Сердечный ответ на β-адренергическую стимуляцию, определяемый анализом петли давления-объема

Резюме

Здесь мы описываем анализ сердечного давления и объема при увеличении доз внутривенно введенного изопротеренола для определения внутренней сердечной функции и β-адренергического резерва у мышей. Мы используем модифицированный подход с открытой грудной клеткой для измерения контура давления-объема, в который мы включаем вентиляцию с положительным давлением в конце выдоха.

Аннотация

Определение сердечной функции является надежным анализом конечных точек на животных моделях сердечно-сосудистых заболеваний с целью характеристики воздействия конкретных методов лечения на сердце. Благодаря возможности генетических манипуляций мышь стала наиболее распространенной моделью млекопитающих для изучения сердечной функции и поиска новых потенциальных терапевтических целей. Здесь описан протокол определения сердечной функции in vivo с использованием измерений и анализа цикла давления-объема в базальных условиях и при β-адренергической стимуляции путем внутривенной инфузии повышения концентрации изопротеренола. Мы предоставляем усовершенствованный протокол, включающий поддержку вентиляции с учетом положительного давления в конце выдоха для смягчения негативных эффектов во время измерений с открытой грудной клеткой и мощную анальгезию (бупренорфин), чтобы избежать неконтролируемого стресса миокарда, вызванного болью во время процедуры. Все вместе подробное описание процедуры и обсуждение возможных ловушек позволяет проводить высоко стандартизированный и воспроизводимый анализ контура давления-объема, уменьшая исключение животных из экспериментальной когорты за счет предотвращения возможной методологической предвзятости.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания обычно влияют на сердечную функцию. Этот вопрос указывает на важность оценки in vivo подробной сердечной функции на моделях болезней животных. Эксперименты на животных окружены рамками трех руководящих принципов Rs (3R) (Reduce/Refine/Replace). В случае понимания сложных патологий, связанных с системными реакциями (т.е. сердечно-сосудистыми заболеваниями) на текущем уровне развития, основным вариантом является уточнение имеющихся методов. Уточнение также приведет к сокращению требуемой численности животных за счет меньшей изменчивости, что повышает мощность анализа и выводов. Кроме того, комбинация измерений сократимости сердца с животными моделями сердечных заболеваний, включая те, которые вызваны нейрогуморальной стимуляцией или перегрузкой давления, такой как полоса аорты, которая имитирует, например, измененные катехоламины / β-адренергические уровни^1,2,3,4,обеспечивает мощный метод доклинических исследований. Принимая во внимание, что катетерный метод остается наиболее широко используемым подходом для углубленной оценки сократимости сердца^5,мы стремились представить здесь уточненное измерение сердечной функции in vivo у мышей с помощью измерений петли давления-объема (PVL) во время β-адренергической стимуляции на основе предыдущего опыта, включая оценку специфических параметров этого подхода^{6, 7}.

Для определения гемодинамических параметров сердца доступны подходы, которые включают в себя визуализацию или катетерные методы. Оба варианта сопровождаются преимуществами и недостатками, которые необходимо тщательно рассмотреть для соответствующего научного вопроса. Подходы к визуализации включают эхокардиографию и магнитно-резонансную томографию (МРТ); оба были успешно использованы на мышах. Эхокардиографические измерения связаны с высокими первоначальными затратами на высокоскоростной зонд, необходимый для высокой частоты сердечных сокращений мышей; это относительно простой неинвазивный подход, но он варьируется среди операторов, которые в идеале должны иметь опыт распознавания и визуализации сердечных структур. Кроме того, никакие измерения давления не могут быть выполнены напрямую, и расчеты получаются из комбинации величин размера и измерений расхода. С другой стороны, он имеет то преимущество, что несколько измерений могут быть выполнены на одном и том же животном, а сердечная функция может контролироваться, например, во время прогрессирования заболевания. Что касается измерения объема, МРТ является золотым стандартом процедуры, но, подобно эхокардиографии, измерения прямого давления невозможны, и можно получить только параметры, зависящие от предварительной нагрузки^8. Ограничивающими факторами также являются доступность, усилия по анализу и эксплуатационные расходы. Здесь катетерные методы измерения сердечной функции являются хорошей альтернативой, которая дополнительно позволяет осуществлять прямой мониторинг внутрисердечного давления и определять независимые от нагрузки параметры сократимости, такие как преднагрузочная рекрутируемая ударная работа (PRSW)^9. Тем не менее, желудочковые объемы, измеренные катетером проводимости давления (путем определения проводимости), меньше, чем из МРТ, но групповые различия поддерживаются в том же диапазоне^10. Для определения надежных объемных значений требуется соответствующая калибровка, которая является критическим этапом во время измерений PVL. Он сочетает в себе измерения ex vivo проводимости крови в объемно-калиброванных кюветах (преобразование проводимости в объем) с анализом in vivo на параллельную проводимость миокарда при болюсном введении гипертонического физиологического раствора^11,12. Кроме того, позиционирование катетера внутри желудочка и правильная ориентация электродов вдоль продольной оси желудочка имеют решающее значение для способности обнаружения окружающего электрического поля, создаваемого ими. Еще при уменьшенных размерах мышиного сердца можно избежать артефактов, образующихся при изменениях внутрижелудочковой ориентации катетера, даже в расширенных желудочках^5,10,но артефакты могут развиваться при β-адренергической стимуляции^6,13. В дополнение к методам проводимости появилась разработка метода на основе допуска, чтобы избежать этапов калибровки, но здесь объемные значения довольно завышены^14,15.

Поскольку мышь является одной из наиболее важных доклинических моделей в сердечно-сосудистых исследованиях, а β-адренергический резерв сердца представляет центральный интерес в физиологии и патологии сердца, мы представляем здесь уточненный протокол для определения in vivo сердечной функции у мышей путем измерений PVL во время β-адренергической стимуляции.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с регламентом Регионального совета Карлсруэ и Гейдельбергского университета (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) соответствуют руководящим принципам Директивы 2010/63/EU Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях. Данные, показанные в этом протоколе, получены от самцов мышей дикого типа C57Bl6/N (17 ± возрасте 1,4 недели). Мыши содержались в определенных безпатогенных условиях на животноводческом объекте (IBF) Гейдельбергского медицинского факультета. Мышей размещали в 12-часовом цикле «свет-темнота» с относительной влажностью между 56-60%, 15-кратным изменением воздуха в час и комнатной температурой 22 ° C + / - 2 ° C. Они содержались в обычных клетках типа II или типа II, долго снабженных подстилкой животных и папиросной бумагой в качестве обогащения. Стандартная автоклавная пища и автоклавная вода были доступны для потребления ad libitum.

1. Приготовление инструментов и лекарственных растворов

1. Центральный венозный катетер: Разрезайте микротрубку (наружный диаметр 0,6 мм) на катетерные трубки длиной ~ 20 см. Используйте щипцы, чтобы вытянуть один конец трубки на кончик канюли 23-го калибра. Отрежьте другой конец трубки по диагонали, чтобы создать острый наконечник, который может проткнуть бедренную вену.
2. Эндотрахеальная трубка: Для интубационной трубки вырежьте венипунктуру 20-калиберной канюли длиной 3 см, чтобы удалить крепление шприца.
   1. Если интубационная трубка не подходит для подключения вентилятора идеально, оберните парапленку над концом трубы, где подключено вентиляционное устройство. Соединение должно быть стабильным и герметичным утолщением(рисунок 1А). Укоротите металлический направляющий штифт венипунктуры-канюли 20-го калибра до 2,7 см и используйте его в качестве вспомогательного средства для интубации. Усовершенствованные подходы к интубации, включая световые волокна для облегчения визуализации трахеи, также хорошо описаны, например, Дасом и соавторами^16.
3. Анестезирующая смесь, используемая для интубации: Смешайте 200 мкл гепарина (1000 МЕ/мл) с 50 мкл 0,9% NaCl и 750 мкл 2 мг/мл этомидата из продукта на основе эмульсии «масло-вода». Используйте 7 мкл/г массы тела (BW) для каждой мыши (0,1 мг/кг BW бупренорфина 10 мг/кг BW этомидата).
4. Миорелаксант: Растворить 100 мг панкурония-бромида в 100 мл 0,9% NaCl. Используйте 1,0 мкл/г массы тела (1 мг/кг BW) для каждой мыши.
5. Растворы изопротеренола: Растворить 100 мг изопротеренола в 100 мл 0,9% NaCl (1 мкг/мкл). Подготовьте следующие разведения(таблица 1)и переложите каждое в шприц объемом 1 мл.
   1. Для получения разведения 1 разбавить бульон 1:1,8. Для получения разведения 2 разбавьте бульон 1:6. Для получения разбавления 3 разбавите разбавление 1 до 1:10. Наконец, получают разбавление 4 путем разбавления 1:10 разбавления 2.
6. 15% гипертонический NaCl (мас./об.): Растворить 1,5 г 0,9% NaCl в 10 мл двойного дистиллированного_H2O. Процедить раствор с помощью 0,45 мкм порового шприцевого фильтра.
7. Приготовление 12,5% раствора альбумина (мас./об.): Растворить 1,25 г бычьего сывороточного альбумина в 10 мл 0,9% NaCl. Инкубировать раствор при 37 °C в течение 30 мин. Охладите до комнатной температуры и процедите раствор с помощью шприцевого фильтра длиной 0,45 мкм.
8. Подготовка установки: Сначала включите нагревательную пластину и установите ее на 39-40 °C. Поместите шприц, наполненный физиологическим раствором, на грелку и перенесите катетер с нажимно-объемной петлей (PVL) в шприц. Предварительно инкубируйте катетер в течение не менее 30 мин перед использованием для стабилизации. Установка, которую мы используем, состоит из катетера 1,4-F с проводимостью под давлением, блока управления и соответствующего программного обеспечения, и она графически описана на рисунке 1B, а ссылки на поставщиков перечислены в таблице материалов.

2. Анестезия

1. Вводят бупренорфин (0,1 мг/кг BW внутрибрюшинно) за 30 мин до интубации.
2. Поместите мышь в акриловую стеклянную камеру, предварительно насыщенную 2,5% изофлураном и предварительно прогретую грелкой, помещенной на основание камеры.
3. Как только мышь заснет (отсутствие рефлекса), внутрибрюшинно вводят анестезирующую смесь (7 мл/кг BW), содержащую 10 мг/кг этомидата и гепарина (1 200 МЕ/кг BW).

3. Вентиляция

1. Переместите животное на интубационную платформу(рисунок 1С)через 3-4 минуты после инъекции анестетика. Мышь свисает с зубов спинным видом лицом к оператору.
2. Осторожно приподнимите язык щипцами. Чтобы определить голосовую щель, слегка приподнимите нижнюю челюсть мыши вторыми щипцами.
3. Осторожно вставьте эндотрахеальную трубку(рисунок 1А)в трахею и снимите направляющий стержень.
4. Перенесите животное на нагревательную пластину, поместите его на спину и подключите интубационную трубку к респиратору мелкого животного.
5. Отрегулируйте частоту дыхания до 53,5 х (масса тела в граммах)^-0,26 [мин^-1],как описано другими¹², и приливные объемы до пиковых давлений вдоха 11 ± 1 смН₂О. Установите PEEP 2 смГ₂O.
6. Аккуратно зафиксируйте конечности мыши на нагревательной пластине клейкими полосками и нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
7. Вставьте ректальный датчик температуры и поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,2 °C.
8. Установите 1-отведенную ЭКГ и контролируйте частоту сердечных сокращений в режиме онлайн в качестве индикатора глубины и стабильности анестезии.
9. При отсутствии межпальцевых рефлексов вводят 1 мг/кг BW миорелаксанта панкуроний-бромида внутрибрюшинно. Это предотвращает появление респираторных артефактов во время измерений PVL.

4. Хирургия

1. Общие рекомендации
   1. Во время операции вентилируют с ~1,5-2% изофлураном, испаряют с_О2. Концентрация изофлурана также может зависеть от таких переменных, как штамм мыши, пол, возраст и вес животных, но она должна быть индивидуально и экспериментально определена, и значения здесь являются справочными для штамма мыши C57BL6 / N. Важно отметить, что вентилятор подключен к системе экстракции, чтобы оператор не вдыхал изофлуран.
   2. Используйте увеличение в 1,5-4 раза от стереомикроскопа для хирургических процедур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к институциональному/местному руководству по подготовке животного к операциям, не связанным с выживанием.
2. Канюляция бедренной кости
   1. Промыть заднюю конечность 70% этанолом, разрезать левую паховую область и обнажить левую бедренную вену.
   2. Взорвать эпигастральную артерию и вену прижиганием.
   3. Обжигайте бедренную вену швом, наложенным дистально к доступу к катетеру.
   4. Пропустите шов под бедренную вену и подготовьте узел черепа из места прокола. Проколите бедренную вену с помощью подготовленной микротрубки (см. этап 1.1), прикрепленной к шприцу объемом 1 мл.
   5. Завяжите узел, чтобы зафиксировать трубку внутри сосуда.
   6. Противодействовать потере жидкости путем инфузии 0,9% NaCl, дополненного 12,5% альбумином со скоростью инфузии 15 мкл/мин с помощью автоматического шприцевого насоса. Кроме того, держите открытые ткани влажными, используя предварительно подогретый 0,9% NaCl.
3. Торакотомии
   1. Промыть грудную клетку 70% этанолом.
   2. Прорежьте кожу прямо под клифозным отростком и тупо отделите грудные мышцы от грудной стенки щипцами или прижиганием.
   3. Поднимите клифозный отросток щипцами, а затем прорежьте стенку грудной клетки, двигаясь сбоку с обеих сторон прижиганием, пока диафрагма не будет полностью видна снизу.
   4. Разрезайте диафрагму снизу и обнажите сердечную вершину. Затем аккуратно удалите перикард щипцами.
   5. Выполните ограниченную костотомию с левой стороны, как описано^{ранее 6.}
   6. Пропустите шов под нижней кавальной веной, чтобы выполнить снижение преднагрузки на более поздних стадиях.
   7. Аккуратно проколоть сердечную верхушку канюлей 25-го калибра (максимум 4 мм). Извлеките канюлю и вставьте фотоэлектр до тех пор, пока все электроды не окажутся в желудочке.
   8. Отрегулируйте положение катетера плавными движениями и поворотами до получения петель прямоугольной формы(рисунок 2А).
   9. Всегда держите все открытые ткани влажными, используя предварительно подогретый 0,9% NaCl.

5. Измерения

1. Общие рекомендации
   1. Во время измерений вентилируют с ~1,5-2% изофлураном испаряют со 100%_О2.
   2. Выполните 2 базовых измерения, а также 2 окклюзии полой вены на каждом этапе протокола дозового ответа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы после первой и второй окклюзии полой вены значения давления и объема возвращались к стационарным значениям, как и до первой окклюзии. Это наблюдение необходимо для того, чтобы распознать сдвиг положения катетера из-за последовательного уменьшения внутрижелудочкового объема. Если бы имело место сдвиг в положении катетера, особенно объемные значения были бы смещены.
2. Выполните он-лайн анализ параметров (частота сердечных сокращений, ударный объем, dP/dt_max)и дождитесь получения стационарной сердечной функции. Для ожидаемого диапазона параметров с используемой здесь настройкой в мышах C57Bl6/N, пожалуйста, обратитесь к опубликованным результатам⁶.
3. Остановите респиратор в положении выдоха и запишите исходные параметры. Через 3 - 5 секунд уменьшить сердечную преднагрузку, подняв шов под нижнюю кавальную вену щипцами с целью получения независимых параметров преднагрузки(рисунок 2В). Включите вентилятор. Подождите не менее 30 секунд для второй окклюзии, пока гемодинамические параметры не стабилизируются.
4. После получения измерений в базальных условиях приступают к дозе-ответу изопротеренола путем перехода на подготовленные шприцы. Здесь скорость инфузии остается неизменной, чтобы избежать модификаций сердечной преднагрузки. Следите за тем, чтобы не наполнять пузырьки воздуха при смене шприца.
   1. Подождите не менее 2 минут, пока не будет получена новая стационарная сердечная функция, затем снова остановите респиратор в положении конечного выдоха и запишите исходные параметры. Через 3-5 секунд уменьшают сердечную преднагрузку, поднимая шов под нижней кавальной веной с целью получения независимых параметров преднагрузки.
   2. Подождите не менее 30 секунд для второй окклюзии. После этого переходите на подготовленный шприц со следующей концентрацией изопротеренола и повторяют записи исходных и преднагрузочных независимых параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Артефакты, такие как конечный систолический скачок давления (ESPS, рисунок 2C),могут возникать во время увеличения дозировки изопротеренола, что является результатом захвата катетера. Артефакты, возникающие до начала базальных параметров, могут быть легко исправлены путем изменения положения катетера.

6. Калибровка

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры калибровки могут варьироваться в зависимости от используемой системы PVL.

1. Калибровка параллельной проводимости
   1. Подключите шприц, содержащий 15% раствор NaCl, к бедренной канюле после последнего измерения дозы-ответа изопротеренола. Осторожно настаивайте 5 мкл гипертонического раствора, оставшегося в трубке, пока PVL слегка не сместится вправо во время он-лайн визуализации. Затем подождите, пока петли не вернутся в установившееся состояние.
   2. Остановите респиратор по истечении срока действия и введите один болюс 10 мкл 15% NaCl в течение 2 - 3 секунд. Проверьте, не расширяются ли PVL в значительной степени и не смещаются ли они вправо во время онлайн-визуализации.
2. Калибровка по отношению к объему
   1. Подождите 5 мин, не меньше, чтобы гипертонический солевой болюс полностью разбавился. После этого извлеките катетер и извлеките не менее 600 мкл крови из левого желудочка бьющегося сердца с помощью шприца 1 мл и канюли 21-го калибра. В этот момент животное усыпляется под глубоким наркозом и обезболиванием путем массивного кровотечения, путем остановки вентиляции и удаления сердца.
   2. Переведите кровь в предварительно нагретую (на водяной бане при 37 °С) калибровочную кювету с цилиндрами известного объема. Поместите фотоэлектр pv в центр каждого цилиндра и запишите проводимость. Вычисляя стандартную кривую для каждого животного, единицы проводимости могут быть преобразованы в абсолютные объемные значения.

7. Анализ

1. После успешных измерений PVL в базальных условиях и стимуляции изопротеренола визуализируйте, оцифровывайте, рассчитывайте и извлекайте параметры, характеризующие сердечную функцию (например, PRSW, dP / dt, конечное диастолическое давление и объем, конечное систолическое давление и объем, константа релаксации Tau, среди прочих), используя соответствующее программное обеспечение для анализа PVL. Дальнейший статистический анализ и графические представления могут быть выполнены с помощью стандартного аналитического программного обеспечения.
2. Анализ независимых параметров преднатяга
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага крайне важно стандартизировать процедуру.
   1. Выберите первые 5-6 PRL, показывающие уменьшающуюся преднатяг во всех измерениях для анализа независимых параметров преднагрузки(рисунок 2D). Постоянное количество PRL, выбранных для анализа при снижении преднагрузки, уменьшит изменчивость между измерениями полученных параметров.
   2. Рассчитайте среднее значение двух измерений на каждом шаге протокола.

Результаты

Измерение объема давления (PVL) является мощным инструментом для анализа сердечной фармакодинамики лекарств и исследования сердечного фенотипа генетически модифицированных моделей мышей в нормальных и патологических условиях. Протокол позволяет оценить сердечный β-адренергический ?...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем протокол для анализа сердечной функции in vivo у мышей при увеличении β адренергической стимуляции. Процедура может быть использована для решения как исходных параметров сердечной функции, так и адренергического резерва (например, инотропии и хронотропии) у генети...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4F SPR-839 catheter	Millar Instruments, USA	840-8111
1 ml syringes	Beckton Dickinson, USA	REF303172
Bio Amplifier	ADInstruments, USA	FE231
Bridge-Amplifier	ADInstruments, USA	FE221
Bovine Serum Albumin	Roth, Germany	8076.2
Buprenorphine hydrochloride	Bayer, Germany	4007221026402
Calibration cuvette	Millar, USA	910-1049
Differential pressure transducer MPX	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 39912
Dumont Forceps #5/45	Fine Science tools Inc.	11251-35
Dumont Forceps #7B	Fine Science tools Inc.	11270-20
Graefe Forceps	Fine Science tools Inc.	11051-10
GraphPad Prism	GraphPad Software	Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube	Smiths, USA	004/310/168-1
Etomidate Lipuro	Braun, Germany	2064006
Excel	Microsoft
Heparin	Ratiopharm, Germany	R26881
Hot plate and control unit	Labotec, Germany	Hot Plate 062
Isofluran	Baxter, Germany	HDG9623
Isofluran Vaporizer	Abbot	Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride	Sigma-Aldrich, USA	I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID	Smiths Medical International Ltd, UK	Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 845
MPVS Ultra PVL System	Millar Instruments, USA
NaCl	AppliChem, Germany	A3597
NaCl 0.9% isotonic	Braun, Germany	2350748
Pancuronium-bromide	Sigma-Aldrich, USA	BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus	Harvard Apparatus	Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit	ADInstruments, USA	PL3504
Rechargeable cautery-Set	Faromed, Germany	09-605
Scissors	Fine Science tools Inc.	140094-11
Software LabChart 7 Pro	ADInstruments, USA	LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food	LASvendi GmbH, Germany	Rod18
Stereo microscope	Zeiss, Germany	Stemi 508
Surgical suture 8/0	Suprama, Germany	Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge	Beckton Dickinson, USA	393224
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science tools Inc.	00574-11
Water bath	Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45)	Sarstedt, Germany	Ref. 83.1826