JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Resumo

A somitogênese é uma marca registrada do desenvolvimento embrionário vertebrado. Há anos, pesquisadores vêm estudando esse processo em uma variedade de organismos usando uma ampla gama de técnicas que englobam abordagens ex vivo e in vitro. No entanto, a maioria dos estudos ainda se baseia na análise de dados bidimensionais (2D) de imagem, que limita a avaliação adequada de um processo de desenvolvimento como extensão axial e somitogênese envolvendo interações altamente dinâmicas em um complexo espaço 3D. Aqui descrevemos técnicas que permitem a aquisição de imagens ao vivo do mouse, processamento de conjunto de dados, visualização e análise em 3D e 4D para estudar as células (por exemplo, progenitoras neuromesodérmicas) envolvidas nesses processos de desenvolvimento. Também fornecemos um protocolo passo-a-passo para tomografia de projeção óptica e microscopia de imunofluorescência de montagem total em embriões de camundongos (da preparação da amostra à aquisição de imagens) e mostramos um pipeline que desenvolvemos para processar e visualizar dados de imagem 3D. Estendemos o uso de algumas dessas técnicas e destacamos características específicas de diferentes softwares disponíveis (por exemplo, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que podem ser usados para melhorar nossa compreensão atual da extensão axial e da formação de somite (por exemplo, reconstruções 3D). Ao todo, as técnicas aqui descritas enfatizam a importância da visualização e análise de dados 3D na biologia do desenvolvimento, e podem ajudar outros pesquisadores a abordar melhor os dados de imagem 3D e 4D no contexto de extensão e segmentação axial vertebrados. Por fim, o trabalho também emprega novas ferramentas para facilitar o ensino do desenvolvimento embrionário dos vertebrados.

Introdução

A formação do eixo do corpo vertebrado é um processo altamente complexo e dinâmico que ocorre durante o desenvolvimento embrionário. No final da gastruição [no camundongo, em torno do dia embrionário (E) 8.0], um grupo de células progenitoras epiblastos conhecidas como progenitores neuromesodérmicos (NMPs) tornam-se um driver chave de extensão axial em uma sequência cabeça a cauda, gerando o tubo neural e tecidos mesodérmicos paraxial durante a formação do pescoço, tronco e cauda 1,2,3,4 . Curiosamente, a posição que esses NMPs ocupam no epiblasto caudal parece desempenhar um papel fundamental na decisão de diferenciar-se em mesoderme ou neuroectoderme5. Embora atualmente não tenhamos uma impressão digital molecular precisa para NMPs, essas células são geralmente pensadas para co-expressar T (Brachyury) e Sox2 5,6. Os mecanismos exatos que regulam as decisões de destino do NMP (ou seja, se tomam rotas neurais ou mesodérmicas) estão apenas começando a ser precisamente definidos. A expressão tbx6 na região primitiva é um marcador inicial da decisão de destino NMP, pois este gene está envolvido na indução e especificação do mesoderme 6,7. Curiosamente, as primeiras células de mesoderme parecem expressar altos níveis de Epha18, e sinalização Wnt/β-catenin, bem como Msgn1 também foram mostrados para desempenhar papéis importantes na diferenciação paraxial de mesoderme e formação de somite 9,10. Uma análise espacial-temporal completa dos NMPs a um nível unicelular certamente será fundamental para entender completamente os mecanismos moleculares que controlam a especificação do mesoderme.

A formação de somites (precursores de vértebras) é uma característica fundamental dos vertebrados. Durante o alongamento axial, o mesoderme paraxial torna-se segmentado em uma série de unidades bilaterais repetitivas conhecidas como somites. O número de somites e o tempo necessário para a formação de novos segmentos variam entre as espécies11,12. A somitogênese envolve oscilações periódicas de sinalização (conhecidas como "relógio de segmentação") que podem ser observadas pela expressão cíclica de vários genes das vias de sinalização Notch, Wnt e Fgf no mesoderme presomático (por exemplo, Lfng)11,12. O modelo atual de somitogênese também postula a existência de uma "frente de onda de maturação", uma série de gradientes de sinalização complexos envolvendo fgf, Wnt e sinal de ácido retinóico que definem a posição da borda posterior de cada novo somite. Uma interação coordenada entre o "relógio de segmentação" e a "frente de onda de maturação" é, portanto, fundamental para a geração desses módulos precursores de vértebras, pois perturbações nesses principais processos morfogenéticos podem resultar em letalidade embrionária ou na formação de malformações congênitas (por exemplo, escoliose)13,14,15.

Apesar dos avanços recentes substanciais em técnicas de imagem, métodos de análise de bioimagem e software, a maioria dos estudos de alongamento axial e somitogênese ainda dependem de dados de imagem bidimensionais únicos/isolados (por exemplo, seções), o que não permite uma visualização completa do tecido multidimensional e complica a clara diferenciação entre malformações patológicas (ou seja, devido a mutações) versus variação morfológica normal ocorrendo durante o desenvolvimento embrionário16 . A imagem em 3D já descobriu novos movimentos morfogenéticos, anteriormente não identificados pelos métodos 2D padrão 17,18,19,20, destacando o poder do into imaging para entender os mecanismos da somitogênese vertebrado e extensão axial.

A microscopia 3D e 4D de embriões de camundongos, particularmente imagens vivas, são tecnicamente desafiadoras e requerem passos críticos durante a preparação da amostra, aquisição de imagens e pré-processamento de dados, a fim de permitir uma análise espátula-temporal precisa e significativa. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para imagens ao vivo e coloração de imunofluorescência de montagem total de embriões de camundongos, que podem ser usados para estudar tanto NMPs quanto células mesodérmicas durante a extensão e segmentação axiais. Além disso, descrevemos também um protocolo para tomografia de projeção óptica (OPT) de embriões e fetos mais antigos, que permite a visualização 3D em toto e quantificação de anormalidades patológicas que podem resultar de problemas durante a somitogênese (por exemplo, fusão óssea e escoliose)13,21,22. Por fim, ilustramos o poder das reconstruções de imagens 3D no estudo e ensino da segmentação de vertebrados e alongamento axial.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Experimentos envolvendo animais seguiram as legislações portuguesa (Portaria 1005/92) e europeia (Diretiva 2010/63/UE) relativas à habitação, à pecuária e ao bem-estar. O projeto foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Gulbenkian de Ciência e pela Entidade Nacional Portuguesa, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (referência de licença: 014308).

1. Preparação da amostra para imagens 3D e 4D

NOTA: Aqui fornecemos uma descrição detalhada sobre como dissecar e preparar os embriões E8.25 a E10,5 para imagens vivas (1.1), E7.5 a E11,5 embriões para microscopia de imunofluorescência de montagem inteira (1,2) e fetos para tomografia de projeção óptica (1,3).

  1. Preparação da amostra para imagens ao vivo
    1. Dissecção de embrião do rato e preparação para imagens ao vivo (por exemplo, LuVeLu repórter 23).
      1. Disseque embriões de camundongos entre E8.25 e E10.5 em m2 médio pré-aquecido (37 °C). Remova suavemente o saco de gema usando fórceps limpos e lave o embrião uma vez com meio M2 fresco para remover sangue e detritos produzidos durante a dissecção.
        NOTA: É importante evitar danificar o embrião de qualquer forma, caso contrário ele não se desenvolverá adequadamente durante o procedimento de imagem ao vivo.
      2. Durante o procedimento de imagem ao vivo, incubar embriões em uma câmara aquecida (37 °C), em um ambiente de 65% O2 e 5% de CO2 (N2 equilibrado), em mMEM médio de baixa glicose suplementado com 10% de hipclone definido soro bovino fetal, 2 mM L-glutamina e 1% penicilina-estreptomicina.
        NOTA: Essas condições de cultura permitem que o desenvolvimento embrionário ocorra por volta das 10h. Outros protocolos 9,10, usando diferentes condições culturais, podem permitir períodos ainda mais longos.
  2. Preparação da amostra para microscopia de imunofluorescência
    1. Procedimento de dissecção e fixação de embriões de camundongos
      1. Dissecar embriões de camundongos de E7.5 a E11.5 em soro fisiológico tamponado de fosfato frio (4 °C) (PBS) ou meio M2. Após a remoção de todas as membranas extraembrionárias (por exemplo, a membrana ou saco de gema do Reichart) lave o embrião em PBS fresco para remover sangue e detritos produzidos durante o procedimento de dissecção.
      2. Fixar embriões a 4 °C, em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS, pelo tempo especificado na Tabela 1.
        ATENÇÃO - PFA deve ser manuseado dentro de um capô de fumaça
        Estágio de desenvolvimentoTempo de fixação recomendado (PFA 4%)
        E7.51h30
        E8,52h
        E9.53h
        E10,54h
        E11,54h
        Tabela 1 - Tempos de fixação para embriões em diferentes estágios de desenvolvimento
      3. Após a fixação, lave os embriões pelo menos duas vezes (5-10 min cada) em PBS para remover completamente o PFA. Neste ponto, os embriões podem ser levados diretamente para o protocolo de coloração da imunofluorescência (Passo 1.2.2) ou podem ser desidratados e armazenados para uso futuro (Passo 1.2.1.4).
      4. Se necessário, armazene embriões a -20 °C em 100% de metanol por longos períodos.
        1. Para melhorar a preservação do tecido, desidrateir o embrião gradualmente com aumentos de 10% na concentração de metanol (diluído na PBS), cada passo 10 min à temperatura ambiente (TR) em um agitador, até atingir 100% de metanol. Substitua o 100% de metanol uma vez usando uma alíquota fresca.
        2. Recupere embriões congelados por reidratação após uma série de metanol/PBS reverso, cada passo 10 min no RT em um shaker, e com lavagens finais em PBS (duas vezes, 5-10 min cada) antes de entrar no protocolo de imunossuagem.
          ATENÇÃO - O metanol deve ser manuseado dentro de um capô de fumaça.
    2. Coloração de imunofluorescência de montagem inteira
      NOTA: O seguinte protocolo de coloração de imunofluorescência foi adaptado do procedimento descrito em Osorno et al.24. Todas as lavagens devem ser realizadas em um shaker. Após a etapa de bloqueio, as incubações são realizadas a 4 °C para garantir a integridade/preservação de anticorpos.
      1. Lave embriões três vezes (30 min cada) em PBS contendo 0,1% Triton X-100 (0,1% PBST) e, em seguida, uma vez em 0,5% PBST por 1 hora (RT) para melhorar a permeabilização.
      2. Para reduzir a ligação não específica, lave em 1 M de gliccina em PBS (pH 7.5) por 30 min na RT.
      3. Lave três vezes em 0,1% PBST por 30 min para remover completamente a glicina.
      4. Incubar os embriões durante a noite a 4 °C em solução de bloqueio contendo: 3% de soro (das espécies animais em que os anticorpos secundários foram produzidos), 1% da albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% do Triton X-100, na PBS.
      5. Diluir anticorpos primários na solução de bloqueio (normalmente 1:200 para anticorpos T e Sox2) e incubar por dois a três dias a 4 °C.
      6. Antes de adicionar os anticorpos secundários, lave os embriões três vezes (30 min cada) em 0,1% PBST a 4 °C. Diluir anticorpos secundários na solução de bloqueio (1:1000) e incubar por 2 dias a 4 °C, protegidos da luz.
      7. Lave os embriões seis vezes (30 min cada) em 0,1% PBST a 4 °C.
      8. Para contra-retenção nuclear, incubar embriões em 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihidrochlorida (DAPI), diluído 1:500 em PBST, durante a noite em um shaker a 4 °C, protegido da luz.
      9. Por fim, lave os embriões três vezes (30 min cada) em 0,1% PBST a 4 °C.
    3. Limpeza tecidual e preparação de slides
      1. Limpeza tecidual usando saliciilato de metila ou uma mistura de álcool benzílico com benziloato (BABB)
        1. Antes de limpar usando saliciilato de metila ou BABB, desidrata completamente os embriões, trazendo-os para 100% de metanol, através de uma série de metanol/PBS que consiste em aumentos sucessivos de 10% na concentração de metanol (tempos de incubação de 10 minutos cada a 4 °C). Para obter uma desidratação completa, substitua o metanol 100% por um fresco e espere por mais 10 minutos.
        2. Realizar a limpeza de embriões incorporando em uma série de saliciilato de metila ou BABB em metanol com aumentos sucessivos de 20% na concentração, incubação de 20 minutos para cada etapa. Quando a solução de salicilato de metila ou BABB atingir 100% faça duas alterações adicionais para uma solução nova.
          ATENÇÃO: Tanto o salicilato de metila quanto o BABB devem ser manuseados dentro de um capô de fumaça.
          NOTA: Para uma limpeza adequada, é essencial que os embriões estejam totalmente desidratados. Também é essencial que o metanol seja totalmente misturado com salicilato de metila ou BABB na série de soluções de compensação.
        3. Depois que os embriões se tornam completamente transparentes, manuseie-os individualmente, usando preferencialmente um estereóscópio de fluorescência, para reduzir as chances de danos teciduais.
        4. Para a imagem, monte embriões em uma lâmina de vidro côncava de 75 mm x 25 mm ou um copo de tampa de 20 mm x 60 mm #1,5. Esta última opção permitirá imagens de ambos os lados, se necessário, mas é muito mais frágil e difícil de selar. Transfira embriões para os slides do microscópio usando um palito de dente, uma ponta de algodão fino, uma pipeta Pasteur ou qualquer outro instrumento similar.
        5. Para evitar comprimir os embriões, adicione espaçadores feitos de fragmentos de vidro de cobertura #1 (170 μm de espessura), silicone ou arruelas metálicas finas. Em seguida, adicione uma gota de meio de montagem, cubra com um copo de tampa #1 ou #0 20x20 mm e selo.
        6. Se usar espaçadores de vidro ou metal, veda com parafina derretida para estabilizar melhor a preparação - não selado com esmalte porque se dissolve com salicilato de metila ou BABB. Para evitar bolhas, coloque a mancha de cobertura de um lado e, em seguida, deslize-a gradualmente e suavemente para os lados; adicionar mais meio, se necessário.
          NOTA: Por favor, veja o vídeo para entender melhor como manipular os embriões limpos e como montá-los no slide do microscópio.
      2. Limpeza de tecido com RapiClear
        1. Ao usar RapiClear, a desidratação do embrião não é necessária. Após a etapa 1.2.2.9, coloque embriões no centro de uma lâmina de vidro concave de depressão de 75 mm x 25 mm, remova todo o PBST no slide de depressão do microscópio e adicione 200 μL de solução de compensação.
        2. Depois de 10 minutos protegidos da luz, quando os embriões começarem a se tornar transparentes, substitua a solução de compensação, espere 20 minutos adicionais (protegidos da luz) e, em seguida, cubra com um deslizamento de tampa, começando de um lado e movendo-se suavemente em direção ao outro.
          NOTA: O tempo para limpar completamente o embrião pode passar de alguns minutos para a noite, dependendo do estágio e tamanho dos embriões. Além disso, todo o processo deve ser feito sob um estereóscópio. Para entender melhor a clareira e a preparação do slide do microscópio, consulte o protocolo de vídeo.
  3. Preparação da amostra para tomografia de projeção óptica
    NOTA: Os seguintes procedimentos foram adaptados de protocolos anteriores19,25,26. O protocolo será descrito para a análise de fetos de camundongos E18,5.
    1. Procedimento de dissecção e fixação do feto do rato
      1. Dissecar fetos de camundongos E18.5 em PBS frio (4 °C), remover todas as membranas extraembrionárias e, em seguida, lavar os fetos várias vezes em PBS fresco para remover sangue e detritos produzidos durante o procedimento de dissecção.
      2. Fixar fetos em 4% pfa feito em PBS, a 4 °C por 5 a 7 dias.
      3. Lave fetos uma vez (15 min) em PBS e, em seguida, três vezes (30 min cada) em água desmineralizada ou PBS. Faça as lavagens em um shaker.
      4. Desidratar os fetos por incubação (série de 25 min na RT em um shaker) em soluções de metanol de concentrações crescentes (10% aumenta diluído em água desmineralizada ou PBS) até 100% metanol.
      5. Altere a solução de 100% metanol (use uma alíquota fresca) três vezes (20 min cada) para garantir a desidratação completa. Embriões podem então ser armazenados a -20 °C ou serem levados diretamente (um dia depois) ao processo de branqueamento (Etapa 1.3.2).
    2. Processo de branqueamento
      1. Para remover a pigmentação natural, incubar fetos (separadamente) em um agitador, primeiro por um dia em 5% H202 em metanol e depois em 10% H202 em metanol por até 3 dias até que os embriões percam toda a pigmentação natural.
        ATENÇÃO: H2O2 deve ser manuseado suavemente dentro de um capô de fumaça. A solução de branqueamento contendo H2O2 quando em contato com a amostra cria vapores e, portanto, o tubo contendo os fetos deve permanecer aberto durante todo o procedimento de branqueamento. Alguns protocolos de branqueamento sugerem a combinação de H2O2 com formamide. Se essa alternativa for usada, deve-se tomar cuidado extra, pois adicionar H2O2 a formamida não diluída pode resultar em uma explosão.
      2. Rehidratar gradualmente os embriões em uma série de metanol reverso (com 10% de diminuição) na água desmineralizada, cada um incubado por 20 minutos em RT em um shaker, e finalmente lavar três vezes (30 min cada) em água desmineralizada. Espere um dia, mude a água desmineralizada e prossiga ainda mais.
        NOTA: Consulte a Figura Suplementar 1 para obter um resultado representativo do processo de branqueamento.
    3. Protocolo de desmineralização
      NOTA: A desmineralização é opcional, mas recomendada para fetos ou filhotes.
      1. Realize a desmineralização lavando os fetos em 0,1 M EDTA a 42 °C por algumas horas [ver também Cho et al.27] seguido por cinco lavagens (20 min cada) com água desmineralizada para remover completamente o EDTA. Realize todos os procedimentos em um shaker.
    4. Preparação da amostra para compensação
      1. Incorpore fetos em um bloco de 1% de agarose. Para preparar esses blocos encha um tubo de plástico de 50 mL ou seringa (construindo um espaço cilíndrico cortando o lado de saída da seringa e usando o êmbolo para bloquear o lado oposto) com agarose derretida, coloque o feto na ágarose em posição vertical e mantenha esta posição no centro do bloco com o auxílio de fórceps durante a solidificação da ágarose.
      2. Coloque o molde com o bloco a 4 °C (30 min) para que a agarose para gelatina completa. Em caso de posicionamento incorreto do feto dentro do bloco ou o aparecimento de bolhas de ar, derreta a agarose colocando o bloco a 50 °C durante a noite e repita o procedimento no dia seguinte.
      3. Remova o bloco de agarose com o feto do molde e coloque-o em um recipiente com água desmineralizada. Substitua por água desmineralizada fresca após 15 minutos.
      4. Antes de limpar com BABB, desidrate o espécime. Para melhor preservar a integridade do tecido, realize a desidratação do feto gradualmente com aumentos de 10% na concentração de metanol (diluído em água desmineralizada ou PBS), cada passo por mais de 45 min na RT em um shaker, até chegar a 100% de metanol.
      5. Troque o 100% de metanol (use uma alíquota fresca), primeiro quatro vezes em intervalos de uma hora e depois novamente no dia seguinte para garantir a desidratação completa.
    5. Processo de compensação e montagem de amostras para imagem OPT
      1. Limpe os fetos em um shaker através de uma série (2,5 horas cada) da solução BABB em metanol, com aumentos de 25% na concentração de BABB, até atingir 100% de BABB.
      2. Substitua a solução BABB por uma nova todos os dias, até que o feto esteja completamente transparente. Esse processo pode levar de 3 a 5 dias. Mantenha o bloco contendo o feto, em um shaker durante todo o procedimento. Os fetos podem ficar na solução 100% BABB por longos períodos.
        NOTA: Se o feto não estiver corretamente desidratado, ele se tornará ligeiramente translúcido (emulsão "esbranquiçado") após a primeira adição de BABB. Se isso acontecer, volte ao metanol puro e faça duas lavagens adicionais em metanol fresco. Nunca refrigerar amostras durante a desidratação e limpeza, pois as mudanças de temperatura podem levar à condensação da água.
      3. Conecte o bloco de agarose desmatada ao eixo motor do scanner OPT, ajuste a óptica para obter uma imagem de todo o feto e prossiga para a aquisição de um conjunto de dados de projeção completo19,28.

2. Aquisição de microscópio/imagem

  1. Para a correta imagem 3D e 4D, escolha o microscópio que melhor se encaixa no objetivo experimental. A Tabela 2 fornece informações gerais para orientar através da seleção.
Técnicas de microscopia ópticaPrincípio da imagemObjetivo experimental e considerações
Imagens widefieldUsa fluorescência, luz refletida ou transmitida.Ideal para uma visão geral e rápida do embrião (por exemplo, para triagens e para avaliar estágios de desenvolvimento e fenótipos óbvios). A profundidade de campo reduzida, comparada com a espessura observável em altas ampliações, não permite interpretação ou análise precisas da morfologia 3D.
Confocal (escaneamento a laser; CLSM)Usa iluminação de varredura a laser e detecção de fluorescência através de um orifício.Permite a imagem de fatias ópticas de amostras fluorescentes rotuladas, idealmente com um sinal forte. A imagem através de um orifício remove o sinal de fora do campo de profundidade, permitindo assim a discriminação precisa das informações em 3D. A aquisição é ordens de magnitude mais lentas do que o widefield, mas com contraste incomparável e discriminação 3D da morfologia. A alta resolução temporal não é alcançável porque as imagens são adquiridas a 1 pixel de cada vez. Bom para imagens 3D de embriões de camundongos fixos até E9.5. A imagem através de todo o mesoderme presomético ou somites requer limpeza tecidual, por causa da dispersão de luz em tecidos mais profundos. Fototoxicidade e branqueamento é uma consideração. Fotobleaching pode, dentro dos limites, ser compensado a posteriori. No entanto, efeitos fototóxicos em amostras vivas não podem, e muitas vezes não são fáceis de determinar. Isso é mais óbvio se as amostras mostrarem baixa expressão, e poderes de laser elevados são necessários.
Fluorescência de excitação de dois fótons (TPEFM)Ele usa excitação a laser quase infravermelha pulsada (NIR) em vez de iluminação laser visível.O TPEFM permite o corte óptico através de amostras mais grossas do que o CLSM. A resolução é ligeiramente menor, mas o contraste em tecidos mais profundos é consideravelmente melhor, tornando-o ideal para imagens vivas de embriões de camundongos. Embora o TPEFM seja frequentemente considerado menos fototóxico do que o CLSM convencional, ele requer altos poderes laser que também podem ter efeitos deletérios sobre células e tecidos. Ideal para imagens 3D de embriões até E11.5, embora a imagem através de todo o mesoderme presomótico ainda requer limpeza tecidual.
Confocal (disco giratório)Uma forma de confocal que, em vez de um único laser, usa múltiplas fontes semelhantes a pontos.O uso de múltiplas estruturas semelhantes a pontos permite a criação mais rápida de fatias ópticas (vários quadros por segundo ou pilhas por minuto são alcançáveis) do que o CLSM. A aquisição é praticamente tão rápida quanto o widefield, com discriminação 3D razoável. No entanto, ele só permite a imagem dos tecidos mais superficiais do embrião do camundongo. Permite uma detecção mais sensível do que o CLSM, tornando-o uma alternativa para embriões com baixa expressão de proteínas de fluorescência.
Folha de luz / plano único (LSFM/SPIM)Em vez de iluminação widefield ou point-like, a amostra é iluminada um plano ortogonal de cada vez. Na maioria das configurações, permite imagens de múltiplos ângulos.Também requer amostras fluorescentes. A aquisição de fatias ópticas é extremamente rápida (múltiplos quadros por segundo) e tem efeitos reduzidos de fototoxicidade ou branqueamento. No entanto, se o multivisor for necessário, as etapas subsequentes de pré-processamento do conjunto de dados podem exigir horas/dias de computação. O LSFM/SPIM permite uma melhor detecção de níveis de expressão mais baixos do que o CLSM. Ideal para imagens 3D de embriões de camundongos em toto durante a gastrulação. Muitas vezes, as amostras precisam ser montadas e mantidas em suspensão (preparação não convencional).
Tomografia de projeção óptica (OPT)As fatias ópticas não são detectadas, mas calculadas a partir de uma série de imagens widefield de todo o embrião de diferentes ângulos (as "projeções").Ideal para imagens 3D de embriões/fetos de camundongos de estágio posterior (>5mm), mas apenas fixo e limpo. Tem a vantagem de produzir pilhas 3D de fatias ópticas de amostras fluorescentes e não fluorescentes. Os conjuntos de dados são isométricos (fatias com resolução igual nas três dimensões) tornando-o ideal para análise anatômica. A aquisição de um conjunto de dados de projeção pode exigir apenas alguns minutos, seguido de 15-30 minutos de reconstrução.
Tomografia de Coerência Óptica (OCT)Usa a iluminação NIR através da amostra para obter fatias ópticas baseadas na interferência com o reflexo da luz.O OCT permite uma imagem fácil através do tecido vivo (alguns milímetros de profundidade na amostra sem contraste fluorescente) com algumas dezenas de micrometros de resolução. A aquisição é muito rápida (algumas fatias por segundo). Embora seja uma possível alternativa para o OPT, essa técnica não é comumente disponível.
Super-resolução (SR), força atômica (AFM) ou imagem de campo próximo (NSOM)A RS é normalmente baseada na localização de molécula única e no AFM/NSOM em superfícies de varredura em resoluções de subdifração (poucos nanômetros).Permite a imagem em nível de sub-difração (resolução de < 200nm), muitas vezes com a intenção de detectar moléculas ou moléculas únicas na superfície celular. Não é ideal para análise morfológica de grandes amostras, como embriões de camundongos. A aquisição é tipicamente um processo lento (segundos a minutos por imagem).

Tabela 2 - Informações genéricas para orientar a seleção da técnica de imagem/microscópio mais adequadas para o objetivo experimental específico do pesquisador.

3. Pré-processamento do conjunto de dados de imagem

NOTA: Aqui destacamos algumas das principais etapas do pré-processamento do conjunto de dados de imagem, ou seja, redução de ruído (3.1) e desconvolução (3.2), e fornecemos algoritmos que permitem a preparação adequada e o pré-processamento de conjuntos de dados 3D séries de tempo (3.3) e manchas de imunoorescência de montagem total (3.4). Finalmente, indicamos referências que descrevem detalhadamente um protocolo para pré-processamento e reconstrução do conjunto de dados OPT.

  1. Redução de ruído
    1. Se as imagens mostrarem redução da relação sinal-ruído, considere aplicar um método clássico como um filtro "mediano" ou "difusão anisotropica" disponível em Fiji/ImageJ29, ou um método mais elaborado baseado em Machine Learning como "CARE"30 ou "Noise2Void"31.
      NOTA: Isso é especialmente relevante para conjuntos de dados de imagem ao vivo, onde o fotobleaching e fotodamage é uma grande preocupação, e menores exposições e maiores ganhos de detector são necessários.
  2. Deconvolução
    1. Se as imagens foram adquiridas com alta resolução (perto ou em amostragem de Nyquist) considere realizar a restauração de imagens com desconvolução para melhorar a qualidade do conjunto de dados antes da análise. Cuidado que algumas ferramentas de desconvolução também incluem um passo denoizante.
      NOTA: Isso foi extensivamente abordado em Krull et al.32 e na documentação disponível no site do software de desconvolução da Huygens (https://svi.nl/HomePage).
  3. Preparando uma série de tempo de conjunto de dados 3D para visualização e análise adequadas
    NOTA: Muitas vezes o embrião ou a deriva do estágio podem ocorrer durante a imagem de lapso de tempo. Isso precisa ser corrigido antes de realizar a análise. Às vezes, a deriva é severa o suficiente para que a aquisição precise ser interrompida e ajustes feitos. Neste caso, é melhor manter as mesmas dimensões X, Y e Z.
    1. Pilhas 4D separadas podem ser concatenadas em um único hiperstack 4D usando a função "concatenação" de Fiji. No entanto, esta ferramenta não lida com compostos/hiperseilhas, por isso é necessário converter todos os segmentos 4D em pilhas simples usando a operação Imagem | Hyperstacks | Hyperstack para empilhar. Mantenha algum sistema de numeração para manter a ordem desses segmentos 4D e tome nota das informações sobre cada um (canais, fatias, pontos de tempo). Repita o procedimento para todos os segmentos e concatenar-os usando o procedimento Imagem | Pilhas | Ferramentas | Concatenato.
    2. Reconstrua o hiperseto concatenado com a operação Imagem | Hyperstacks | Empilhe para Hyperstack e escolha a ordem correta das diferentes dimensões. Inspecione o Hyperstack para certificar-se de que todas as dimensões estão sequenciadas corretamente.
      NOTA: O número de canais (c) e fatias (z) deve ser o mesmo para todos os segmentos 4D; o número de quadros (tempo) (t) deve ser igual ao total de pontos de tempo adicionados para todos os segmentos 4D. É importante navegar pela pilha para entender como as diferentes dimensões são interpoladas, antes de realizar a conversão para hyperstack. O padrão Fiji/ImageJ é alternar canais, depois alternar fatias Z e, em seguida, alternar pontos de tempo ("XYCZT"). Confirme se isso se aplica aos dados gerados pelo microscópio.
    3. Escolha o Composto como o modo Exibir e salve como TIFF (Tagged Image File Format, formato de arquivo de imagem marcado). Para grandes conjuntos de dados, considere converter para o formato BigDataViewer33 , realizando a operação Plugins | BigDataViewer | Exporte imagem atual como XML/HDF5. Isso gera um conjunto de dados que pode ser navegado de forma mais eficiente e em 3D usando o BigDataViewer e pode ser manipulado por outras ferramentas Fiji/ImageJ para conjuntos de dados de big data.
    4. Registre o hipersedor concatenado (série de tempo de pilhas 3D) para compensar a deriva embrião/estágio usando o plugin ImageJ "Correct 3D Drift"34 ou o plugin BigStitcher35, dependendo do grau de correção de deriva necessário. Os arquivos XML/HDF5 podem ser abertos com o BigStitcher.
      NOTA: É necessário realizar o registro de lapsos de tempo 3D que mostram deriva de embrião antes de qualquer tentativa de realizar rastreamento celular ou análise de movimento; a correção para a deriva também é necessária para interpretar adequadamente os movimentos morfogenéticos.
  4. Pré-processamento de conjuntos de dados de imagens de imunofluorescência
    1. Atenuação do sinal de profundidade Z
      NOTA: Embora o método que propomos corrigir a atenuação do sinal possa ser útil, este deve ser usado com cuidado, pois muitas vezes menos sinal em profundidade pode realmente refletir um fenômeno biológico e não óptico. Considere medir a decomposição em uma área de tecido onde a molécula de interesse não deverá estar presente ou expressa e ajustar a compensação por essa área. Se ainda houver um sinal positivo menor em profundidade, pode revelar um fenômeno biológico real. Considere também que algumas áreas da amostra podem produzir mais dispersão ou atenuação a laser do que outras, e que não será totalmente corrigida com este método simples.
      1. Para embriões mais grossos/em estágio final, atenuação do feixe, fotobleaching e aberração esférica causada por incompatibilidade de índices refrativos (entre o meio de montagem e o objetivo do microscópio) podem resultar em conjuntos de dados onde a intensidade da fluorescência é muito atenuada nas fatias mais profundas da pilha Z. Portanto, compense essa perda de sinal antes da análise. Determinar analiticamente a atenuação mais precisa é complexa e altamente dependente de amostras36, mas uma aproximação rápida pode ser determinada empiricamente no ImageJ/Fiji usando o Processo | | de matemática Função macro e clicando em Visualização.
      2. Carregue a pilha Z em Fiji/ImageJ e, em seguida, execute o procedimento Imagem | Pilhas | A Reslice. Comece em: topo, mantenha Evitar interpolação marcada e OK. Agora o "Z" será o eixo "Y". Em seguida, faça | de imagem Tabelas de procurar (LUT) | Fogo (ou qualquer outro LUT multicolorido). Isso ajudará a avaliar visualmente a melhor compensação durante os próximos passos. Mude para uma fatia no meio do embrião, onde os efeitos da atenuação em profundidade são claramente visíveis (a intensidade cai da parte superior [superficial] para a parte inferior [mais profunda]).
      3. Proceda à determinação da correção da queda de intensidade vertical ("y") com o procedimento Processo | | de matemática Macro, e adicione o seguinte "Código" exatamente como escrito aqui:
        v = v * A * exp ( B * y/h )
        Nesta expressão, "v" é a variável para intensidade de pixel (que será ajustada como função em profundidade), "y" a variável para profundidade e "h" para profundidade total, e "exp" é uma função exponencial; "A" deve ser substituído por um número entre 0,5 e 1.0 (escolha valores mais baixos para evitar a supersaturação das camadas superiores da pilha Z); B substituído por um número entre 0,5 e 2.0, dependendo da gravidade da atenuação da profundidade Z - o ideal é 1, porém em alguns casos menos (ou mais) é necessário compensar corretamente as camadas inferiores; um valor mais elevado de B resultará em uma compensação mais atenuada. Clique em Visualização para fazer uma primeira avaliação. Teste diferentes valores de A e B até obter compensação adequada de cima para baixo da imagem (o LUT "Fogo" pode ser útil para esta avaliação). Quando estiver satisfeito, aplique as configurações clicando em OK.
        NOTA: Isso deve ser realizado em cada canal individualmente, porque corantes e lasers com mudanças vermelhas podem atenuar menos, e alguns corantes alvejantes mais rápido do que outros. Tenha em mente que este procedimento pode não ser preciso o suficiente para permitir quantificação confiável de variações de intensidade de fluorescência em profundidade, embora seja certamente mais confiável do que realizar quantificações diretamente no conjunto de dados 3D original que é severamente afetado pela atenuação do sinal em profundidade. Uma maneira de identificar e controlar esse efeito, é comparar imagens de diferentes embriões dos lados dorsal ou ventral.
      4. Restaure a geometria original da pilha Z compensada fazendo | de imagem Pilhas | Reslice, comece no topo, mantenha evitar interpolação marcada, e agora o "Y" deve se tornar o plano "Z" novamente; substituir a cor executando "Imagem | Tabelas de | Cinzas" (ou o outro LUT de escolha). Descarte a pilha z original não compensada e salve a versão compensada.
        NOTA: Consulte a Figura Suplementar 2 como resultado representativo do método de atenuação do sinal de profundidade Z.
    2. Correção de dimensionamento do eixo Z
      1. Se a imagem com um objetivo projetado para um índice de refração diferente do usado para a montagem dos embriões, é necessário realizar o redimensionamento da espessura da fatia, caso contrário as medidas em profundidade serão incorretas (potencialmente em 50% se usar um objetivo "seco" em um embrião limpo de tecido). Isso é explicado, revisado e os diferentes métodos discutidos, em 37 e 38. Determinar analiticamente a escala real de distorção do eixo Z é complexo, mas uma aproximação aceitável pode ser facilmente determinada encontrando a razão entre o índice refrativo da amostra e o índice refrativo do objetivo (por exemplo, 1,53/1.0 para um embrião de salicilato de metila com um objetivo seco de 20 x, ou 1,56/1,33 para um embrião limpo com BABB e imageado com um objetivo de imersão de água).
      2. Com o conjunto de dados Z-stack já aberto em Fiji/ImageJ (para imagens multicanais, depois de terem sido montados como "compostos" com todos os canais), vá para Image | Propriedades e alterar a profundidade voxel para a espessura da fatia obtida durante a aquisição de imagem multiplicada pela correção de dimensionamento do eixo Z determinada na etapa anterior (4.2.1; Seção "Pré-processamento de conjunto de dados de imagem"). Confirme o resultado usando a imagem | Pilhas | Vistas ortogonais.
    3. Reposicionamento do embrião para uma posição anatomicamente padrão usando Fiji/ImageJ
      NOTA: Reposicionamento do embrião (veja as vantagens destacadas em Figura Suplementar 3) em uma posição padronizada anterior-posterior [A-P] e dorsal-ventral [D-V] de posição usando Fiji/ImageJ, requer a instalação do TransformJ 39 suíte de plugins do site de atualização "ImageScience" de Fiji.
      NOTA: Esta técnica é preferível a rodadas de rotações nos três planos que introduziriam artefatos de alias e degradação da resolução. No entanto, como o plugin do visualizador 3D Fiji/ImageJ não pode lidar adequadamente com conjuntos de dados maiores que 200-300 Mb (o plugin pode não renderizar ou mostrar comportamento imprevisível ao tentar girar o ângulo de visão), o conjunto de dados 3D original deve ser amostrado primeiro.
      1. Comece reduzindo o tamanho do conjunto de dados no | de imagem de Fiji Dimensione e, em seguida, insira os valores de "escala" X, Y e Z necessários para reduzir o conjunto de dados para menos de 200 Mb (por exemplo, uma amostragem de 0,5 x 0,5 x 0,5 resultará em um conjunto de dados 8 vezes menor). Certifique-se de que a opção Criar nova janela esteja marcada.
      2. Em seguida, vá para Plugins | visualizador 3D. Dentro da janela do visualizador 3D, clique sobre o embrião para selecioná-lo e uma caixa 3D vermelha deve aparecer. Ao usar este modo (com a caixa vermelha ativada), a rotação do conjunto de dados pode ser controlada com o mouse, em contraste com o comportamento padrão, que é girar o ângulo de visão. Ao reposicionar o embrião com o mouse, nunca clique fora ou o conjunto de dados será desmarcado.
      3. Quando estiver satisfeito com a nova posição do embrião, selecione Editar | | de transformação Exportar imagem transformada no menu da janela "visualizador 3D". Para inspecionar os diferentes planos ortogonais vá para Image | Pilhas | Vistas ortogonais. Se o embrião não estiver corretamente posicionado, feche a janela e volte para a janela do visualizador 3D e reajustar. Repita o passo 4.3.2.
      4. Quando o embrião estiver corretamente posicionado, selecione no menu de janela "visualizador 3D" Editar | | de transformação Salve transformar e salvar a matriz de transformação em um arquivo de texto com a extensão *.mat. Abra este arquivo de texto usando Fiji/ImageJ, remova as duas primeiras linhas (texto) e re-salve. Isso cria um arquivo de matriz de transformação compatível com o plugin "TransformJ" descrito em 39.
      5. Mude para o conjunto de dados de resolução completa (pode ser um hiperseto composto de vários canais) e execute os Plugins de operação | TransformJ | TransformJ affine. Na nova janela, procure procurar o arquivo de matriz previamente salvo, selecione a interpolação C-Spline cúbica | resample isotropicamente | Está bem, vamos lá.
        NOTA: Esta operação é de memória e uti da CPU. Dependendo da estação de trabalho e do tamanho do conjunto de dados, a operação pode levar de minutos a horas. O uso da opção isotropicamente resample garante que nenhuma resolução seja perdida durante a operação de transformação, de modo que o conjunto de dados aumentará significativamente em tamanho e não será mais anisotrópico como o confocal z-stack original; espera-se que o número de fatias no eixo Z aumente para o mesmo número de pixels X e Y de cada fatia, e a pilha inchada para 5-10x o tamanho original. Isso é necessário para garantir que nenhuma informação seja perdida no curso da interpolação de voxels durante a rotação e tradução.
      6. Uma vez que o embrião é devidamente reposicionado, muitas vezes é possível aparar a maior parte do espaço vazio criado ao redor do embrião. Realize uma imagem de projeção Z completa | Pilhas | Projeto Z... e escolher intensidade máxima; desenhar o ROI mínimo que contém todo o embrião em X e Y. Mudar para as janelas de imagem original do conjunto de dados, ir para Editar | | de seleção Restaurar a seleção e cortar selecionando a cultura de | de imagem.
      7. Corte as fatias no início e final que não cruzem tecidos de embrião. Para isso, selecione Imagem | Pilhas | Ferramentas | Corte o removedor e especifique a primeira e última fatia a ser removida, certificando-se de alterar o "incremento" para 1 (caso contrário, ele remove apenas todas as outras fatias).
      8. Depois de reposicionar e aparar o novo conjunto de dados certifique-se de salvar como um novo arquivo TIFF. Se este conjunto de dados for muito grande (mais do que a GPU RAM) considere usar o BigDataViewer para exportar como XML/DHF5, como explicado na etapa 3.3 (da seção "Pré-processamento do conjunto de dados de imagem").
  5. Pré-processamento e reconstrução do conjunto de dados OPT
    1. Use o protocolo para pré-processamento e reconstrução do conjunto de dados OPT descrito em Martins et al.19 e Gualda et al.28.

renderização, visualização e análise .3D 4

NOTA: Aqui fornecemos uma lista de possíveis aplicações de diferentes ferramentas de software, que permitem ou melhoram a visualização e análise de conjuntos de dados de imagem 3D.

  1. Renderização e visualização 3D usando Drishti
    NOTA: Drishti40 é um software gratuito de visualização científica projetado para explorar e apresentar conjuntos de dados 3D e 4D de micro-CT, confocal/multifocã e microscopia de folha de luz. Aqui usamos este software para renderização 3D e visualização de coloração de imunofluorescência de montagem total (Passo 2; Seção "Preparação da amostra para imagem 3D"). Existem vários tutoriais on-line para ajudar os usuários a entender como operar o Drishti; pesquise online para "Tutoriais 3D Ajay Limaye Drishti". Drishti não pode ler diretamente pilhas de arquivos TIFF, então eles devem ser convertidos primeiro para o formato nativo "pvl.nc".
    1. Execute a ferramenta "drishtiimport.exe", localizada na pasta de instalação Drishti: Arquivos | | de carga Arquivos | escolha "Arquivos de imagem Grayscale TIFF e carregue uma pilha 3D de um único canal, salvo de Fiji/ImageJ. No caso de uma pilha composta de vários canais, divida os canais em Fiji/ImageJ e salve cada um individualmente. O tipo Voxel é "ushort"; "Arquivo"..."Salve como"..."TIF", responda "y" a todas as perguntas. Na janela de informações adicionais pedindo o tamanho do voxel certifique-se de adicionar os tamanhos corretos de voxel "X Y Z".
    2. Carregando arquivos *.pvl.nc em Drishti e renderização: Na janela principal de Drishti, arquivo | | de carga Carregar 1 ( - 4 ) volumes dependendo do número de canais disponíveis (como arquivos separados). Após o carregamento, pressione F2 para renderizar de alta qualidade. Esta ação requer uma poderosa placa de GPU. Informações para lidar com os parâmetros de renderização, editor de funções de transferência, pesquisa nos tutoriais online. Uma vez satisfeitos com as propriedades de renderização passam a gerar uma renderização animada.
    3. Vá para Exibir e ative o editor do Keyframe. Manuseie o embrião e posicione-o na posição inicial desejada. Use o botão direito do mouse para "arrastar" o embrião para o centro, se necessário, ou o mouse rolar para ampliar. Aperte o keyframe definido no editor do Keyframe e escolha outra posição, ângulo ou zoom, arraste o marcador da linha de tempo para um ponto de tempo diferente e defina o quadro-chave novamente. Agora existem 2 quadros-chave onde o embrião é representado em 2 posições diferentes/ângulos/zoom, e uma série de quadros entre eles. Pressionando o botão Play , Drishti pode interpolar as condições faltantes e reproduzi-la como uma animação. Vá para o Arquivo | Salve a sequência de imagens para salvar a sequência animada de todos os quadros. Esta sequência de quadros pode ser posteriormente aberta em Fiji/ImageJ e salva como AVI (Arquivo | | de importação Sequência de imagem ... | de arquivos Salve como | Compressão JPEG com uma taxa de quadro razoável (sugerimos 15 - 30).
      NOTA: Embora Drishti permita a salvação de vídeos *.wmv, é aconselhável salvar como quadros separados e apenas depois converter a série para o formato de vídeo AVI ou MOV (isso pode ser feito usando Fiji/ImageJ).
  2. Reconstituição 3D e segmentação manual de tecidos usando Amira
    NOTA: Este software comercial permite, manual ou automaticamente/semi-automaticamente, segmentação 3D de tecidos embrionários em conjuntos de dados 3D. Há um "Centro de Aprendizagem" online para este software com vários tutoriais disponíveis 41. Abaixo estão descritas as etapas básicas necessárias para segmentar manualmente tecidos embrionários de embriões manchados de imunofluorescência (etapa 1.2). A segmentação manual é muito mais fácil depois que o embrião estiver corretamente posicionado em um eixo A-P/D-V padrão (veja a seção de pré-processamento do conjunto de dados de imagem, etapa 4.3).
    1. Carregue um conjunto de dados 3D TIFF. Certifique-se de especificar as dimensões voxel corretas, quando solicitado. Crie e conecte um módulo de visualização (por exemplo, "Orthoslice" ou "Volren") e inspecione o conjunto de dados em 3D.
    2. Conecte o campo Rótulo (ou Edite New Label Field em versões mais recentes de Amira). Neste software, os resultados da segmentação manual são armazenados em "materiais", por isso crie um material para cada tecido de interesse. Use a ferramenta "laço" para segmentação manual. Existem vários tutoriais disponíveis explicando como realizar isso (pesquise online para o "tutorial do Editor de Segmentação Amira").
    3. Quando terminar com a segmentação de todos os tecidos de interesse, saia do Editor de Segmentação mudando de volta para o modo Project . Tendo criado uma nova versão do conjunto de dados (o "campo de rótulos", que agora está conectado ao módulo de conjunto de dados original) no qual pixels pertencentes a cada material têm o mesmo valor.
    4. Converta esses "materiais" em objetos 3D gerando modelos de superfície 3D a partir do conjunto de dados "Rótulos". Isso pode ser feito anexando um módulo "Gerar superfície", ajustando parâmetros conforme necessário (ativar as opções "compactificar", "border", "Ajustar coords" e "Suavizar sem restrições"). Clique em Aplicar e um novo módulo *.surf é gerado.
    5. Visualizando os objetos de superfície, extraindo e exportando individualmente como arquivos *obj. Anexar um display | Módulo SurfaceView para o módulo *.surf e inspecione no visualizador principal. No painel "propriedades" do módulo "SurfaceView", na propriedade "Materiais" selecione Tudo + Tudo e clique em remover, para que o buffer do visualizador seja esvaziado. Em seguida, no segundo puxão para baixo da propriedade Materiais selecione apenas um material e clique em Adicionar ao buffer; apenas esse material deve ser visível.
    6. Na propriedade Desenhar estilo clique em mais opções | criar superfície e um novo módulo *.surf é criado e adicionado ao projeto. Renomeie-o para o nome do tecido (pressione F2 no teclado) e arquivo | Dados de exportação como... e Salvar como tipo: Wavefront (*.obj). Repita a operação para cada material.
      NOTA: Estes arquivos *.obj, cada um contendo um dos tecidos segmentados em Amira, podem ser usados por outras ferramentas (plugin "3Dviewer" de Fiji/ImageJ e SimLab).
  3. Visualização 3D interativa dentro de um formato de documento portátil (PDF) usando o SimLab Composer
    NOTA: Este software 3D Computer Graphics facilita a criação de imagens, animações e simulações renderizadas por superfície. Tutoriais úteis podem ser encontrados na linha 42. Aqui descrevemos como este software permite a criação de ilustrações interativas 3D PDF, usando os arquivos de superfície 3D da wavefront (*.obj) criados com Amira (Passo 2.3; Seção "renderização, visualização e análise 3D").
    1. Vá para o Arquivo | Novo e criar uma cena vazia. Em seguida , arquive | importar e importar o 1º arquivo *.obj salvo de Amira. Mantenha todas as opções da janela de arquivos Desproteção e clique em OK.
    2. Se nada aparecer na janela de exibição do Compositor, clique em Ctrl+F ou no ícone para encaixar tudo. Agora, o objeto segmentado deve aparecer no centro da janela. Repita o processo para adicionar outro objeto segmentado e confirme sua posição em relação ao 1º (por exemplo, 2 somitas adjacentes).
    3. Selecione um dos objetos na janela de exibição clicando com o botão esquerdo do mouse, altere seu nome para refletir o nome da estrutura ou tecido anatômico, em seguida, mude para a representação "3DGeom~1" e, usando o painel Materiais , altere a cor alterando os valores R,G,B.
    4. Repita para todos os objetos, até que a ilustração 3D esteja totalmente montada. Observe que alguns materiais também podem ser transparentes manipulando o canal "Alpha", ao lado dos valores RGB, e assim permitir a observação de objetos internos ou ocluídos.
    5. Com este software, a ilustração de embrião montada pode ser exportada como um arquivo "PDF 3D", que pode ser incluído em publicações. Primeiro crie um "modelo" com texto e links ativos para alterar "Estados de cena" para poder incluir instruções e três estágios diferentes na mesma ilustração. Isso pode ser feito mudando de "Construção de cena" para modo "Sharing" (botões à esquerda da janela Composer), depois clicando nas configurações do Show PDF e criando um novo modelo de página. Para criar uma figura interativa simples para incluir em um manuscrito, não use um modelo e simplesmente exporte PDF.
      NOTA: Use o software Adobe Acrobat Reader para interagir com os PDFs 3D (a operabilidade das funções na ilustração 3D PDF interativa pode variar dependendo das versões do Acrobat Reader disponíveis). A maioria dos outros espectadores não são compatíveis com o formato 3D PDF, incluindo navegadores da Web. Tais ilustrações interativas 3D PDF podem ser incluídas em publicações; pergunte aos editores sobre essa possibilidade com antecedência.
  4. Visualização e análise 3D usando Imaris
    NOTA: Este software permite visualização, análise e interpretação abrangentes de imagens de conjuntos de dados de microscopia 2D-4D, com interface intuitiva e fluxos de trabalho. Existem vários tutoriais úteis online sobre como começar com este software, disponível no site (https://imaris.oxinst.com/tutorials). Para carregar e interagir de forma mais eficaz com grandes conjuntos de dados em Imaris (tipicamente, aqueles maiores que a memória gpu) é aconselhável converter o conjunto de dados primeiro para "*.ims", usando o programa "ImarisFileConverter.exe" instalado na pasta de instalação Imaris. O ImarisFileConverter pode ler muitos formatos de imagem de microscopia, incluindo arquivos OME e "h5", salvos pelo BigDataViewer de Fiji.
    1. Visualização 3D
      1. Este software pode renderizar uma visualização 3D do conjunto de dados usando o modo "3D View" e o usuário é capaz de fazer vários ajustes na forma como o conjunto de dados é exibido [por exemplo, escolher entre MIP (Projeção de intensidade máxima) ou modo de mistura (melhor renderização com pistas de profundidade e sombras)].
      2. Modo de visualização ortogonal " - Com posicionamento adequado do embrião (Passo 4.3; Seção "Pré-processamento do conjunto de dados de imagem") pode-se usar a guia "Seção" e navegar por todo o embrião e ver seções ópticas dos planos normais (transversais, coronais e sagital). Se os embriões não forem devidamente reposicionados, interpretar sua anatomia com planos ortogonais é extremamente difícil (ver Figura Suplementar 3). Embora o Imaris tenha uma função conhecida como "quadro de referência" para contornar esse problema ao analisar embriões 3D, é preferível reposicionar os conjuntos de dados a priori.
    2. Análise 3D
      NOTA: Este software também possui várias ferramentas para analisar intensidades de morfologia e fluorescência. Como exemplo, aqui descrevemos um simples fluxo de trabalho para analisar variações de intensidade de fluorescência tecidual ao longo do tempo usando a ferramenta "Manchas" de Imaris, onde o usuário coloca manualmente regiões esféricas de interesse (ROIs) no embrião em 3D, e imaris podem então medir a fluorescência tecidual dentro desses ROIs esféricos.
      1. Carregue um conjunto de dados 3D ou 4D em Imaris e adicione um novo ponto no modo de visualização 3D . Em seguida, pode-se selecionar pontos específicos do embrião (também durante vários pontos de tempo se alguém usa um conjunto de dados 4D) e quantificar dentro desses pontos, por exemplo, a média de intensidade.
        NOTA: Este software também permite traçar a intensidade ao longo do tempo. Isso permite que o usuário responda facilmente a perguntas como: "como a fluorescência muda dentro de um somite ao longo do tempo?".
      2. Adicione o módulo spot clicando no botão Adicionar novo ponto ou selecionando a visualização 3D | Manchas no menu Imaris. Escolha Pular a reação automática, editar manualmente. Alterne o modo de ponteiro Imaris de Navegar para Selecionar (isso também pode ser feito acertando a tecla ESC no teclado).
      3. Na janela de propriedades Spots , selecione o canal Específico ao qual a mancha será anexada (por exemplo, "Canal 1") e ative no Manual de rastreamento do auto-conecte ao local selecionado e a ativação de atraso antes de opções de avanço automático .
      4. Mova o cursor do mouse para a janela de visualização e o cursor deve mudar para uma esfera de fio amarelo oca. Vá para o ponto de tempo 1 e adicione uma mancha (=esfera) clicando no tecido de interesse. A esfera ("Spot") só é adicionada se clicar enquanto segura a tecla shift . Repita para todos os pontos de tempo desejados certificando-se de rastrear a mesma porção de tecido ao longo do tempo.
      5. Na janela Propriedades de manchas , mude para a guia Estatísticas e dentro da análise de Estatísticas de estatísticas gerais para detalhadas . A partir do primeiro pulldown escolha valores específicos, e a partir do segundo pulldown escolha "Intensidade média Ch=*...", onde Ch* é o canal em que a medição será realizada. Um botão à direita para o painel "Clique para abrir o painel de plot horário" será encontrado na parte inferior esquerda da janela de propriedades das manchas. Clicar neste botão abre um enredo com a intensidade mediana da fluorescência dentro dos "pontos", plotados ao longo do tempo. Esses valores também podem ser exportados para uma planilha para análise posterior.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Os resultados representativos apresentados neste artigo tanto para a imagem de imunofluorescência ao vivo quanto para a imunofluorescência, foram obtidos utilizando-se um sistema de dois fótons, com um objetivo de água de 20 × 1.0 NA, o laser de excitação sintonizado em 960 nm, e os fotodetetores GaAsP (conforme descrito em Dias et al. (2020)43. A tomografia de projeção óptica foi feita utilizando um scanner OPenT construído sob medida (como descrito em Gualda et al. (2013)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Alongamento axial e segmentação são dois dos processos mais complexos e dinâmicos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário vertebrado. O uso de imagens 3D e 4D com rastreamento unicelular tem sido aplicado, há algum tempo, para estudar esses processos tanto em embriões de zebrafish quanto de frango, para os quais as condições de acessibilidade e cultura facilitam imagens complexas 19,44,45,46,47,48,49

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Olivier Pourquié e Alexander Aulehla pela estirpe repórter da LuVeLu, o laboratório SunJin para a amostra de teste RapiClear, Hugo Pereira pela ajuda usando o BigStitcher, Nuno Granjeiro para ajudar a montar o aparelho de imagem ao vivo, a instalação animal do IGC e membros passados e presentes do laboratório Mallo para comentários e apoio úteis durante este trabalho.

Agradecemos o apoio técnico do Advanced Imaging Facility da IGC, que é apoiado pelo ref de financiamento português# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, co-financiado pelo Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), no âmbito do Acordo de Parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado por subvenções LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., a infraestrutura de pesquisa Congento, o projeto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e a bolsa de doutorado PD/BD/128426/2017 para A.D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose low gelling temperatureSigmaA9414Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira softwareThermofisher-Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)SigmaL9393 RRID:AB_477163For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albuminBiowestP6154For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0(any)-100um thick
Coverglass 20x20 mm #1(any)-170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5(any)-To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)Life TechnologiesD3571For immunofluorescence
Drishti software(open source)-Free software tool
EDTASigmaED2SSFor demineralization
Fiji/ImageJ software(open source)-Free software tool
GlycineNZYtechMB01401For immunofluorescence
Huygens softwareScientific Volume Imaging-Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serumGE Healthcare#HYCLSH30070.03For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %Milipore1085971000For clearing
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commerial software tool
iSpacersSunJin Lab(varies)Use as spacers for preparations
L-glutamineGibco#25030–024For live imaging medium
Low glucose DMEMGibco11054020For live imaging medium
M2 mediumSigmaM7167To dissect embryos
MethanolVWRVWRC20847.307For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylateSigmaM6752Used to clear embryos
ParaformaldehydeSigmaP6148Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycinSigma#P0781For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambersSigmaC5474Use as spacers for preparations
simLab softwareSimLab soft-Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm(any)-To mount thick embryos.
Triton X-100SigmaT8787For immunofluorescence

Referências

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042(2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524(2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97(2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644(2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429(2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060(2012).
  41. Thermofisher.com. , Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020).
  42. Simlab-soft.com. , Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020).
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615(2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611(2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586(2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252(2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996(2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Biologia do DesenvolvimentoQuest o 168reconstru o 3Dimagem vivavertebradosdesenvolvimento embrion rio de camundongossomitog nesemesodermeextens o axialNMPsimunofluoresc nciat cnicas de compensa oan lise de imagemensino

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados