了找到要觅食的宿主，蚊子依靠广泛的感官线索，包括视觉、机械、热和嗅觉。该研究详细介绍了一种技术，即电学（EAG），该技术使研究人员能够评估蚊子是否可以以浓度依赖性的方式检测单个化学物质和化学物质混合物。当与气相色谱（GC-EAG）结合使用时，该技术允许将触角暴露在完整的顶部空间/复杂混合物中，并确定蚊子可以检测到感兴趣的样品中存在的化学物质。这适用于宿主体味以及植物花束或其他与生态相关的气味（例如，产卵部位气味剂）。在这里，我们描述了一种协议，该协议允许长时间的制备反应时间，并且适用于来自多个属的雌性和雄性蚊子，包括 伊蚊， Culex，按 蚊和 弓形虫 蚊子。由于嗅觉在蚊子 - 宿主相互作用和蚊子生物学中起着重要作用，因此EAG和GC-EAG可以揭示感兴趣的化合物，以开发新的疾病媒介控制策略（例如诱饵）。辅以行为测定，可以确定每种化学物质的价态（例如引诱剂、驱虫剂）。

引言

蚊子是地球上最致命的生物，每年夺走超过100万人的生命，并使世界一半以上的人口面临接触其传播病原体的风险，同时叮咬¹。这些昆虫依靠广泛的线索（即热、视觉、机械、嗅觉、听觉）来定位宿主（植物和动物）、交配和产卵，以及在幼虫和成虫阶段避开捕食者^2，3。在这些感官中，嗅觉在上述行为中起着关键作用，特别是对于^{气味分子的}中远程检测2^，3。宿主或产卵部位发出的气味由位于蚊子触诊长鼻、跗骨和触角上的各种特异性嗅觉受体（例如 GR、OR、IR）检测^2，3。

由于嗅觉是它们寻找宿主（植物和动物）、交配和产卵行为的关键组成部分，因此它构成了研究开发^蚊子控制新工具的理想目标4。对驱虫剂（例如避蚊胺、IR3535、派卡瑞丁）和诱饵（例如BG哨兵人类诱饵）的研究非常多^产5，但由于目前蚊子控制方面的挑战（例如，杀虫剂抗性，入侵物种），必须开发新的有效控制方法，了解蚊子生物学。

许多技术（例如，嗅觉计，着陆测定，电生理学）已被用于评估蚊子中化合物或化合物混合物的生物活性。其中，电图（或电图（EAGs））可用于确定气味是否被蚊子触角检测到。这项技术最初由施耐德⁶号开发，从那时起已被用于许多不同的昆虫属，包括飞蛾⁷，⁸，⁹，大黄蜂^10，11，蜜蜂¹²，^13和果蝇^14，15等等。电学也已使用各种协议，包括蚊子¹⁶，¹⁷，¹⁸，¹⁹，²⁰，²¹，^22，23，^24，25的单触角或多触角。

蚊子是相对较小和脆弱的昆虫，触角相当细。虽然对飞蛾或大黄蜂等较大的昆虫进行EAG相对容易，因为它们的尺寸更大，触角更厚，但在蚊子中进行EAG可能具有挑战性。特别是，保持良好的信噪比和持久的响应式制备是数据再现性和可靠性的两个主要要求。

此处提出的低噪声EAG分步指南直接提供了这些限制的解决方案，并使该协议适用于来自不同属的几种蚊子物种，包括 伊蚊， 按蚊， Culex和 弓形虫，并描述了雌性和雄性的技术。电学提供了一种快速而可靠的方法来筛选和确定生物活性化合物，然后在通过行为测定确定价后，可以利用这些化合物进行诱饵开发。

研究方案

1. 盐水溶液制备

1. 提前准备好生理盐水并存放在冰箱中。
2. 按照Beyenbach和Masia²⁶ 准备解决方案。
   注意:以mM为单位的盐水配方:150.0 NaCl，25.0 HEPES，5.0葡萄糖，3.4 KCl，1.8 NaHCO₃，1.7 CaCl 2和1.0 MgCl₂。用1M NaOH将pH调节至7.1。此时不要在制剂中添加葡萄糖或蔗糖，以增加货架储存。在运行EAG之前，将所需量添加到盐水中（每次实验约50 mL）。

2. 气味制备和储存

1. 在1.5 mL琥珀色小瓶中提前制备加臭剂混合物或单一化合物稀释液，并储存在-20°C以防止化合物降解。
   注意:浓度将取决于要进行的测试。0.1%或1%通常用于确定是否可以检测到化合物。对于剂量反应曲线，准备给定化学品的连续稀释液，并测试它们从最低到最高浓度。
2. 根据被测化学品的溶解度，在水、乙醇、己烷、石蜡油或矿物油中制备稀释液。
3. 确保为实验准备溶剂对照（仅包含溶剂的小瓶）。
4. 在开始实验前30分钟从冰箱中取出气味剂，使其解冻。使用前涡旋每个小瓶，使化学品和溶剂充分混合。
5. 将 10 μL 溶液移液到一张滤纸 （0.5 cm x 2 cm） 上，装入标记的玻璃注射器或巴斯德移液器内。
6. 将每种化合物或混合物装入特定的巴斯德移液器或注射器中，以防止污染。
   注意:在开始实验前10分钟加载，以便气味可以在注射器中扩散，但不会持续更长时间以防止降解。此时让巴斯德移液器或注射器保持封盖，以便在实验开始前使化学物质充分扩散。
7. 每次EAG运行后，处理滤纸并更换新的滤纸，以防止纸张过度浸泡并有针头堵塞的风险。定期更换针头（每10次）。

3. 蚊虫分离

1. 在实验当天隔离蚊子。
2. 使用实验当天至少6天大的蚊子，以增加雌配的机会，以增强它们对宿主相关气味剂的反应。
   注意:根据项目在测试时调整蚊龄。检查并协调生理状态（例如，血饲、饥饿、以前从未喂食等）。
3. 使蚊子挨饿长达12小时（即无法获得糖分），以增加它们的动机和敏感性。
4. 将蚊子容器放入冰箱（4°C）中，直到它们停止飞行，以便用镊子轻松地将个人小心地转移到单个杯子中。
   注意:耐寒性较高的物种可以使用CO₂ 防蝇垫放下。确保蚊子不要长时间停留以防止干燥，这会降低蚊子EAG制剂的反应能力。
5. 在进行EAG之前，将装有单个蚊子的杯子存放在室温下，并丢弃白天可能不使用的任何蚊子。

4. 电极支架和毛细管制备

1. 毛细管拉拔、制备和储存
   1. 使用带细丝的硼硅酸盐毛细管（内径:0.78毫米，外径:1毫米）。根据设备拉动它们²⁷.
      注意:将拉动的毛细血管储存在培养皿中。将培养皿放在蜡片或无味的造型粘土上，以防止它们移动和断裂。
   2. 在进行EAG实验之前，在显微镜下用一对镊子轻轻地折断2个毛细管的尖端。
      注意:确保一个略大于另一个，以适合颈部（较大的毛细管）或触角的尖端（较小的毛细管）。确保切口干净，毛细管壁上没有裂缝。这需要耐心和练习。
   3. 如果仍然完好无损，请在实验结束后用去离子（DI）水冲洗后重新使用这些毛细管。用清洁湿巾轻轻涂抹在尖端上，以去除多余的水。放回储存培养皿中。如果尖端弯曲，请丢弃毛细管。
2. 电极支架和毛细管安装
   1. 使用不同颜色的实验室胶带将两个电极支架标记为"记录"和"参考"。这将有助于指导蚊头和电极的安装。
   2. 确保电极支架内部透明，并且不存在硼硅酸盐碎屑。
   3. 氯化:将电极支架的银线浸泡在纯漂白剂中约5分钟。电线从闪亮的浅灰色变为哑光深灰色。
   4. 松开橡胶塞，并使用20G针头用10%盐水溶液填充毛细管内部。
   5. 使用注射器用盐溶液填充硼硅酸盐毛细管。确保电极支架和拉动的毛细管中均不存在气泡。
      注意:为减少毛细管中出现气泡的机会，请继续推动毛细管中的盐水，同时轻轻拉出针头并使用带有细丝的毛细管。可以用由1:3电极凝胶和盐水溶液组成的溶液加载毛细管。这可以帮助防止盐水蒸发，并且在学习和练习EAG时特别有用，因为实验者需要更多时间来完成不同的步骤。
   6. 浸泡后，用去离子水冲洗银丝并将其插入两个毛细管中。确保电线尖端距离毛细管尖端小于 1 mm。确保毛细管通过电极支架内的橡胶圈而不会破裂。轻轻拧紧橡胶塞。验证是否存在气泡。
   7. 使用参比电极支架（颈部）上开口较宽的毛细管，记录电极支架（天线）上的开口较小。
   8. 将两个安装的电极支架放在湿清洁湿巾上，以防止吸头变干，直到准备安装头部。

5. EAG钻机准备（图1）

1. 确保空气桌向上，航空公司没有堵塞。确保医用空气罐仍然充满，以避免在实验过程中更换它。确保加湿器中有气泡。
2. 空气和脉冲输送系统
   1. 打开医用空气气罐。
   2. 检查两个流量计的液位。
      注意:在整个实验过程中，控制洗浴制剂的主气流的流量计应为140 mL / min，其他与气味脉冲相关的流量计应读数为15 mL / min。
3. 如果执行GC-EAD，请打开机器，气箱并创建/加载文件/方法。
4. 打开计算机、软件应用程序、阀门电源，并验证互联网连接以使软件应用程序正常工作。
   1. 软件应用:可以编写一个简短的脚本来传递脉冲。
   2. EAG软件:使用任何电生理学软件。
   3. 在软件中实现参数（例如，放大器、记录持续时间、脉冲持续时间等）。
5. 传递控制脉冲以验证传递脉冲的阀门是否正常工作。
6. 将电源设置为 5.2 V。 验证放大器参数。
   注意:此处显示的数据使用的参数是:0.1 Hz的低截止滤波器;500 Hz 的高截止滤波器;增益为 x100。

6. 蚊头的准备和安装（图2）

1. 将铝板放在冰上，并在上面放一块湿清洁纸巾。
2. 在角落里放一小团电极凝胶。
3. 将蚊子杯放在冰上，让蚊子冷却几分钟，或直到它停止飞行。
   注意:有些物种是耐寒的，可能需要在 CO₂ 飞垫上快速麻醉才能下降。蚊子停留的时间越少越好。
4. 将蚊子放在背上，用微型剪刀夹住每个天线的尖端（仅最后一段的一小部分）。
5. 使用镊子将蚊子拖到电极凝胶团旁边，然后将每个天线的尖端轻轻浸入凝胶中。避免浸渍电极凝胶中超过最后一个片段。
6. 使用镊子将蚊子触角拉出，同时将它们彼此相邻。让他们一起从凝胶中出来。确保天线不要接触清洁湿巾的表面，否则它们可能会分离。
7. 将蚊子侧放，用微型剪刀或剃须刀片切碎蚊子的头部。
   注意:切头后，请快速执行后续步骤并转到EAG设备以开始录制。制剂应保持反应约30分钟。
8. 取参比电极，将尖端轻轻深入凝胶中。与颈部组织保持接触，让头部粘在上面。
9. 将电极支架移动到EAG显微镜下并通过显微镜观察，将头部（即参考）电极放在显微操纵器上。确保天线位于中心。
10. 抓住记录电极，将其放在触角尖端的前面。使用显微操纵器将其移动并尽可能靠近吸头。使用显微镜将记录电极的尖端移向天线。
11. 在插入尖端之前，将两个电极支架连接到放大器，以防止它们在插入后移动。
12. 将天线尖端插入记录电极。确保它们仅接触盐水和电极凝胶，并且通过毛细管透明可见。天线通过"吸力效应"进入。
13. 如果需要，在显微镜下用镊子调整头部和尖端的位置。
14. 将航空管靠近蚊头准备（距离:1厘米）。
    注意:如果头部脱落，请返回解剖站并重新安装头部，如果头部丢失或自头部被切断以来已超过 5 分钟，请准备新的头部。毛细管和颈部/触角之间的良好连接对于低噪声和可靠的记录至关重要。理想情况下，一旦插入，天线尖端将距离记录电极的电线不到 1 毫米。
15. 关闭光源（如果使用）。
16. 将真空管线放置在蚊头准备附近（距离:20 厘米），并与主航空公司对齐。
    注意:真空将有助于在刺激后去除头部准备周围的化学物质，这可能会导致在施加脉冲后产生EAG反应。

7. 录音

1. 插入天线尖端后，打开放大器和降噪器。观察基线信号并确保其没有噪音。
   注意:观察电信号中是否存在较大的振荡。根据需要调整头部和触角尖端的位置，直到信号干净。使用鳄鱼夹将任何将噪音引入法拉第笼或空气台的东西接地。幅度小于0.01 mV的基线信号是检测和区分分钟EAG响应的理想选择。
2. 一旦噪音水平令人满意，将第一个气味注射器插入空气孔中进行测试。
3. 关闭法拉第笼。不要停留在准备前，以减少噪音。
4. 点击 记录在EAG软件上。
5. 使用软件应用程序传递脉冲。
   注意:脉冲的数量和持续时间将根据实验而有所不同。在这里，每种气味剂使用了单个1 s.脉冲。加臭剂间隔45秒。
6. 注意实验室笔记本中蚊子触角的反应。
   注意:如果蚊子触角检测到气味，则观察到信号中有明显的偏转（见 图3A）。
7. 继续下一个气味或浓度。不要忘记随机化气味剂的呈现，除非进行剂量反应曲线。
   注意:实验中应使用阴性对照和阳性对照。这将确保观察到的反应确实是嗅觉反应，而不是由于机械或电噪声引起的。
8. 在录制结束时，应用阳性对照以验证天线是否仍然响应。
   注意:使用0.1%或1%苯甲醛，因为迄今为止测试的所有蚊子物种都对这种化合物有反应。
9. 继续进行下一次蚊子准备工作。

8. 清洁

1. 关闭放大器、降噪器、航空公司和计算机。
2. 将加臭剂放回冰箱。
3. 从玻璃注射器中取出滤纸，如果墙壁上可见残留物，则用 100% 乙醇清洁。用清洁纸擦干过夜。
4. 用去离子水清洁电极支架，以去除任何可能的盐痕迹。轻轻涂抹在一块清洁湿巾上擦干。
5. 将蚊子残留物放入冰箱中，24小时后处理。
   注意:如果与受感染的蚊子一起工作，请遵循您所在机构的安全要求。

9. 数据分析

1. 手动或自动测量EAG响应。
   注意:EAG幅度（-mV）在这里测量。如果对每种化合物应用了多个脉冲，则取平均值。根据所使用的软件，可以自动检测和测量EAG。但是，必须单独检查每个响应，以验证响应的形状并评估可能的残留，延迟响应等。理想的EAG响应与脉冲对齐，显示出明显的偏转，并且在蚊子制备之间可重复（图3）。
2. 呈现原始数据以显示最小的变异性、低噪声信号和清晰的响应（图 3B）。
   注意:数据也可以归一化（例如，Z 分数）。阴性对照值（例如矿物油）（即基线）可以从响应中减去，如果没有，则应在图中列出。还应提供阳性对照。
3. 使用任何统计软件进行统计分析²⁸.

结果

电学是确定昆虫天线是否检测到化学物质或化学物质混合物的有力工具。它还可用于使用浓度的逐渐增加来确定给定化学品的检测阈值（即剂量曲线响应， 图4B）。此外，测试驱虫剂对宿主相关气味的反应的影响是有用的²⁹。

EAG中应始终使用阳性和阴性对照。在这里，苯甲醛被用作阳性对照（图3B，3C...

讨论

嗅觉介导的行为受许多因素影响，包括生理因素（例如年龄、一天中的时间）和环境（例如温度、相对湿度）³⁰。因此，在进行EAG时，必须使用处于相同生理状态（即监测年龄，饥饿，交配）³¹ 的昆虫，并在制剂周围保持温暖潮湿的环境以避免干燥。25°C左右的温度是理想的，主要航空公司的湿度为60%至80%。这可以通过在主航线上放置一个起泡器来轻松实现。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air table Clean Bench	TMC	https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess	Noise reducer
Analog-to-digital board	National Instruments	BNC-2090A
Benchtop Flowbuddy Complete	Genesee Scientific	59-122BC	To anesthesize mosquitoes
Borosillicate glass capillary	Sutter Instrument	B100-78-10	To make the recording and references capillaries
Chemicals	Sigma Aldrich	Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L	Chemicals used for the experiments presented here
CO2	Airgas or Praxair	N/A	To anesthesize mosquitoes
Cold Light Source	Volpi	NCL-150
Disposable syringes	BD	1 mL (309628)  / 3 mL (309657)
Electrode cables	World Precision Instruments	5371
Electrode gel salt free	Parkerlabs	12-08-Spectra-360
Faraday cage	TMC	https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages	Noise reducer
Flowmeters	Bel-art	65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)	One of each
GCMS vials and caps	Thermo-fisher scientific	2-SVWKA8-CPK	To prepare odorant dilutions
Glass syringes (Fortuna)	Sigma Aldrich	Z314307	For odor delivery to the EAG prep
Humbug	Quest Scientific	http://www.quest-sci.com/	Noise reducer
2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire	A-M Systems	675748	Electrode holder
Magnetic bases	Kanetec	MB-FX	x 2
MATLAB + Toolboxes	Mathworks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	For delivering the pulses
Medical air	Airgas or Praxair	N/A	For main airline
Microscope	Nikkon	SMZ-800N
Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator	Narishige	MHW-3	x 2
Microelectrode amplifier with headstage	A-M Systems	Model 1800
Mosquito rearing supplies	Bioquip	https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
Needles	BD	25G (305127) / 21G (305165)
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A	For odor delivery to the EAG prep
PTFE Tubing of different diameters	Mc Master Carr	N/A	To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect.
30V/5A DC Power Supply	Dr. Meter	PS-305DM
R version 3.5.1	R project	https://www.r-project.org/	For data analyses
Relay for solenoid valve	N/A	Custom made
Silver wire 0.01”	A-M Systems	782500
Solenoid valve (3-way)	The Lee Company	LHDA0533115H
WinEDR software	Strathclyde Electrophysiology Software	WinEDR V3.9.1	For EAG recording
Whatman paper	Cole Parmer	UX-06648-03	To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette