Um guia passo-a-passo para eletroantennografia de mosquitos

Resumo

O presente artigo detalha um protocolo passo-a-passo para eletroantennogramas bem sucedidos e de baixo ruído em vários gêneros de mosquitos, incluindo fêmeas e machos.

Resumo

As fêmeas de mosquitos são os animais mais mortais do planeta, ceifando a vida de mais de 1 milhão de pessoas todos os anos devido aos patógenos que transmitem ao adquirir uma refeição de sangue. Para localizar um hospedeiro para se alimentar, os mosquitos dependem de uma ampla gama de pistas sensoriais, incluindo visuais, mecânicas, térmicas e olfativas. O estudo detalha uma técnica, a eletroantennografia (EAG), que permite aos pesquisadores avaliar se os mosquitos podem detectar produtos químicos individuais e misturas de produtos químicos de maneira dependente da concentração. Quando acoplada à cromatografia gasosa (GC-EAG), esta técnica permite expor as antenas a uma mistura completa de headspace/complexo e determina quais produtos químicos presentes na amostra de interesse, o mosquito pode detectar. Isso é aplicável a odores corporais do hospedeiro, bem como buquês florais de plantas ou outros odores ecologicamente relevantes (por exemplo, locais de oviposição, odorantes). Aqui, descrevemos um protocolo que permite longas durações de tempo de resposta ao preparo e é aplicável a mosquitos fêmeas e machos de vários gêneros, incluindo mosquitos Aedes, Culex, Anopheles e Toxorhynchites . Como o olfato desempenha um papel importante nas interações mosquito-hospedeiro e na biologia do mosquito em geral, EAGs e GC-EAG podem revelar compostos de interesse para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de vetores de doenças (por exemplo, iscas). Complementado com ensaios comportamentais, a valência (por exemplo, atrativo, repelente) de cada produto químico pode ser determinada.

Introdução

Os mosquitos são os organismos mais mortais do planeta, ceifando a vida de mais de um milhão de pessoas por ano e colocando mais da metade da população mundial em risco de exposição aos patógenos que transmitem, ao picar¹. Esses insetos dependem de uma ampla gama de pistas (térmicas, visuais, mecânicas, olfativas, auditivas) para localizar um hospedeiro para se alimentar (tanto vegetal quanto animal), para acasalamento e oviposição, bem como para evitar predadores nas fases larval e adulta ^2,3. Dentre esses sentidos, o olfato desempenha um papel crítico nos comportamentos acima mencionados, em particular para a detecção de moléculas odorantes de médio a longo alcance ^2,3. Odores emitidos por um hospedeiro ou um sítio de oviposição são detectados por vários receptores olfatórios específicos (por exemplo, RGs, ORs, IRs) localizados nos palpos do mosquito, probóscide, tarsos e antenas ^2,3.

Como o olfato é um componente-chave de seus comportamentos de busca de hospedeiros (vegetais e animais), acasalamento e oviposição, constitui-se, portanto, um alvo ideal a ser estudado para o desenvolvimento de novas ferramentas para o controle de mosquitos⁴. A pesquisa de repelentes (por exemplo, DEET, IR3535, picaridina) e iscas (por exemplo, isca humana sentinela BG) é extremamente prolífica⁵, mas devido aos desafios atuais no controle de mosquitos (por exemplo, resistência a inseticidas, espécies invasoras), é essencial desenvolver novos métodos de controle eficientes informados pela biologia do mosquito.

Muitas técnicas (por exemplo, olfatômetro, ensaios de aterrissagem, eletrofisiologia) têm sido usadas para avaliar a bioatividade de compostos ou misturas de compostos em mosquitos. Entre eles, a eletroantenografia (ou eletroantennogramas (EAGs)) pode ser usada para determinar se os odorantes são detectados pelas antenas do mosquito. Esta técnica foi inicialmente desenvolvida por Schneider⁶ e tem sido utilizada em diversos gêneros de insetos desde então, incluindo mariposas ^7,8,9, mamangavas 10,11, abelhas ^{12,13 e} moscas-das-frutas ^14,15, entre outras. A eletroantenografia também tem sido empregada por meio de vários protocolos, incluindo antenas únicas ou múltiplas em mosquitos16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Os mosquitos são insetos relativamente pequenos e delicados com antenas bastante finas. Embora a realização de EAGs em insetos maiores, como mariposas ou abelhas, seja relativamente fácil por causa de seu tamanho maior e antenas mais espessas, conduzir EAGs em mosquitos pode ser um desafio. Em particular, manter uma boa relação sinal-ruído e uma preparação responsiva duradoura são dois requisitos principais para a reprodutibilidade e confiabilidade dos dados.

O guia passo-a-passo para EAGs de baixo ruído proposto aqui oferece diretamente soluções para essas limitações e torna este protocolo aplicável a várias espécies de mosquitos de vários gêneros, incluindo Aedes, Anopheles, Culex e Toxorhynchites, e descreve a técnica para fêmeas e machos. A eletroantennografia oferece uma maneira rápida e confiável de selecionar e determinar compostos bioativos que podem ser aproveitados no desenvolvimento de iscas após a valência ter sido determinada com ensaios comportamentais.

Protocolo

1. Preparação da solução salina

1. Prepare o soro fisiológico com antecedência e guarde na geladeira.
2. Siga Beyenbach e Masia²⁶ para preparar a solução.
   NOTA: Receita salina em mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glicose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO₃, 1,7 CaCl 2 e 1,0 MgCl₂. O pH é ajustado para 7,1 com NaOH 1 M. Não adicione glicose ou sacarose à preparação neste momento para aumentar o armazenamento na prateleira. Adicione a quantidade necessária ao soro fisiológico antes de executar os EAGs (cerca de 50 mL por experimento).

2. Preparação e armazenamento de odores

1. Preparar antecipadamente as misturas de odorantes ou diluições de compostos únicos em frascos para injetáveis de âmbar de 1,5 ml e conservar a -20 °C para evitar a degradação do composto.
   NOTA: As concentrações dependerão do ensaio a realizar. 0,1% ou 1% são comumente usados para determinar se um composto pode ser detectado ou não. Para uma curva dose-resposta, prepare diluições seriadas de um determinado produto químico e teste-as a partir das concentrações mais baixas para as mais elevadas.
2. Preparar as diluições em água, etanol, hexano, óleo de parafina ou óleo mineral, dependendo da solubilidade do produto químico testado.
3. Certifique-se de preparar um controle de solvente (um frasco contendo apenas o solvente) para o experimento.
4. Retire os odorantes do congelador 30 minutos antes de iniciar os experimentos para permitir que eles descongelem. Vórtice cada frasco para injetáveis antes de usar para misturar bem o produto químico e o solvente.
5. Pipetar 10 μL de solução para um pedaço de papel de filtro (0,5 cm x 2 cm) carregado dentro de uma seringa de vidro rotulada ou pipeta Pasteur.
6. Coloque cada composto ou mistura em uma pipeta ou seringa Pasteur específica para evitar contaminação.
   NOTA: Carregue 10 minutos antes de iniciar o experimento para que o odor possa se difundir na seringa, mas não por mais tempo para evitar a degradação. Deixe a pipeta ou seringa de Pasteur permanecer tampada neste momento para permitir uma boa difusão do produto químico antes do início do experimento.
7. Após cada corrida de EAG, descarte o pedaço do papel filtro e substitua-o por um novo para evitar que o papel fique encharcado demais e corra o risco de entupimento da agulha. Substitua as agulhas regularmente (a cada 10 corridas).

3. Separação de mosquitos

1. Isole os mosquitos no dia dos experimentos.
2. Use mosquitos com pelo menos 6 dias de idade no dia dos experimentos para aumentar as chances de que as fêmeas sejam acasaladas para melhorar sua resposta aos odorantes relacionados ao hospedeiro.
   NOTA: Ajuste a idade do mosquito no momento do teste dependendo do projeto. Verificar e harmonizar o estado fisiológico (por exemplo, alimentado com sangue, faminto, nunca alimentado anteriormente, etc.).
3. Matar os mosquitos de fome até 12 h (ou seja, sem acesso ao açúcar) para aumentar sua motivação e sensibilidade.
4. Coloque o recipiente do mosquito na geladeira (4 °C) até que eles parem de voar para que os indivíduos possam ser facilmente transferidos para copos individuais com pinças.
   NOTA: Espécies com maior tolerância ao frio podem ser abatidas usando uma almofada de mosca CO₂ . Certifique-se de que os mosquitos não permaneçam nele por muito tempo para evitar a dessecação, o que diminuiria a capacidade de resposta da preparação do mosquito EAG.
5. Armazenar os copos contendo mosquitos individuais à temperatura ambiente antes da realização dos EAGs e descartar os mosquitos que não possam ser usados durante o dia.

4. Suporte de eletrodos e preparação capilar

1. Tração, preparação e armazenamento capilar
   1. Utilizar capilares de borossilicato com filamentos (D.I: 0,78 mm, D.O: 1 mm). Puxe-os dependendo do equipamento²⁷.
      OBS: Guarde os capilares puxados em uma placa de Petri. Coloque a placa de Petri sobre pedaços de cera ou argila modeladora sem perfume para evitar que eles se movam e quebrem.
   2. Antes de executar o experimento EAG, quebre suavemente a ponta de 2 capilares com um par de pinças sob o microscópio.
      NOTA: Certifique-se de que um é um pouco maior que o outro para caber no pescoço (capilar maior) ou nas pontas das antenas (capilar menor). Certifique-se de que o corte esteja limpo, sem rachaduras presentes na parede capilar. Isso requer paciência e prática.
   3. Se ainda estiverem intactos, reutilizar esses capilares após o enxágue com água desionizada (DI) após o término do experimento. Retire o excesso de água aplicando suavemente um lenço de limpeza contra a ponta. Coloque novamente na placa de Petri armazenada. Se a ponta estiver torta, descarte o capilar.
2. Suporte de eletrodos e montagem capilar
   1. Rotule os dois suportes de eletrodos como "gravação" e "referência" usando pedaços de fita de laboratório de cores diferentes. Isso ajudará a orientar a montagem da cabeça do mosquito e dos eletrodos.
   2. Certifique-se de que os suportes de eletrodos estejam limpos no interior e que não haja detritos de borossilicato.
   3. Clorização: Mergulhe os fios de prata dos suportes de eletrodos em água sanitária pura por cerca de 5 min. Os fios passam de cinza claro brilhante para cinza escuro fosco.
   4. Solte a rolha de borracha e preencha o interior do capilar com solução salina a 10% usando uma agulha de 20 G.
   5. Encha o capilar de borossilicato com a solução salina usando uma seringa. Certifique-se de que não há bolhas presentes nem no suporte do eletrodo nem no capilar puxado.
      NOTA: Para reduzir as chances de ter bolhas no capilar, continue empurrando soro fisiológico no capilar enquanto puxa suavemente a agulha para fora e use capilares com um filamento. É possível carregar os capilares com uma solução composta por gel de eletrodo 1:3 e solução salina. Isso pode ajudar a evitar a evaporação do soro fisiológico e pode ser particularmente útil ao aprender e praticar EAGs, pois o experimentador precisará de mais tempo para completar as diferentes etapas.
   6. Após a imersão, enxágue os fios de prata com água DI e insira-os nos dois capilares. Certifique-se de que a ponta do fio esteja a menos de 1 mm da ponta do capilar. Certifique-se de que o capilar passe o anel de borracha dentro do suporte do eletrodo sem quebrar. Aperte suavemente a rolha de borracha. Verifique se não há bolhas de ar presentes.
   7. Use o capilar com a abertura mais larga no suporte do eletrodo de referência (pescoço) e a abertura menor no suporte do eletrodo de gravação (antenas).
   8. Deixe os dois suportes de eletrodo montados em uma limpeza úmida para evitar que a ponta seque até que esteja pronta para montar a cabeça.

5. Preparação da plataforma EAG (Figura 1)

1. Certifique-se de que a mesa aérea está levantada, que não há bloqueio na companhia aérea. Certifique-se de que o tanque de ar medicinal ainda esteja cheio para evitar trocá-lo no meio do experimento. Certifique-se de que existem bolhas no umidificador.
2. Sistema de entrega de ar e pulso
   1. Ligue o tanque de gás de ar medicinal.
   2. Verifique o nível dos dois medidores de vazão.
      OBS: O fluxômetro que controla a corrente de ar principal que banha a preparação durante todo o experimento deve estar em 140 mL/min e o outro relacionado ao pulso de odor deve ler 15 mL/min.
3. Se estiver fazendo GC-EAD, ligue a máquina, os tanques de gás e crie/carregue o arquivo/método.
4. Ligue os computadores, os aplicativos de software, a fonte de alimentação da válvula e verifique a conexão com a Internet para que o aplicativo de software funcione.
   1. Aplicação de software: Um script curto pode ser escrito para entregar o pulso.
   2. Software EAG: use qualquer software de eletrofisiologia.
   3. Implemente os parâmetros no software (por exemplo, amplificador, duração da gravação, duração dos pulsos, etc.).
5. Forneça um pulso de controle para verificar se a válvula que entrega os pulsos está funcional.
6. Ajuste a fonte de alimentação em 5,2 V. Verifique os parâmetros do amplificador.
   OBS: Os parâmetros utilizados para os dados aqui apresentados são: filtro de corte baixo de 0,1 Hz; filtro de corte alto de 500 Hz; Ganho de x100.

6. Preparo e montagem da cabeça do mosquito (Figura 2)

1. Coloque uma placa de alumínio sobre o gelo e coloque um pedaço de lenço umedecido sobre ele.
2. Coloque um pequeno boneco de gel de eletrodo em um canto.
3. Coloque um copo de mosquito no gelo e deixe o mosquito esfriar por alguns minutos, ou até que ele pare de voar.
   NOTA: Algumas espécies são resistentes ao frio e podem necessitar de uma anestesia rápida sobre uma almofada de mosca CO₂ para descer. Quanto menos o mosquito ficar ligado, melhor.
4. Coloque o mosquito nas costas e prenda a ponta de cada antena (apenas uma pequena porção do último segmento) com micro tesoura.
5. Use pinças para arrastar o mosquito ao lado do eletrodo de gel e mergulhe a ponta de cada antena suavemente no gel. Evite mergulhar mais do que apenas o último segmento no gel do eletrodo.
6. Usando pinças, puxe as antenas do mosquito para fora, mantendo-as próximas umas das outras. Deixe-os sair juntos do gel. Certifique-se de que as antenas não tocam na superfície do lenço de limpeza ou podem separar-se.
7. Coloque o mosquito de lado e pique a cabeça usando uma micro tesoura ou uma lâmina de barbear.
   NOTA: Uma vez que a cabeça é cortada, prossiga rapidamente para os próximos passos e para o equipamento EAG para iniciar as gravações. A preparação deve permanecer responsiva por cerca de 30 min.
8. Pegue o eletrodo de referência e aprofunde suavemente a ponta no gel. Mantenha em contato com os tecidos do pescoço e deixe a cabeça grudar nele.
9. Mova os suportes de eletrodos sob o microscópio EAG e visualize através do microscópio para colocar o eletrodo de cabeça (ou seja, de referência) em um micromanipulador. Certifique-se de que as antenas estão no centro.
10. Pegue o eletrodo de gravação, coloque-o na frente das pontas das antenas. Mova e alinhe o mais próximo possível das pontas usando o micromanipulador. Usando o microscópio, mova a ponta do eletrodo de gravação em direção às antenas.
11. Conecte ambos os suportes de eletrodos ao amplificador antes de inserir as pontas para evitar que eles se movam após a inserção.
12. Insira as pontas das antenas no eletrodo de gravação. Certifique-se de que eles apenas entrem em contato com o soro fisiológico e o gel do eletrodo e sejam visíveis por transparência através do capilar. A antena entra pelo "efeito de sucção".
13. Ajuste a posição da cabeça e das pontas com pinça sob o microscópio, se necessário.
14. Coloque a tubulação próxima ao preparo da cabeça do mosquito (distância: 1 cm).
    NOTA: Se a cabeça cair, retorne à estação de dissecção e remonte a cabeça ou prepare uma nova se ela tiver sido perdida ou se tiver passado mais de 5 minutos desde que a cabeça foi cortada. Uma boa conexão entre o capilar e o pescoço/antenas é essencial para baixo ruído e gravação confiável. O ideal é que as pontas das antenas fiquem a menos de 1 mm do fio do eletrodo de gravação uma vez inserido.
15. Desligue a fonte de luz, se utilizada.
16. Posicione a linha de vácuo perto da preparação da cabeça do mosquito (distância: 20 cm) e alinhe com a linha aérea principal.
    NOTA: O vácuo ajudará a remover produtos químicos ao redor da preparação da cabeça após o estímulo, o que pode levar a respostas de EAG após a aplicação dos pulsos.

7. Gravações

1. Após a inserção das pontas das antenas, ligue o amplificador e o redutor de ruído. Observe o sinal basal e certifique-se de que ele não seja barulhento.
   NOTA: Observe se grandes oscilações no sinal elétrico estão presentes. Ajuste a posição da cabeça e das pontas das antenas conforme necessário até que o sinal esteja limpo. Use grampos de jacaré para aterrar qualquer coisa que introduza ruído na gaiola de Faraday ou na mesa de ar. Um sinal basal de menor que 0,01 mV de amplitude é ideal para detectar e discriminar respostas de EAG minuto.
2. Quando o nível de ruído estiver satisfatório, insira a primeira seringa de odor para testar no orifício da companhia aérea.
3. Feche a gaiola de Faraday. Não fique na frente da preparação, para reduzir o ruído.
4. Clique em Gravar no software EAG.
5. Entregue o(s) pulso(s) usando o aplicativo de software.
   NOTA: O número e a duração dos pulsos variam dependendo dos experimentos. Aqui, pulsos únicos de 1 s. por odorante foram usados. Os odorantes foram separados por 45 s.
6. Observe a resposta das antenas do mosquito no caderno de laboratório.
   NOTA: Se o odorante for detectado pelas antenas do mosquito, observa-se uma clara deflexão no sinal (ver Figura 3A).
7. Prossiga com o próximo odor ou concentração. Não se esqueça de randomizar a apresentação dos odorantes, a menos que uma curva dose-resposta seja realizada.
   NOTA: Um controle negativo e um controle positivo devem ser usados nos experimentos. Isso garantirá que as respostas observadas sejam realmente respostas olfativas e não devidas a ruídos mecânicos ou elétricos.
8. Ao final da gravação, aplique um controle positivo para verificar se as antenas ainda estão responsivas.
   NOTA: Use 0,1% ou 1% de benzaldeído, pois todas as espécies de mosquitos testadas até agora foram responsivas a este composto.
9. Prossiga com a próxima preparação do mosquito.

8. Limpeza

1. Desligue o amplificador, o redutor de ruído, a companhia aérea e o computador.
2. Devolva os odorantes ao congelador.
3. Retire os papéis de filtro das seringas de vidro e limpe com etanol 100% se houver resíduos visíveis nas paredes. Deixe secar em um lenço de limpeza durante a noite.
4. Limpe os suportes de eletrodos com água DI para remover qualquer possível vestígio de sal. Seque aplicando suavemente contra um pedaço de toalhete de limpeza.
5. Coloque os restos mortais do mosquito no congelador e descarte 24 h depois.
   NOTA: Se estiver trabalhando com mosquitos infectados, siga os requisitos de segurança em sua instituição.

9. Análise dos dados

1. Meça manual ou automaticamente as respostas do EAG.
   NOTA: A amplitude do EAG (-mV) é medida aqui. Média se vários pulsos foram aplicados para cada composto. Dependendo do software utilizado, os EAGs podem ser detectados e medidos automaticamente. No entanto, é essencial inspecionar cada resposta individualmente para verificar a forma da resposta e avaliar a possível transição, resposta atrasada, etc. A resposta ideal do EAG está alinhada com o pulso, mostra uma clara deflexão e é repetível entre as preparações do mosquito (Figura 3).
2. Apresente os dados brutos para mostrar variabilidade mínima, sinal de baixo ruído e respostas claras (Figura 3B).
   NOTA: Os dados também podem ser normalizados (por exemplo, Z-score). O valor de controle negativo (por exemplo, óleo mineral) (i.e., a linha de base) pode ser subtraído da resposta e, se não, deve ser apresentado nas figuras. Um controle positivo também deve ser apresentado.
3. Realizar análise estatística utilizando qualquer software estatístico²⁸.

Resultados

A eletroantennografia é uma ferramenta poderosa para determinar se um produto químico ou mistura de produtos químicos é detectado por uma antena de inseto. Ele também pode ser usado para determinar o limiar de detecção para um determinado produto químico usando um aumento gradual da concentração (ou seja, resposta da curva de dose, Figura 4B). Além disso, é útil testar os efeitos do repelente na resposta a odores relacionados ao hospedeiro²⁹.

Discussão

Os comportamentos mediados pelo olfato são afetados por muitos fatores, incluindo fisiológicos (por exemplo, idade, hora do dia) e ambientais (por exemplo, temperatura, umidade relativa)³⁰. Assim, ao realizar EAGs, é essencial utilizar insetos que estejam no mesmo estado fisiológico (i.e., monitoramento da idade, fome, acasalamento)³¹ e também manter um ambiente quente e úmido ao redor da preparação para evitar a dessecação. Uma temperatura em torno de 25 °C é i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air table Clean Bench	TMC	https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess	Noise reducer
Analog-to-digital board	National Instruments	BNC-2090A
Benchtop Flowbuddy Complete	Genesee Scientific	59-122BC	To anesthesize mosquitoes
Borosillicate glass capillary	Sutter Instrument	B100-78-10	To make the recording and references capillaries
Chemicals	Sigma Aldrich	Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L	Chemicals used for the experiments presented here
CO2	Airgas or Praxair	N/A	To anesthesize mosquitoes
Cold Light Source	Volpi	NCL-150
Disposable syringes	BD	1 mL (309628)  / 3 mL (309657)
Electrode cables	World Precision Instruments	5371
Electrode gel salt free	Parkerlabs	12-08-Spectra-360
Faraday cage	TMC	https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages	Noise reducer
Flowmeters	Bel-art	65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)	One of each
GCMS vials and caps	Thermo-fisher scientific	2-SVWKA8-CPK	To prepare odorant dilutions
Glass syringes (Fortuna)	Sigma Aldrich	Z314307	For odor delivery to the EAG prep
Humbug	Quest Scientific	http://www.quest-sci.com/	Noise reducer
2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire	A-M Systems	675748	Electrode holder
Magnetic bases	Kanetec	MB-FX	x 2
MATLAB + Toolboxes	Mathworks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	For delivering the pulses
Medical air	Airgas or Praxair	N/A	For main airline
Microscope	Nikkon	SMZ-800N
Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator	Narishige	MHW-3	x 2
Microelectrode amplifier with headstage	A-M Systems	Model 1800
Mosquito rearing supplies	Bioquip	https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
Needles	BD	25G (305127) / 21G (305165)
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A	For odor delivery to the EAG prep
PTFE Tubing of different diameters	Mc Master Carr	N/A	To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect.
30V/5A DC Power Supply	Dr. Meter	PS-305DM
R version 3.5.1	R project	https://www.r-project.org/	For data analyses
Relay for solenoid valve	N/A	Custom made
Silver wire 0.01”	A-M Systems	782500
Solenoid valve (3-way)	The Lee Company	LHDA0533115H
WinEDR software	Strathclyde Electrophysiology Software	WinEDR V3.9.1	For EAG recording
Whatman paper	Cole Parmer	UX-06648-03	To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette