通过压力-体积环路分析确定心脏对β肾上腺素能刺激的反应

摘要

在这里，我们描述了在增加静脉输注的异丙肾上腺素剂量下的心脏压力 - 体积环路分析，以确定小鼠的内在心脏功能和β肾上腺素能储备。我们使用改进的开胸方法进行压力 - 体积回路测量，其中我们包括具有正呼气末压的通气。

摘要

心脏功能的测定是心血管疾病动物模型中可靠的终点分析，以表征特定治疗对心脏的影响。由于遗传操作的可行性，小鼠已成为研究心脏功能和寻找新的潜在治疗靶点的最常见哺乳动物动物模型。在这里，我们描述了一种方案，用于在基础条件下使用压力 - 体积环测量和分析来确定体内心脏功能，并通过静脉输注增加浓度的异丙肾上腺素的β肾上腺素能刺激。我们提供完善的治疗方案，包括考虑到正呼气末压力的通气支持，以改善胸腔开胸测量期间的负面影响，以及强效镇痛（丁丙诺啡），以避免手术过程中疼痛引起的无法控制的心肌压力。总而言之，对程序的详细说明和对可能陷阱的讨论使高度标准化和可重复的压力 - 体积循环分析成为可能，通过防止可能的方法学偏倚来减少动物被排除在实验队列之外。

引言

心血管疾病通常影响心脏功能。本期指出了动物疾病模型中评估体内详细心脏功能的重要性。动物实验被三个Rs（3R）指导原则（减少/改进/替换）的框架所包围。在当前发育水平上理解涉及全身反应（即心血管疾病）的复杂病理的情况下，主要选择是改进可用的方法。由于变异性较小，精炼还会导致所需动物数量的减少，从而提高分析和结论的力量。此外，心脏收缩力测量与心脏病的动物模型相结合，包括由神经体液刺激或主动脉带等压力过载引起的模型，其模拟例如改变的儿茶酚胺/β肾上腺素能水平^{1，2，3，4，}为临床前研究提供了一种强有力的方法。考虑到基于导管的方法仍然是深入评估心脏收缩力⁵的最广泛使用的方法，我们旨在根据先前的经验（包括对该方法的具体参数的评估）在β肾上腺素能刺激期间通过压力 - 体积环（PVL）测量来精确测量小鼠体内心脏功能^{6， 7}.

为了确定心脏血流动力学参数，可以使用包括成像或基于导管的技术的方法。这两种选择都伴随着优点和缺点，需要为各自的科学问题仔细考虑。成像方法包括超声心动图和磁共振成像（MRI）;两者都已成功用于小鼠。超声心动图测量涉及小鼠高心率所需的高速探头的高初始成本;这是一种相对简单的非侵入性方法，但在理想情况下应该具有识别和可视化心脏结构经验的操作员中，它是可变的。此外，不能直接进行压力测量，并且通过尺寸大小和流量测量的组合获得计算。另一方面，它的优点是可以对同一动物进行多次测量，并且可以监测心脏功能，例如在疾病进展期间。关于体积测量，MRI是金标准程序，但与超声心动图类似，无法进行直接压力测量，只能获得预载荷相关参数⁸。限制因素还包括可用性、分析工作量和运营成本。在这里，基于导管的测量心脏功能的方法是一个很好的替代方案，它还可以直接监测心内压力和确定与负荷无关的收缩性参数，如预负荷可招募卒中^{（PRSW）9。}然而，通过压力 - 电导管（通过电导率测定）测量的心室体积小于MRI测量的心室体积，但组差异保持在相同的范围内^10。为了确定可靠的体积值，需要进行相应的校准，这是PVL测量过程中的关键步骤。它将体积校准比色皿中血液电导率的离体测量（电导率到体积的转换）与体内分析相结合，以在推注高渗盐水^11，12期间心肌平行电导。除此之外，导管在心室内的位置以及电极沿心室纵轴的正确方向对于检测它们产生的周围电场的能力至关重要。仍然随着小鼠心脏尺寸的减小，可以避免由导管脑室内方向变化产生的伪影，即使在扩张的心室^5，10中，但伪影可以在β肾上腺素能刺激下进化^6，13。除了电导方法之外，基于导纳的方法的发展似乎避免了校准步骤，但这里的体积值被高估了^14，15。

由于小鼠是心血管研究中最重要的临床前模型之一，并且心脏的β-肾上腺素能储备是心脏生理学和病理学的核心兴趣，我们在这里提出了一个改进的方案，通过PVL测量在β肾上腺素能刺激期间通过PVL测量来确定小鼠体内的心脏功能。

研究方案

所有动物实验均根据卡尔斯鲁厄地区委员会和海德堡大学的规定（AZ 35-9185.82/A-2/15，AZ 35-9185.82/A-18/15，AZ 35-9185.81/G131/15，AZ 35-9185.81/G121/17）的规定批准和进行，符合欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/ EU的指南。该协议中显示的数据来自野生型C57Bl6 / N雄性小鼠（17±1.4周龄）。在海德堡医学院的动物设施（IBF）中，小鼠在指定的无病原体条件下维持。将小鼠置于12小时的光暗循环中，相对湿度在56-60%之间，每小时换气15次，室温为22°C + / - 2°C。 它们被关在传统的II型或II型笼子中，长期提供动物垫料和纸巾作为浓缩物。标准高压灭菌食品和高压灭菌水可用于随意食用。

1. 仪器和药物溶液的制备

1. 中心静脉导管:将微管（外径0.6毫米）切成约20厘米长的导管。使用镊子将管子的一端拉到23号套管的尖端。对角线切割管子的另一端，以形成可以刺穿股静脉的尖锐尖端。
2. 气管插管:对于插管，切下20号静脉穿刺套管长3厘米，以取出注射器附件。
   1. 如果插管不能完全适合呼吸机连接，请将石膏膜包裹在连接通风设备的管的末端。连接必须稳定并通过增稠密封（图1A）。将20号静脉穿刺套管的金属导针缩短至2.7厘米，并将其用作插管辅助装置。包括光纤维在内的精制插管方法也得到了很好的描述，例如Das和合作者^16。
3. 用于插管的麻醉混合物:将200μL肝素（1000 IU / mL）与50μL0.9%NaCl和750μL2mg / mL依托咪酯混合，来自水包油乳液基产品。每只小鼠使用7μL / g体重（BW）（0.1mg / kg BW丁丙诺啡10mg / kg BW依托咪酯）。
4. 肌肉松弛剂:将100毫克泮库溴铵溶解在100毫升0.9%NaCl中。每只小鼠使用1.0μL / g体重（1mg / kg BW）。
5. 异丙肾上腺素溶液:将100mg异丙肾上腺素溶解在100mL 0.9%NaCl（1μg/ μL）中。准备以下稀释液（表1），并将每个稀释液转移到1 mL注射器中。
   1. 为了获得稀释度1，稀释原液1:1.8。为了获得稀释度2，稀释原液1:6。为了获得稀释度3，将稀释度1稀释成1:10。最后，通过1:10稀释2得到稀释液4。
6. 15%高渗NaCl（w / v）:将1.5g0.9%NaCl溶解在10mL双蒸馏H₂O中。
7. 制备12.5%白蛋白溶液（w / v）:将1.25g牛血清白蛋白溶解在10mL 0.9%NaCl中。将溶液在37°C孵育30分钟。冷却至室温，并用0.45μm孔径注射器过滤器过滤溶液。
8. 设置准备:首先打开加热板并将其设置为39-40°C。 将充满生理盐水的注射器放在加热垫上，并将压力容积回路（PVL）导管转移到注射器中。在使用前预孵育导管至少30分钟以进行稳定。我们使用的设置包括一个1.4-F压力导通导管，一个控制单元和相应的软件，图 1B 以图形方式描述，供应商参考列在 材料表中。

2. 麻醉

1. 插管前30分钟注射丁丙诺啡（腹膜内注射0.1mg / kg BW）。
2. 将鼠标放入预浸有2.5%异氟醚的丙烯酸玻璃室中，并用放置在腔室底部的加热垫预热。
3. 一旦小鼠沉睡（缺乏反射），腹腔内注射含有10mg / kg依托咪酯和肝素（1，200 IU / kg BW）的麻醉混合物（7 mL / kg BW）。

3. 通风

1. 将动物转移到麻醉注射后3-4分钟将动物转移到插管平台（图1C）。鼠标悬挂在牙齿上，背视图面向操作员。
2. 用镊子轻轻抬起舌头。要识别声门，请用第二镊子稍微抬起小鼠的下颚。
3. 小心地将气管插管（图1A）插入气管并取出导杆。
4. 将动物转移到加热板上，将其放在背面，然后将插管连接到小动物呼吸器。
5. 将呼吸频率调整为53.5 x（体重，以克为单位^）-0.26 [min^-1]，如其他人所述^12，并将潮气量调整为11±1 cmH₂O的峰值吸气压。
6. 用胶条小心地将鼠标的四肢固定在加热板上，并在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。
7. 插入直肠温度探头，将核心体温保持在37±0.2°C。
8. 安装单导联心电图并在线监测心率，作为麻醉深度和稳定性的指标。
9. 在没有指间反射时，腹腔内注射1mg / kg肌肉松弛剂泛库溴铵BW。这可以防止PVL测量过程中出现呼吸伪影。

4. 手术

1. 一般性建议
   1. 在手术过程中，用O₂蒸发的~1.5-2%异氟醚通气。异氟醚浓度也可以取决于小鼠品系，性别，年龄和动物体重等变量，但需要单独和实验确定，这里的值是C57BL6 / N小鼠品系的参考。重要的是，呼吸机连接到提取系统，以防止操作员吸入异氟醚。
   2. 使用来自体视显微镜的1.5-4倍之间的放大倍率进行外科手术。
      注意:请参阅有关动物为非生存手术做准备的机构/当地指南。
2. 股骨插管
   1. 用70%乙醇冲洗后肢，切开左腹股沟区域并暴露左股静脉。
   2. 用烧灼术对上腹部动脉和静脉进行爆破。
   3. 用缝合线将股静脉固定在导管通道的远端。
   4. 在股静脉下方缝合线，并准备穿刺部位的结颅。用连接到1mL注射器的准备好的微管（参见步骤1.1）刺穿股静脉。
   5. 系好结，将管子固定在容器内。
   6. 通过用自动注射泵以15μL / min的输注速率输注0.9%NaCl并补充12.5%白蛋白来抵消液体损失。此外，使用预热的0.9%NaCl保持暴露组织湿润。
3. 开 胸 术
   1. 用70%乙醇冲洗胸部。
   2. 切开紧在梨形过程下方的皮肤，并用镊子或烧灼术将胸肌与胸壁钝分开。
   3. 用镊子抬起镊子，然后用烧灼术横向穿过胸壁，直到从下面完全看到隔膜。
   4. 从下面切开横膈膜并暴露心脏顶点。然后用镊子小心地取出心包。
   5. 如前所述^6，在左侧进行有限的肋切开术。
   6. 在下腔静脉下方缝合线，以在后期阶段进行预负荷减少。
   7. 用25号套管（最大4mm）轻轻刺穿心脏顶端。取出插管并插入PV导管，直到所有电极都在心室内。
   8. 通过轻柔的运动和转动来调整导管的位置，直到获得矩形环（图2A）。
   9. 始终使用预热的0.9%NaCl保持所有暴露的组织湿润。

5. 测量

1. 一般性建议
   1. 在测量过程中，用~1.5-2%异氟醚与100%O₂汽化通风。
   2. 在剂量反应方案的每个步骤上执行2次基线测量以及2次腔静脉闭塞。
      注意:重要的是，在第一和第二个腔静脉闭塞后，压力和体积值都恢复到第一次闭塞前的稳态值。这种观察是必要的，以便识别由于脑室内容量连续减少而导致的导管位置的移动。如果导管位置发生偏移，尤其是体积值会移位。
2. 对参数（心率、每搏量、dP/dt_max）进行在线分析，并等待获得稳态心脏功能。有关C57Bl6 / N小鼠中此处使用的设置的预期参数范围，请参阅已发布的结果^6。
3. 将呼吸器停在呼气末位置并记录基线参数。3至5秒后，通过用镊子将缝合线提升到下腔静脉下方来降低心脏预紧力，以获得预紧力独立参数（图2B）。打开呼吸机。等待至少30秒进行第二次闭塞，直到血流动力学参数稳定。
4. 在基础条件下获得测量结果后，通过切换到制备的注射器来进行异丙肾上腺素的剂量反应。在这里，输注速率保持不变，以避免心脏前负荷的改变。更换注射器时，请注意不要吸入气泡。
   1. 等待至少 2 分钟，直到获得新的稳态心脏功能，然后再次在呼气末位置停止呼吸器并记录基线参数。3至5秒后，通过将缝合线提升到下腔静脉下方来减少心脏预负荷，以获得预负荷独立参数。
   2. 等待至少 30 秒，等待第二次遮挡。然后切换到具有下一个异丙肾上腺素浓度的制备注射器，并重复记录基线和预加载无关参数。
      注意:收缩末期压力峰值（ESPS， 图2C）等伪影可能发生在异丙肾上腺素剂量增加期间，这是由导管卡住引起的。在基础参数开始之前发生的伪影可以通过重新定位导管来轻松纠正。

6. 校准

注:校准程序可能因所使用的PVL系统而异。

1. 平行电导校准
   1. 在最后一次测量异丙肾上腺素剂量反应后，将含有15%NaCl溶液的注射器连接到股导管。小心地注入管中剩余的5μL高渗溶液，直到PVL在在线可视化期间稍微向右移动。然后等待循环恢复到稳定状态。
   2. 在呼气结束时停止呼吸器，并在2至3秒内注射一次10μL的15%NaCl。检查PVL是否在在线可视化过程中大部分变宽并向右移动。
2. 电导体积校准
   1. 等待5分钟，不少于，以便推注高渗盐水完全稀释。之后取出导管，并使用1mL注射器和21号套管从跳动心脏的左心室抽取至少600μL血液。此时，动物在深度麻醉和镇痛下通过大量出血，通过停止通气和切除心脏来安乐死。
   2. 将血液转移到预热的（在37°C的水浴中）校准比色皿中，具有已知体积的圆柱体。将PV导管中央放置在每个圆柱体中并记录电导率。通过计算每只动物的标准曲线，电导单位可以转换为绝对体积值。

第7章 分析

1. 在基础条件和异丙肾上腺素刺激下成功测量PVL后，使用适当的PVL分析软件可视化，数字化，计算和提取表征心脏功能的参数（如PRSW，dP / dt，舒张末期压力和体积，收缩末压和体积，松弛常数Tau等）。可以使用标准分析软件执行进一步的统计分析和图形表示。
2. 预载荷独立参数分析
   注意:对于此步骤，标准化过程至关重要。
   1. 选择前5-6个PFL，显示所有测量过程中预载荷递减，用于分析预载荷无关参数（图2D）。在预载荷降低期间选择恒定数量的PFL进行分析将降低所获得参数测量值之间的变异性。
   2. 计算协议每个步骤中两个测量值的平均值。

结果

压力体积环（PVL）测量是分析药物心脏药效学和研究正常和病理条件下转基因小鼠模型心脏表型的强大工具。该协议允许评估成年小鼠模型中的心脏β肾上腺素能储备。在这里，我们描述了异氟醚麻醉联合丁丙诺啡（镇痛药）和泛库溴铵（肌肉松弛剂）下的开胸方法，其重点是通过股静脉导管输注异丙肾上腺素浓度来对β肾上腺素能刺激的心脏反应。该方案中显示的一些代表性数据来自野生型C57Bl6...

讨论

在这里，我们提供了一种方案来分析在增加β肾上腺素能刺激下的小鼠体内心脏功能。该程序可用于解决转基因小鼠或干预中心脏功能的基线参数和肾上腺素能储备（例如，正性肌力和变时性）。与其他确定心脏功能的方法相比，压力 - 体积环（PVL）测量最突出的优势是分析内在的，与负荷无关的心脏功能。所有其他方法（例如，MRI 和超声心动图）只能评估心脏功能的负荷依赖性参数，尤其是无?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4F SPR-839 catheter	Millar Instruments, USA	840-8111
1 ml syringes	Beckton Dickinson, USA	REF303172
Bio Amplifier	ADInstruments, USA	FE231
Bridge-Amplifier	ADInstruments, USA	FE221
Bovine Serum Albumin	Roth, Germany	8076.2
Buprenorphine hydrochloride	Bayer, Germany	4007221026402
Calibration cuvette	Millar, USA	910-1049
Differential pressure transducer MPX	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 39912
Dumont Forceps #5/45	Fine Science tools Inc.	11251-35
Dumont Forceps #7B	Fine Science tools Inc.	11270-20
Graefe Forceps	Fine Science tools Inc.	11051-10
GraphPad Prism	GraphPad Software	Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube	Smiths, USA	004/310/168-1
Etomidate Lipuro	Braun, Germany	2064006
Excel	Microsoft
Heparin	Ratiopharm, Germany	R26881
Hot plate and control unit	Labotec, Germany	Hot Plate 062
Isofluran	Baxter, Germany	HDG9623
Isofluran Vaporizer	Abbot	Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride	Sigma-Aldrich, USA	I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID	Smiths Medical International Ltd, UK	Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 845
MPVS Ultra PVL System	Millar Instruments, USA
NaCl	AppliChem, Germany	A3597
NaCl 0.9% isotonic	Braun, Germany	2350748
Pancuronium-bromide	Sigma-Aldrich, USA	BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus	Harvard Apparatus	Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit	ADInstruments, USA	PL3504
Rechargeable cautery-Set	Faromed, Germany	09-605
Scissors	Fine Science tools Inc.	140094-11
Software LabChart 7 Pro	ADInstruments, USA	LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food	LASvendi GmbH, Germany	Rod18
Stereo microscope	Zeiss, Germany	Stemi 508
Surgical suture 8/0	Suprama, Germany	Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge	Beckton Dickinson, USA	393224
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science tools Inc.	00574-11
Water bath	Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45)	Sarstedt, Germany	Ref. 83.1826