研究脊椎动物轴向伸长和分割的三维和四维可视化分析方法

摘要

在这里，我们描述了计算工具和方法，这些工具和方法允许在轴向伸长和分割的背景下可视化和分析小鼠胚胎的三维和四维图像数据，通过toto光学投影断层扫描以及通过使用多光子显微镜进行实时成像和全贴装免疫荧光染色获得。

摘要

体细胞发生是脊椎动物胚胎发育的标志。多年来，研究人员一直在使用包括离体和体外方法在内的各种技术在各种生物体中研究这一过程。然而，大多数研究仍然依赖于对二维（2D）成像数据的分析，这限制了对发育过程的正确评估，例如轴向延伸和涉及复杂3D空间中高度动态相互作用的发生。在这里，我们描述了允许小鼠实时成像采集，数据集处理，可视化和分析3D和4D的技术，以研究参与这些发育过程的细胞（例如，神经中胚层祖细胞）。我们还为小鼠胚胎中的光学投影断层扫描和全挂载免疫荧光显微镜（从样品制备到图像采集）提供分步方案，并展示了我们开发的用于处理和可视化3D图像数据的管道。我们扩展了其中一些技术的使用，并突出了不同可用软件（例如，Fiji/ImageJ，Drishti，Amira和Imaris）的特定功能，这些功能可用于提高我们当前对轴向延伸和somite形成（例如，3D重建）的理解。总而言之，这里描述的技术强调了3D数据可视化和分析在发育生物学中的重要性，并可能有助于其他研究人员在脊椎动物轴向延伸和分割的背景下更好地处理3D和4D图像数据。最后，这项工作还采用了新的工具来促进脊椎动物胚胎发育的教学。

引言

脊椎动物身体轴的形成是胚胎发育过程中发生的高度复杂和动态的过程。在原肠胚形成结束时[在小鼠中，在胚胎日（E）8.0左右]，一组称为神经中层祖细胞（NMPs）的上胚层祖细胞成为头到尾序列中轴向延伸的关键驱动因素，在颈部，躯干和尾巴形成过程中产生神经管和旁轴中皮组织^{1，2，3，4}.有趣的是，这些NMP在尾部外胚层中占据的位置似乎在分化成中胚层或神经外胚层⁵的决定中起着关键作用。虽然我们目前缺乏NMP的精确分子指纹，但这些细胞通常被认为共表达T（Brachyury）和Sox2^5，6。调节NMP命运决策的确切机制（即，它们是否采用神经或中皮途径）才刚刚开始被精确定义。 Tbx6 在原始条纹区域的表达是NMP命运决定的早期标志物，因为该基因参与中胚层^6，7的诱导和规范。有趣的是，早期的中胚层细胞似乎表达高水平的Epha1⁸，Wnt / β-catenin信号传导以及 Msgn1 也被证明在轴旁中胚层分化和sumite形成中起重要作用^9，10。在单细胞水平上对NMP进行完整的时空分析肯定有助于充分了解控制中胚层规范的分子机制。

体细胞（椎骨前体）的形成是脊椎动物的一个关键特征。在轴向伸长过程中，轴旁中胚层被分割成一系列称为somites的双侧重复单元。茴香的数量和形成新节段所需的时间因物种^11，12而异。Somitogenesing涉及周期性信号振荡（称为"分割时钟"），可以通过预定中胚层（例如 Lfng）中Notch，Wnt和Fgf信号通路的几个基因的循环表达来观察到^11，12。目前的体细胞生成模型还假设存在"成熟波前"，这是一系列复杂的信号梯度，涉及Fgf，Wnt和视黄酸信号传导，定义了每个新索米特后边界的位置。因此，"分割时钟"和"成熟波前"之间的协调相互作用对于这些椎骨前体模块的产生至关重要，因为这些关键形态发生过程中的扰动可导致胚胎致死性或先天性畸形（例如脊柱侧弯）的形成^13，14，15。

尽管最近在成像技术、生物影像分析方法和软件方面取得了重大进展，但大多数轴向伸长和体分裂的研究仍然依赖于单一/分离的二维图像数据（例如切片），这不允许完整的多维组织可视化，并使胚胎发育过程中发生的病理性畸形（即由于突变） 与 正常形态变异之间的明确区分复杂化¹⁶.3D成像已经发现了新的形态发生运动，以前没有通过标准2D方法^{17，18，19，20}识别，突出了toto成像在了解脊椎动物体发生和轴向伸展机制方面的力量。

小鼠胚胎的3D和4D显微镜，特别是实时成像，在技术上具有挑战性，需要在样品制备，图像采集和数据预处理过程中采取关键步骤，以便进行准确和有意义的时空分析。在这里，我们描述了用于小鼠胚胎的活体成像和全装载免疫荧光染色的详细方案，可用于在轴向延伸和分割期间研究NMP和中胚层细胞。此外，我们还描述了一种用于老年胚胎和胎儿的光学投影断层扫描（OPT）的方案，该协议允许3D可视化和量化可能由体细胞生成期间的问题（例如骨融合和脊柱侧弯）引起的病理异常^13，21，22。最后，我们说明了3D成像重建在脊椎动物分割和轴向伸长的研究和教学中的力量。

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研究方案

涉及动物的实验遵循葡萄牙（Portaria 1005/92）和欧洲（指令2010/63 / EU）关于住房，畜牧业和福利的立法。该项目由"塞内加尔古尔本基安研究所"伦理委员会和葡萄牙国家实体"食品和兽医协会"（许可证编号:014308）审查和批准。

1. 3D和4D成像的样品制备

注意:在这里，我们提供了有关如何解剖和制备小鼠E8.25至E10.5胚胎以进行活体成像（1.1），E7.5至E11.5胚胎用于整个安装免疫荧光显微镜（1.2）和胎儿以进行光学投影断层扫描（1.3）的详细说明。

1. 用于实时成像的样品制备
   1. 小鼠胚胎解剖和准备活体成像（例如，LuVeLu报告 ^基因23）。
      1. 在预热的M2培养基（37°C）中解剖E8.25和E10.5之间的小鼠胚胎。使用干净的镊子轻轻取出卵黄囊，并用新鲜的M2培养基洗涤胚胎一次，以除去解剖过程中产生的血液和碎屑。
         注意:重要的是要避免以任何方式损坏胚胎，否则在活体成像过程中将无法正常发育。
      2. 在现场成像过程中，在加热室（37°C），65%O₂ 和5%CO₂ 环境（N₂ 平衡）中，在低葡萄糖DMEM培养基中补充了10%HyClone定义的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素，将胚胎孵育。
         注意:这些培养条件允许胚胎发育发生约10小时。其他方案^9，10，使用不同的培养条件，可能允许更长的周期。
2. 免疫荧光显微镜的样品制备
   1. 小鼠胚胎解剖和固定程序
      1. 在冷（4°C）磷酸盐缓冲盐水（PBS）或M2培养基中从E7.5到E11.5解剖小鼠胚胎。去除所有胚胎外膜（例如，Reichart膜或卵黄囊）后，用新鲜的PBS清洗胚胎以除去解剖过程中产生的血液和碎屑。
      2. 将胚胎在4°C下固定在PBS中4%多聚甲醛（PFA）中，时间见 表1。
         注意 - PFA 应在通风橱内处理

         发育阶段	建议固定时间 （PFA 4%）
         E7.5	1小时30分
         E8.5	2小时
         E9.5系列	3小时
         E10.5	4小时
         E11.5	4小时

         表1 - 不同发育阶段胚胎的固定时间
      3. 固定后，在PBS中洗涤胚胎至少两次（每个5-10分钟）以完全去除PFA。此时，胚胎可以直接进入免疫荧光染色方案（步骤1.2.2）或可以脱水并储存以备将来使用（步骤1.2.1.4）。
      4. 如果需要，将胚胎在-20°C下长期储存在100%甲醇中。
         1. 为了改善组织保存，胚胎逐渐脱水，甲醇浓度增加10%（在PBS中稀释），每步骤在室温（RT）下在振荡器上10分钟，直到达到100%甲醇。使用新鲜的等分试样更换100%甲醇一次。
         2. 在反向甲醇/ PBS系列之后通过重新水化来恢复冷冻胚胎，每个步骤在振荡器上在室温下10分钟，并在PBS中进行最终洗涤（两次，每次5-10分钟），然后进入免疫染色方案。
            注意 - 甲醇应在通风橱内处理。
   2. 全挂载免疫荧光染色
      注:以下免疫荧光染色方案改编自Osorno等人²⁴中描述的程序。所有洗涤都应在摇摇床上进行。在封闭步骤之后，在4°C下进行孵育，以确保抗体的完整性/保存。
      1. 在含有0.1%Triton X-100（0.1%PBST）的PBS中洗涤胚胎三次（每次30分钟），然后在0.5%PBST中洗涤一次1小时（RT）以改善透气性。
      2. 为了减少非特异性结合，在室温下在PBS（pH 7.5）中洗涤1M甘氨酸30分钟。
      3. 在0.1%PBST中洗涤三次30分钟以完全除去甘氨酸。
      4. 将胚胎在4°C下在含有以下封闭溶液中孵育过夜:3%的血清（来自产生二抗的动物物种），1%的牛血清白蛋白（BSA）和0.1%的Triton X-100，在PBS中。
      5. 在封闭溶液中稀释一抗（对于T和Sox2抗体，通常为1:200），并在4°C下孵育两到三天。
      6. 在加入二抗之前，在4°C下在0.1%PBST中洗涤胚胎三次（每次30分钟）。 在封闭溶液（1:1000）中稀释二抗，并在4°C下孵育2天，避光。
      7. 在4°C下在0.1%PBST中洗涤胚胎六次（每次30分钟）。
      8. 对于核复染，将胚胎在4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）中孵育，在PBST中稀释1:500，在4°C的振荡器上过夜，避光。
      9. 最后，在4°C下在0.1%PBST中洗涤胚胎三次（每次30分钟）。
   3. 组织清理和玻片制备
      1. 使用水杨酸甲酯或苯甲醇与苯甲酸苄酯（BABB）的混合物进行组织清洗
         1. 在使用水杨酸甲酯或BAB清除之前，通过甲醇/ PBS系列将胚胎置于100%甲醇中，通过甲醇浓度连续增加10%（在4°C下每个10分钟的孵育时间）完全脱水胚胎。要实现完全脱水，请将100%甲醇更换为新鲜的甲醇，然后等待10分钟。
         2. 通过将一系列水杨酸甲酯或BABB嵌入甲醇中，浓度连续增加20%，每步孵育20分钟，进行胚胎清除。当水杨酸甲酯或BABB溶液达到100%时，对新鲜溶液进行两次额外的改变。
            注意:水杨酸甲酯和BAB均应在通风橱内处理。
            注意:为了正确清除，胚胎必须完全脱水。在清除溶液系列中，甲醇与水杨酸甲酯或BABB完全混合也很重要。
         3. 胚胎变得完全透明后，优先使用荧光立体镜单独处理它们，以减少组织损伤的机会。
         4. 对于成像，将胚胎安装在75 mm x 25 mm凹陷凹面玻璃载玻片或20 mm x 60 mm #1.5盖玻片中。如有必要，后一种选择将允许从两侧进行成像，但它更加脆弱且难以密封。使用牙签，细棉头，巴斯德移液器或任何其他类似仪器将胚胎移植到显微镜载玻片中。
         5. 为避免压缩胚胎，添加由#1盖玻片（170μm厚），硅胶或薄金属垫圈制成的垫片。然后添加一滴安装介质，用#1或#0 20x20 mm盖玻片盖住并密封。
         6. 如果使用玻璃或金属垫片，请用熔化的石蜡密封以更好地稳定制剂 - 不要用指甲油密封，因为它与水杨酸甲酯或BAB溶解。为避免气泡，将盖玻片放在一侧，然后逐渐轻轻地将其侧向滑动;如有必要，添加更多介质。
            注意:请观看视频以更好地了解如何操作清除的胚胎以及如何将它们安装在显微镜载玻片上。
      2. 使用RapiClear清除组织
         1. 使用RapiClear时，不需要胚胎脱水。步骤1.2.2.9之后，将胚胎置于75mm x 25mm凹陷凹陷载玻片的中心，取出显微镜凹陷载玻片中的所有PBST并加入200μL清除溶液。
         2. 避光10分钟后，当胚胎开始变得透明时，更换清除溶液，再等待20分钟（避光），然后用盖玻片覆盖，从一侧开始，轻轻地向另一侧移动。
            注意:完全清除胚胎的时间可能会从几分钟到一夜之间，具体取决于胚胎的阶段和大小。此外，整个过程应在立体显微镜下完成。为了更好地了解清除和显微镜载玻片的制备，请参阅视频协议。
3. 用于光学投影断层扫描的样品制备
   注意:以下过程改编自以前的协议^19,25,26.将描述用于分析E18.5小鼠胎儿的方案。
   1. 小鼠胎儿解剖和固定程序
      1. 在冷（4°C）PBS中解剖E18.5小鼠胎儿，去除所有胚胎外膜，然后在新鲜的PBS中洗涤胎儿几次，以除去解剖过程中产生的血液和碎屑。
      2. 将胎儿固定在PBS中制造的4%PFA中，在4°C下放置5至7天。
      3. 在PBS中洗涤胎儿一次（15分钟），然后在脱矿质水或PBS中洗涤三次（每个30分钟）。在摇摇杯上进行洗涤。
      4. 通过在增加浓度的甲醇溶液中孵育（在振荡器上在室温下25分钟串联）使胎儿脱水（在脱矿质水或PBS中稀释的10%）直到100%甲醇。
      5. 更换100%甲醇溶液（使用新鲜等分试样）三次（每次20分钟）以确保完全脱水。然后可以将胚胎储存在-20°C或直接（一天后）进行漂白过程（步骤1.3.2）。
   2. 漂白工艺
      1. 为了去除天然色素沉着，将胎儿（单独）在摇摇杯上孵育，首先在甲醇中5%H₂0₂中孵育一天，然后在甲醇中孵育10_{%H2 0 2}，长达3天，直到胚胎失去所有天然色素沉着。
         注意:H₂O₂ 应在通风橱内轻轻处理。当与试样接触时，含有H₂O₂的漂白溶液会产生蒸汽，因此，在整个漂白过程中，含有胎儿的管应保持打开状态。一些漂白方案建议H₂O₂与甲酰胺的组合。如果使用这种替代品，必须格外小心，因为在未稀释的甲酰胺_{中添加H2 O 2}会导致爆炸。
      2. 在脱矿质水中以反向甲醇系列（减少10%）逐渐将胚胎再水化，每个在振荡器上在室温下孵育20分钟，最后在脱矿质水中洗涤三次（每个30分钟）。等待一天，更换软化水并进一步进行。
         注:参见 补充图1 ，了解漂白过程的代表性结果。
   3. 脱矿质协议
      注意:脱矿质是可选的，但建议胎儿或幼崽使用。
      1. 通过在42°C下在0.1 M EDTA中洗涤胎儿几个小时[另见Cho等人²⁷]进行脱矿质，然后用脱矿质水洗涤五次（每次20分钟）以完全除去EDTA。在摇床上执行所有程序。
   4. 用于清除的样品制备
      1. 将胎儿嵌入1%琼脂糖阻滞中。为了制备这些块，用融化的琼脂糖填充50mL塑料管或注射器（通过切断注射器的出口侧并使用柱塞阻挡另一侧来构建圆柱形空间），将胎儿置于琼脂糖中的垂直位置，并在琼脂糖凝固过程中借助镊子将此位置保持在块的中心。
      2. 将带有块的模具置于4°C（30分钟）下，使琼脂糖完全果冻。如果胎儿在块内的位置不正确或出现气泡，通过将块置于50°C过夜来融化琼脂糖，并在第二天重复该过程。
      3. 将琼脂糖块与胎儿一起从模具中取出，并将其放入装有脱矿质水的容器中。15分钟后用新鲜的软化水代替。
      4. 在用BABB清除之前，使标本脱水。为了更好地保持组织的完整性，胎儿逐渐脱水，甲醇浓度增加10%（在脱矿质水或PBS中稀释），每步在振荡器上RT下超过45分钟，直到达到100%甲醇。
      5. 更换100%甲醇（使用新鲜的等分试样），首先在一小时内更换四次，然后在第二天再次更换，以确保完全脱水。
   5. 用于 OPT 成像的清除过程和样品安装
      1. 在摇床上通过甲醇中的一系列（每个2.5小时）BABB溶液清除胎儿，BABB浓度增加25%，直到达到100%BAB。
      2. 每天用新鲜的BAB溶液替换，直到胎儿完全透明。此过程可能需要 3 到 5 天。在整个过程中，将含有胎儿的块放在摇摇杯上。胎儿可以长时间留在100%BABB溶液中。
         注意:如果胎儿没有正确脱水，在首次添加BABB后，它将变得略微半透明（"白色"乳液）。如果发生这种情况，请回到纯甲醇中，并在新鲜甲醇中进行两次额外的洗涤。切勿在进行脱水和清除时冷藏样品，因为温度的变化可能导致水凝结。
      3. 将清除的琼脂糖块连接到OPT扫描仪的电机轴上，调整光学元件以获得整个胎儿的图像，并继续获取完整的投影数据集^19，28。

2. 显微镜/图像采集

1. 为了获得正确的3D和4D成像，请选择最适合实验目标的显微镜。 表 2 提供了指导整个选择的一般信息。

光学显微镜技术	成像原理	实验目标和注意事项
宽视场成像	使用荧光、反射光或透射光。	非常适合对胚胎进行快速和一般的概述（例如，用于筛查和评估发育阶段和明显的表型）。与高放大倍率下的可观察厚度相比，景深减小，无法准确解释或分析3D形态。
共聚焦（激光扫描;CLSM）	使用激光扫描照明和通过针孔检测荧光。	允许对荧光标记样品的光学切片进行成像，理想情况下具有强信号。通过针孔成像可将信号从景深之外移除，从而在3D中准确区分信息。该采集速度比宽视场慢几个数量级，但具有无与伦比的对比度和3D形态辨别。无法实现高时间分辨率，因为图像一次采集 1 个像素。适用于E9.5以下固定小鼠胚胎的3D成像。通过整个前置中胚层或膈螨进行成像需要组织清除，因为较深的组织中存在光散射。光毒性和漂白是一个考虑因素。光漂白可以在限制范围内得到后补偿。然而，活体样品中的光毒性效应不能，而且往往不容易确定。如果样品表现出低表达，并且需要高激光功率，则这一点更为明显。
双光子激发荧光	它使用脉冲近红外（NIR）激光激发而不是可见激光照明。	TPEFM允许对比CLSM更厚的样品进行光学切片。分辨率略低，但更深层组织的对比度要好得多，使其成为小鼠胚胎活体成像的理想选择。虽然TPEFM通常被认为比传统的CLSM光毒性更低，但它需要高激光功率，也可能对细胞和组织产生有害影响。非常适合对E11.5以下的胚胎进行3D成像，尽管通过整个前置中胚层的成像仍然需要组织清除。
共聚焦（旋转盘）	一种共聚焦形式，它不使用单个激光器，而是使用多个点状光源。	与CLSM相比，使用多个点状结构可以更快地创建光学切片（每秒几帧或每分钟堆栈是可以实现的）。采集速度几乎与广角一样快，具有合理的3D辨别。然而，它只允许对小鼠胚胎最浅层的组织进行成像。允许比CLSM更灵敏的检测，使其成为荧光蛋白表达低的胚胎的替代品。
光片/单平面	样品不是宽场或点状照明，而是一次照亮一个正交平面。在大多数配置中，它允许从多个角度进行成像。	还需要荧光标记的样品。光学切片的采集速度非常快（每秒多帧），并且减少了光毒性或漂白的影响。但是，如果需要多视图，则后续数据集预处理步骤可能需要数小时/数天的计算。LSFM/SPIM 可以比 CLSM 更好地检测较低的表达水平。非常适合在原肠胚形成期间对toto小鼠胚胎进行3D成像。样品通常需要在悬浮液中安装和维护（非常规制备）。
光学投影断层扫描	光学切片不是被检测到的，而是从不同角度（"投影"）从整个胚胎的一系列宽视场图像中计算出来的。	非常适合后期小鼠胚胎/胎儿（>5mm）的3D成像，但只能固定和清除。具有生产荧光和非荧光样品的光学切片的3D堆栈的优点。数据集是等轴测的（在所有三个维度上具有相同分辨率的切片），使其成为解剖学分析的理想选择。获取投影数据集可能只需要几分钟，然后进行15-30分钟的重建。
光学相干断层扫描	通过样品使用NIR照明，获得基于光反射干扰的光学切片。	OCT允许通过活组织（几毫米深的样品没有荧光对比度）以几十微米的分辨率轻松成像。采集速度非常快（每秒几片）。虽然它是 OPT 的可能替代方法，但这种技术并不常见。
超分辨率 （SR）、原子力 （AFM） 或近场成像 （NSOM）	SR通常基于单分子定位和扫描表面上的AFM / NSOM，具有亚衍射分辨率（几纳米）。	允许在亚衍射水平（<200nm分辨率）下成像，通常旨在检测细胞表面的单分子或分子。不非常适合大样本（如小鼠胚胎）的形态学分析。采集过程通常很慢（每张图像只需数秒到数分钟）。

表2 - 指导选择更适合研究人员特定实验目标的成像技术/显微镜的通用信息。

3. 图像数据集预处理

注意:这里我们重点介绍图像数据集预处理的一些关键步骤，即降噪（3.1）和反卷积（3.2），并提供允许正确准备和预处理3D数据集时间序列（3.3）和全贴装免疫荧光染色（3.4）的算法。最后，我们指出了详细描述OPT数据集预处理和重建协议的参考文献。

1. 噪
   1. 如果图像显示信噪比降低，请考虑应用经典方法，例如斐济/ImageJ²⁹中提供的"中位数"滤波器或"各向异性扩散"，或者基于机器学习的更精细的方法，例如"CARE"³⁰ 或"Noise2Void"³¹。
      注意:这对于实时成像数据集尤其重要，其中光漂白和光损伤是一个主要问题，并且需要更低的曝光和更高的探测器增益。
2. 反 褶 积
   1. 如果图像是用高分辨率（接近奈奎斯特采样或以奈奎斯特采样）采集的，请考虑在分析之前使用反卷积执行图像恢复，以提高数据集的质量。请注意，某些反卷积工具还包括去噪步骤。
      注:Krull等人³² 和惠更斯反卷积软件网站（https://svi.nl/HomePage）提供的文档中已经广泛讨论了这个问题。
3. 准备 3D 数据集时间序列以进行适当的可视化和分析
   注意:通常胚胎或分期漂移可能发生在延时成像期间。在执行分析之前，需要对此进行更正。有时，漂移非常严重，需要中断采集并进行调整。在这种情况下，最好保持相同的 X、Y 和 Z 尺寸。
   1. 使用斐济的"连接"功能，可以将单独的4D堆栈连接到单个4D超堆栈中。但是，此工具不处理复合/超堆栈，因此有必要使用 操作 Image |将所有 4D 段转换为简单堆栈超级堆栈|要堆叠的超堆栈。保留一些编号系统以维护这些4D段的顺序，并记下有关每个段的信息（通道，切片，时间点）。对所有片段重复该过程，然后使用 过程"图像|堆栈|工具|连接。
   2. 使用操作"图像|重建串联的超 堆栈超级堆栈|堆叠到超堆栈 并选择不同维度的正确顺序。检查超级堆栈以确保所有维度都已正确排序。
      注意:所有 4D 线段的 通道数 （c） 和 切片 （z） 数应相同。（时间） 帧 （t） 的数量应等于为所有 4D 线段添加的时间点总数。在执行到超堆栈的转换之前，浏览堆栈以了解不同维度是如何插值的，这一点很重要。Fiji/ImageJ 的默认值是交替通道，然后交替 Z 切片，然后交替时间点 （"XYCZT"）。确认这适用于显微镜生成的数据。
   3. 选择"复合"作为"显示"模式，并另存为标记图像文件格式 （TIFF）。对于大型数据集，请考虑通过执行插件操作转换为 BigDataViewer³³ 格式 |大数据查看器 |将当前图像导出为 XML/HDF5。这生成了一个数据集，可以使用BigDataViewer更有效地以3D形式浏览，并且可以由其他斐济/ ImageJ工具处理大数据数据集。
   4. 注册串联的超堆栈（3D堆栈的时间序列）以使用"正确的3D漂移"ImageJ插件³⁴ 或BigStitcher插件³⁵补偿胚胎/阶段漂移，具体取决于所需的漂移校正程度。XML / HDF5文件可以用BigStitcher打开。
      注意:在任何尝试执行细胞跟踪或运动分析之前，有必要执行显示胚胎漂移的3D延时摄影的配准;校正漂移对于正确解释形态发生运动也是必要的。
4. 免疫荧光成像数据集的预处理
   1. Z 深度信号衰减
      注意:虽然我们提出的纠正信号衰减的方法可能很有用，但应谨慎使用，因为通常较少的深度信号实际上可能反映生物现象而不是光学现象。考虑测量目标分子预计不存在或表达的组织区域中的衰变，并调整该区域的补偿。如果深度中仍然有较低的正信号，它可能会揭示实际的生物现象。还要考虑到样品的某些区域可能会产生比其他区域更多的散射或激光衰减，并且使用这种简单的方法不会完全校正。
      1. 对于较厚/晚期的胚胎，由折射率不匹配（在安装介质和显微镜物镜之间）引起的光束衰减，光漂白和球面像差可能导致数据集中的荧光强度在Z-stack的较深切片中大大衰减。因此，在分析之前补偿这种信号损失。通过分析确定最准确的衰减是复杂且高度依赖于样品^{的 36}，但是在 ImageJ/Fiji 中，使用 过程|数学|宏 功能，然后单击 预览。
      2. 在斐济/图像J中加载 Z 堆栈，然后执行 过程图像|堆栈|重新切片。从以下位置开始: 顶部，保持 避免插值 勾选和 确定。现在，"Z"将是"Y"轴。接下来，执行 图像|查阅表格 （LUT） |火 （或任何其他多色LUT）。这将有助于在后续步骤中直观地评估最佳薪酬。切换到胚胎中间的切片，其中深度衰减的影响清晰可见（强度从顶部[浅表]下降到底部[更深]）。
      3. 继续使用过程过程确定垂直（"y"）强度下降的校正 过程|数学|宏，并完全按照此处编写添加以下"代码":
         v = v * A * exp （ B * y/h ）
         在此表达式中，"v"是像素强度的变量（将作为深度函数进行调整），"y"是深度变量，"h"是全深度变量，"exp"是指数函数;"A"应替换为 0.5 和 1.0 之间的数字（选择较低的值以避免 Z 堆栈顶层过饱和）;B替换为0.5和2.0之间的数字，具体取决于Z深度衰减的严重程度 - 理想情况下，它应该是1，但是在某些情况下，需要更少（或更多）来正确补偿底层;B值越高，衰减补偿越大。单击" 预览" 进行首次评估。测试A和B的不同值，直到从图像的顶部到底部获得足够的补偿（"火"LUT可能有助于此评估）。如果满意，请单击" 确定"来应用设置。
         注意:这必须在每个通道中单独执行，因为红移染料和激光可能衰减较少，并且某些染料漂白速度比其他染料快。请记住，此过程可能不够准确，无法可靠地量化深度的荧光强度变化，尽管它肯定比直接在原始3D数据集中执行定量更可靠，该数据集受到深度信号衰减的严重影响。识别和控制这种效应的一种方法是比较从背侧或腹侧对不同胚胎的成像。
      4. 通过执行图像|来恢复补偿 Z 堆栈的原始几何图形 堆栈|重新切片，从 顶部开始，保持 避免插值 勾选，现在"Y"必须再次成为"Z"平面;通过执行"图像|替换颜色查阅表格|灰色"（或选择的其他LUT）。丢弃原始的非补偿 z 堆栈并保存补偿版本。
         注:参见 补充图2 作为Z深度信号衰减方法的代表性结果。
   2. Z 轴缩放校正
      1. 如果使用折射率与用于安装胚胎的物镜不同的物镜进行成像，则需要对切片厚度进行重新缩放，否则深度测量将不正确（如果在组织清除的胚胎上使用"干"物镜，则可能增加50%）。这在 ³⁷ 和 ³⁸中进行了解释，回顾和讨论的不同方法。通过分析确定实际的Z轴失真尺度是复杂的，但是通过找到样品的折射率与物镜的折射率之间的比率，可以很容易地确定可接受的近似值（例如，对于用干的20倍物镜成像的水杨酸甲酯清除胚胎为1.53 / 1.0，对于用BABB清除并用水浸物镜成像的胚胎，则为1.56 / 1.33）。
      2. 在 Fiji/ImageJ 中已打开 Z-stack 数据集后（对于多通道图像，在将它们与所有通道组合为"复合"图像后），请转到 图像|属性 并将 体素深度 更改为图像采集期间获得的切片厚度乘以上一步（4.2.1;"图像数据集预处理"部分）。使用图像|确认结果 堆栈|正交视图。
   3. 使用斐济/ImageJ将胚胎重新定位到解剖学上标准的位置
      注意:重新定位胚胎（参见 补充图 3） 进入标准化的前后 [A-P] 和背腹侧 [D-V] 轴位置，使用 Fiji/ImageJ，需要安装 TransformJ ³⁹ 斐济"图像科学"更新网站的插件套件。
      注意:这种技术比在三个平面上进行回合旋转更可取，因为三个平面会引入混叠伪像和分辨率下降。但是，由于 Fiji/ImageJ 3D 查看器插件无法正确处理大于 200-300 Mb 的数据集（在尝试旋转视角时，插件可能不会渲染或显示不可预测的行为），因此必须首先对原始 3D 数据集进行下采样。
      1. 首先减小斐济图像|中的数据集大小 缩放 ，然后插入将数据集减少到小于 200 Mb 所需的 X、Y 和 Z"缩放"值（例如，0.5 x 0.5 x 0.5 的下采样将导致数据集小 8 倍）。确保已勾选 创建新窗口 选项。
      2. 然后转到 插件|3D查看器。在3D查看器窗口中，单击胚胎以将其选中，并且应该会出现一个红色的3D框。使用此模式（激活红色框）时，可以使用鼠标控制数据集的旋转，这与默认行为（旋转视角）相反。用鼠标重新定位胚胎时，切勿单击外部，否则将取消选择数据集。
      3. 当对胚胎的新位置感到满意时，选择" 编辑|转型|在 "3D查看器"窗口的菜单中导出转换后的图像。要检查不同的正交平面，请转到 图像|堆栈|正交视图。如果胚胎位置不正确，请关闭窗口并返回 3D查看器 窗口并重新调整。重复步骤 4.3.2。
      4. 当胚胎正确定位时，从"3D查看器"窗口菜单 中选择编辑|转型|保存转换 并将转换矩阵保存到扩展名为 *.mat 的文本文件中。使用斐济/图像J打开此文本文件，删除前两行（文本）并重新保存。这将创建一个与 ³⁹ 中描述的"TransformJ"插件兼容的转换矩阵文件。
      5. 切换到全分辨率数据集（可以是多通道复合超堆栈），并执行 插件操作|转换J |TransformJ affine.在新窗口中，浏览以搜索以前保存的矩阵文件，选择 三次 B 样条插值|各向同性重新取样|好的。
         注:此操作会占用大量内存和 CPU 资源。根据工作站和数据集大小，操作可能需要几分钟到几小时。使用 重采样各向同性选项可确保在变换操作期间不会丢失分辨率，因此数据集的大小将显着增加，并且不再像原始共聚焦z堆栈那样具有各向异性;可以预期，Z轴上的切片数量增加到每个切片的相同数量的X和Y像素，并且堆栈膨胀到原始大小的5-10倍。这是必要的，以确保在旋转和平移期间体素的插值过程中不会丢失任何信息。
      6. 一旦胚胎被正确重新定位，通常可以修剪胚胎周围产生的大部分空白空间。执行完整的 Z 投影 图像|堆栈|Z 项目... ，然后选择 最大强度;绘制 X 和 Y 中包含整个胚胎的最小 ROI。切换到原始数据集图像窗口，转到 编辑|选择|恢复所选内容，并通过选择" 图像"进行裁剪|裁剪。
      7. 修剪开头和结尾不与胚胎组织相交的切片。为此，请选择" 图像|堆栈|工具|切片删除器 ，并指定要删除的第一个和最后一个切片，确保将"增量"更改为 1（否则它仅删除每隔一个切片）。
      8. 重新定位和修剪新数据集后，请确保另存为新的 TIFF 文件。如果此数据集太大（大于 GPU RAM），请考虑使用 BigDataViewer 导出为 XML/DHF5，如步骤 3.3（来自"图像数据集预处理"部分）中所述。
5. OPT 数据集预处理和重建
   1. 使用协议进行OPT数据集预处理和重建，如Martins等人¹⁹ 和Gualda等人^.28所述。

4.3D渲染、可视化和分析

注意:在这里，我们提供了不同软件工具的可能应用列表，这些工具允许或增强3D成像数据集的可视化和分析。

1. 使用 Drishti 的 3D 渲染和可视化
   注意:Drishti⁴⁰ 是一款免费的科学可视化软件，旨在探索和呈现来自micro-CT，共聚焦/多光子和光片显微镜的3D和4D数据集。在这里，我们使用此软件进行3D渲染和可视化整个支架免疫荧光染色（步骤2;"3D成像的样品制备"部分）。网上有多个教程可以帮助用户了解如何操作Drishti;在线搜索"Ajay Limaye Drishti 3D教程"。Drishti不能直接读取TIFF文件的堆栈，因此必须首先将它们转换为本机"pvl.nc"格式。
   1. 运行"drishtiimport.exe"工具，该工具位于Drishti安装文件夹中: 文件|加载|文件|选择"灰度TIFF图像文件"，然后加载从斐济/ImageJ保存的单通道3D堆栈。对于多通道复合堆栈，在斐济/ImageJ 中拆分通道并单独保存每个通道。体素类型是"ushort";"文件"..."另存为"..."TIF"，对所有问题回复"y"。在要求体素大小的 附加信息 窗口中，请确保添加正确的"X Y Z"体素大小。
   2. 将 *.pvl.nc 文件加载到 Drishti 中并进行渲染:在 Drishti 的主窗口中， 文件|加载|加载 1 （ - 4 ） 个卷 ，具体取决于可用通道的数量（作为单独的文件）。加载后，按 F2 以获得高质量渲染。此操作需要功能强大的 GPU 卡。处理渲染参数的信息， 传递函数编辑器，搜索在线教程。对渲染属性感到满意后，继续生成动画渲染。
   3. 转到"查看"并激活关键帧编辑器。处理胚胎并将其定位在所需的起始位置。如有必要，使用鼠标右键将胚胎"拖动"到中心，或使用鼠标滚动进行缩放。在关键帧编辑器中点击设置关键帧，然后选择其他位置、角度或缩放，将时间线标记拖到其他时间点，然后再次设置关键帧。现在有2个关键帧，其中胚胎以2个不同的位置/角度/缩放表示，以及介于两者之间的许多帧。按下"播放"按钮，Drishti可以插入缺失的条件并将其作为动画播放。转到文件|保存图像序列以保存所有帧的动画序列。此帧序列稍后可以在斐济/ImageJ 中打开并保存为 AVI（文件|导入|图像序列 ...文件|另存为|JPEG 压缩，帧速率合理（我们建议为 15 - 30）。
      注意:虽然Drishti允许保存*.wmv视频，但建议将其另存为单独的帧，并且以后仅将系列转换为AVI或MOV视频格式（这可以使用斐济/ ImageJ完成）。
2. 使用 Amira 对组织进行 3D 重建和手动分割
   注意:该商业软件允许手动或自动/半自动在3D数据集中对胚胎组织进行3D分割。该软件有一个在线"学习中心"，其中包含 ^{多个教程41}。下面描述了从免疫荧光染色胚胎中手动分割胚胎组织所需的基本步骤（步骤1.2）。在胚胎正确定位在标准A-P / D-V轴上后，手动分割要容易得多（请参阅"图像数据集预处理"部分，步骤4.3）。
   1. 加载 3D TIFF 数据集。确保在系统询问时指定正确的体素尺寸。创建并连接可视化模块（例如，"Orthoslice"或"Volren"），并在3D中检查数据集。
   2. 连接 "标签"字段 （或在较新版本的 Amira 中 "编辑新标签字段 "）。在该软件中，手动分割的结果存储在"材料"中，因此为每个感兴趣的组织创建一个材料。使用"套索"工具进行手动分割。有几个教程可以解释如何执行此操作（在线搜索"Amira细分编辑器教程"）。
   3. 完成对所有感兴趣组织的分割后，通过切换回项目模式退出分割编辑器。创建了新版本的数据集（"标签字段"，现在附加到原始数据集模块），其中属于每种材料的像素具有相同的值。
   4. 通过从"标签"数据集生成 3D 表面模型，将这些"材料"转换为 3D 对象。这可以通过附加"生成曲面"模块来完成，并根据需要调整参数（激活"压缩"，"边框"，"调整坐标"和"无约束平滑"选项）。单击" 应用 "，将生成一个新模块 *.surf。
   5. 可视化表面对象，提取并单独导出为 *obj 文件。附加 显示|SurfaceView 模块到 *.surf 模块，并在主查看器中进行检查。在"SurfaceView"模块的"属性"面板中，在"材质"属性中选择" 全部 + 全部 "，然后单击" 删除"，这样查看器的缓冲区将被清空。然后在 材料 属性的第二次下拉中，仅选择一种材料并单击添加到缓冲区;只有该材料应该是可见的。
   6. 在" 绘制样式 "属性中，单击 更多选项|创建曲面 ，就会创建一个新的 *.surf 模块并将其添加到项目中。将其重命名为组织的名称（按键盘上的 F2），然后 "文件"|将数据导出为... 和 另存为类型: 波前 （*.obj）。对每种材料重复该操作。
      注意:这些*.obj文件，每个文件都包含Amira中分割的一个组织，可以被其他工具（斐济/ImageJ和SimLab的"3Dviewer"插件）使用。
3. 使用 SimLab Composer 以可移植文档格式 （PDF） 进行交互式 3D 可视化
   注意:此 3D 计算机图形软件有助于创建表面渲染图像、动画和模拟。有用的教程可以在第 ⁴²行找到。在这里，我们描述了该软件如何使用Amira创建的波前（* .obj）3D表面文件创建3D PDF交互式插图（步骤2.3;"3D 渲染、可视化和分析"部分）。
   1. 转到文件|新建并创建一个空场景。然后文件|导入并导入从Amira保存的第1个*.obj文件。保持"导入文件"窗口的所有选项保持未选中状态，然后单击"确定"。
   2. 如果 Composer 的显示窗口中未显示任何内容，请单击 Ctrl+F 或图标以 使其全部适应。现在，分割的对象应该出现在窗口的中心。重复该过程以添加另一个分段对象，并确认其相对于第一个对象的位置（例如，2 个相邻的 somites）。
   3. 通过单击鼠标左键在显示窗口中选择其中一个对象，更改其名称以反映解剖结构或组织的名称，然后切换到"3DGeom~1"表示，并使用" 材料 "面板，通过更改R，G，B值来更改颜色。
   4. 对所有对象重复上述步骤，直到 3D 图完全组装完毕。请注意，某些材质也可以通过操作RGB值旁边的"Alpha"通道来使透明，从而允许观察内部或遮挡的物体。
   5. 使用该软件，组装的胚胎插图可以导出为"3D PDF"文件，该文件可以包含在出版物中。首先创建一个包含文本和活动链接的"模板"，以更改"场景状态"，以便能够在同一插图中包含说明和三个不同的阶段。这可以通过从"场景构建"切换到"共享"模式（Composer 窗口左侧的按钮），然后单击" 显示 PDF 设置"并创建新的页面模板来完成。要创建要包含在手稿中的简单交互式图形，请不要使用模板，而只需 导出PDF。
      注意:使用 Adobe Acrobat Reader 软件与 3D PDF 进行交互（交互式 3D PDF 插图中功能的可操作性可能因可用的 Acrobat Reader 版本而异）。大多数其他查看器与 3D PDF 格式（包括 Web 浏览器）不兼容。这种3D PDF交互式插图可以包含在出版物中;提前向编辑询问这种可能性。
4. 使用伊玛瑞斯进行 3D 可视化和分析
   注:该软件通过直观的界面和工作流程，可以对2D-4D显微镜数据集进行全面的成像可视化、分析和解释。网上有几个关于如何开始使用该软件的有用教程，可在网站上找到（https://imaris.oxinst.com/tutorials）。为了更有效地加载Imaris中的大型数据集并与之交互（通常是大于GPU内存的数据集），建议先使用Imaris安装文件夹中安装的"ImarisFileConverter.exe"程序将数据集转换为"*.ims"。ImarisFileConverter可以读取许多显微镜图像格式，包括斐济BigDataViewer保存的OME和"h5"文件。
   1. 3D 可视化
      1. 该软件可以使用"3D视图"模式渲染数据集的3D可视化，并且用户能够对数据集的显示方式进行多项调整[例如，在MIP（最大强度投影）或混合模式（使用深度提示和阴影更好地渲染）之间进行选择]。
      2. 正交视图"模式 - 具有正确的胚胎定位（步骤4.3;"图像数据集预处理"部分）可以使用"部分"选项卡并浏览整个胚胎，并从正常平面（横向，日冕和矢状面）看到光学部分。如果胚胎没有正确重新定位，用正交平面解释它们的解剖结构是非常困难的（参见 补充图3）。尽管Imaris有一个称为"参考系"的功能，可以在分析3D胚胎时解决此问题，但最好先验地重新定位数据集。
   2. 3D 分析
      注意:该软件还具有多种用于分析形态和荧光强度的工具。例如，在这里，我们描述了一个简单的工作流程，使用Imaris"斑点"工具分析组织荧光强度随时间的变化，其中用户手动将感兴趣的球形区域（ROI）放置在3D胚胎中，然后Imaris可以测量这些球形ROI内部的组织荧光。
      1. 在 Imaris 中加载 3D 或 4D 数据集，并在 3D 视图模式下添加新点。然后，可以选择胚胎的特定点（如果使用4D数据集，也可以在几个时间点内）并量化这些点内部，例如强度平均值。
         注意:该软件还允许绘制强度随时间的变化。这允许用户轻松回答以下问题:"荧光如何随时间变化？
      2. 通过单击"添加新点"按钮或选择 3D 视图|来添加点模块伊马里斯菜单中的景点。选择跳过自动反应，手动编辑。将 Imaris 指针模式从"导航"切换到"选择"（也可以通过按键盘上的 ESC 键来完成）。
      3. 在 "点" 属性窗口中，选择点将连接到 的特定通道 （例如，"通道 1"），然后在" 手动跟踪" 中激活" 自动连接到所选点 "和 "启用自动前进前延迟 "选项。
      4. 将鼠标光标移动到可视化窗口，光标应变为空心黄色导线球体。转到时间点 1，然后单击感兴趣的组织来添加点（=球体）。只有在按住 Shift 键的同时单击时，才会添加球体（"Spot"）。对所有所需的时间点重复上述步骤，确保随时间推移跟踪组织的同一部分。
      5. 在 "点属性" 窗口中，切换到" 统计信息 "选项卡，然后在" 统计信息 "中从 "总体 "切换到 "详细 "统计信息。从第一个下拉列表中选择 "特定值"，从第二个下拉列表中选择"强度平均值 Ch=*..."，其中 Ch* 是将在其中执行测量的通道。"单击以打开时间图面板"右侧的按钮位于点属性窗口的左下角。单击此按钮将打开一个图，其中"斑点"内的荧光强度中位数随时间绘制。这些值也可以导出到电子表格中以供进一步分析。

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结果

本文显示的活体和免疫荧光成像的代表性结果均采用双光子系统获得，其中20×1.0 NA水物镜，激发激光调谐至960nm，GaAsP光电探测器（如Dias等人（2020）⁴³中所述。光学投影断层扫描是使用定制的OPenT扫描仪完成的（如Gualda等人（2013）²⁸中所述）。

实时成像（4D 分析）
对小鼠胚胎中轴向延伸期间LuVeLu报告活性的代表性分析，根据...

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讨论

轴向伸长和分割是脊椎动物胚胎发育过程中发生的两个最复杂和最动态的过程。一段时间以来，使用3D和4D成像与单细胞跟踪已经应用于研究斑马鱼和鸡胚胎的这些过程，其可及性和培养条件有助于复杂的成像^{19，44，45，46，47，48，}

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher   Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence