研究脊椎动物轴向伸长和分割的三维和四维可视化分析方法

摘要

在这里，我们描述了计算工具和方法，这些工具和方法允许在轴向伸长和分割的背景下可视化和分析小鼠胚胎的三维和四维图像数据，通过toto光学投影断层扫描以及通过使用多光子显微镜进行实时成像和全贴装免疫荧光染色获得。

摘要

体细胞发生是脊椎动物胚胎发育的标志。多年来，研究人员一直在使用包括离体和体外方法在内的各种技术在各种生物体中研究这一过程。然而，大多数研究仍然依赖于对二维（2D）成像数据的分析，这限制了对发育过程的正确评估，例如轴向延伸和涉及复杂3D空间中高度动态相互作用的发生。在这里，我们描述了允许小鼠实时成像采集，数据集处理，可视化和分析3D和4D的技术，以研究参与这些发育过程的细胞（例如，神经中胚层祖细胞）。我们还为小鼠胚胎中的光学投影断层扫描和全挂载免疫荧光显微镜（从样品制备到图像采集）提供分步方案，并展示了我们开发的用于处理和可视化3D图像数据的管道。我们扩展了其中一些技术的使用，并突出了不同可用软件（例如，Fiji/ImageJ，Drishti，Amira和Imaris）的特定功能，这些功能可用于提高我们当前对轴向延伸和somite形成（例如，3D重建）的理解。总而言之，这里描述的技术强调了3D数据可视化和分析在发育生物学中的重要性，并可能有助于其他研究人员在脊椎动物轴向延伸和分割的背景下更好地处理3D和4D图像数据。最后，这项工作还采用了新的工具来促进脊椎动物胚胎发育的教学。

引言

脊椎动物身体轴的形成是胚胎发育过程中发生的高度复杂和动态的过程。在原肠胚形成结束时[在小鼠中，在胚胎日（E）8.0左右]，一组称为神经中层祖细胞（NMPs）的上胚层祖细胞成为头到尾序列中轴向延伸的关键驱动因素，在颈部，躯干和尾巴形成过程中产生神经管和旁轴中皮组织^{1，2，3，4}.有趣的是，这些NMP在尾部外胚层中占据的位置似乎在分化成中胚层或神经外胚层⁵的决定中起着关键作用。虽然我们目前缺乏NMP的精确分子指纹，但这些细胞通常被认为共表达T（Brachyury）和Sox2^5，6。调节NMP命运决策的确切机制（即，它们是否采用神经或中皮途径）才刚刚开始被精确定义。 Tbx6 在原始条纹区域的表达是NMP命运决定的早期标志物，因为该基因参与中胚层^6，7的诱导和规范。有趣的是，早期的中胚层细胞似乎表达高水平的Epha1⁸，Wnt / β-ca....

研究方案

涉及动物的实验遵循葡萄牙（Portaria 1005/92）和欧洲（指令2010/63 / EU）关于住房，畜牧业和福利的立法。该项目由“塞内加尔古尔本基安研究所”伦理委员会和葡萄牙国家实体“食品和兽医协会”（许可证编号：014308）审查和批准。

1. 3D和4D成像的样品制备

注意：在这里，我们提供了有关如何解剖和制备小鼠E8.25至E10.5胚胎以进行活体成像（1.1），E7.5至E11.5胚胎用于整个安装免疫荧光显微镜（1.2）和胎儿以进行光学投影断层扫描（1.3）的详细说明。

1. 用于实时成像的样品制备
   1. 小鼠胚胎解剖和准备活体成像（例如，LuVeLu报告 ^基因23）。
      1. 在预热的M2培养基（37°C）中解剖E8.25和E10.5之间的小鼠胚胎。使用干净的镊子轻轻取出卵黄囊，并用新鲜的M2培养基洗涤胚胎一次，以除去解剖过程中产生的血液和碎屑。
         注意：重要的是要避免以任何方式损坏胚胎，否则在活体成像过程中将无法正常发育。
      2. 在现场成像过程中，在加热室（37°C），65%O₂ 和5%CO₂ 环境（N₂ 平衡）中，在低葡萄糖DMEM培养基中补充了10%HyClone定义的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素，将胚胎孵....

结果

本文显示的活体和免疫荧光成像的代表性结果均采用双光子系统获得，其中20×1.0 NA水物镜，激发激光调谐至960nm，GaAsP光电探测器（如Dias等人（2020）⁴³中所述。光学投影断层扫描是使用定制的OPenT扫描仪完成的（如Gualda等人（2013）²⁸中所述）。

实时成像（4D 分析）
对小鼠胚胎中轴向延伸期间LuVeLu报告活性的代表性分析，根据.......

讨论

轴向伸长和分割是脊椎动物胚胎发育过程中发生的两个最复杂和最动态的过程。一段时间以来，使用3D和4D成像与单细胞跟踪已经应用于研究斑马鱼和鸡胚胎的这些过程，其可及性和培养条件有助于复杂的成像^{19，44，45，46，47，48，}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher   Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence