使用标准化肠道循环模型对小鼠肠道渗透性和中性粒细胞转导的功能评估

摘要

受管制的肠道上皮屏障功能和免疫反应是炎症性肠病的标志，由于缺乏生理模型，这些特征仍然调查不力。在这里，我们描述了一个鼠标肠道循环模型，它采用了血管化和外化良好的肠道部分，以研究粘膜渗透性和白细胞在体内的招募。

摘要

肠道粘膜由一层上皮细胞排列，形成动态屏障，允许球细胞传输营养物质和水，同时防止发光细菌和外源物质的通过。这一层的破坏导致对发光成分的渗透性和免疫细胞的招募增加，这两者都是肠道病理状态的标志，包括炎症性肠病（IBD）。

由于缺乏允许定量分析的实验性体内方法，对多态核嗜中性粒细胞（PMN）上皮屏障功能和转位迁移（TEpM）的机制不完全了解。在这里，我们描述了一个强大的木质实验模型，它采用了外化肠道部分的肠或近结肠。外化肠道环 （iLoop） 完全血管化，与通常用于研究上皮细胞单层的渗透性和 PMN 迁移的前体内室方法相比，具有生理优势。

我们详细演示了该模型的两种应用：（1） 通过检测血清中的荧光标记的脱氧转体在血清中检测肠道渗透性（2） 在肠道上皮中引入化疗法后对迁移的 PMN 进行定量评估。我们证明了这个模型的可行性，并提供了利用iLoop在小鼠缺乏上皮紧密结相关蛋白质JAM-A相比对照的结果。JAM-A 已被证明在炎症反应期间调节上皮屏障功能以及 PMN TEPM。我们使用 iLoop 的结果证实了以前的研究，并强调了 JAM-A 在调节肠道渗透性和 PMN TEPM 在体温平衡和疾病期间在体内的重要性。

iLoop模型为肠道平衡和炎症的活体研究提供了高度标准化的方法，将显著提高对IBD等疾病中肠道屏障功能和粘膜炎症的认识。

引言

肠道粘膜包括单层柱状肠道上皮细胞（IECs）、底层拉米纳丙膜免疫细胞和肌肉粘膜。除了它在营养物质吸收中的作用外，肠道上皮是保护身体内部免受发光共生细菌、病原体和膳食抗原侵害的物理屏障。此外，IEC 和拉米纳丙膜免疫细胞协调免疫反应，根据上下文和刺激诱导耐受性或反应。据报道，上皮屏障的破坏可以先于病理粘膜炎症的发生，并导致炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎和克罗恩病1，2，3，4，5，6，7。溃疡性结肠炎患者出现多态核嗜中性粒细胞（PMN）的过度转导（TEPM），形成隐秘脓肿，这一发现与疾病^8、9的严重程度有关。虽然上皮屏障功能受损和免疫反应过度是IBD的标志，但缺乏对肠道渗透性和免疫细胞招募进行肠道粘膜的定量评估的体内检测实验。

最常见的方法用于研究肠道上皮渗透性和PMN TEPM采用前体内室为基....

研究方案

所有动物实验都是根据国家卫生研究院的指导方针和政策进行的，并经密歇根大学动物护理与使用机构委员会批准。

1. 术前准备

注：这种方法是利用C57BL/6遗传背景的成年小鼠产生的，年龄在8-12周。所有小鼠都处于严格的特定无病原体条件下，并可获得正常的周和水。结果使用C57BL/6，果酱-空小鼠（Jam-a-/-）或在IEC（维林-克里）上有选择性地丢失JAM-A的小鼠获得：果酱-一个^fl/fl）和垃圾队友Jam-a^fl/fl控制如前所述^30。

1. 区域准备
   1. 在清洁区域进行手术。然而，肠道循环模型是一种不需要无菌/无菌技术的非生存性手术。观察兽医卫生做法，使用清洁的手术器械（即用肥皂擦洗，用水冲洗，然后用70%乙醇冲洗）。
   2. 打开温度控制的手术板（或加热垫），并调整光源，以防止动物在麻醉和手术期间体温过低。
   3. 通过切割 6 厘米段的不可吸收的 4-0 丝绸手术缝合线来准备连结。
   4. 准备棉纱布（5厘米×5厘米），在中心切后，椭圆形。这些将用于覆盖中线腹腔切除术，并防止外部的iLoop和动物毛皮之间的直接接触。将切....

结果

图1和图2分别描绘了ileal循环和pcLoop模型的示意图。 解剖图片显示了手术的关键步骤，包括肠道部分（图1B和图2B）的外部化，确定一个适当的位置，使血液供应的最小干扰（图1C和图2C）和清洁后，可以充满试剂溶液的iLoop切?.......

讨论

对IBD等病理条件下肠道屏障功能调节不良和免疫细胞招募的机制不完全了解。在这里，我们详细介绍了一个强大的体内粘液模型，它采用了肠道或近端结肠的血管化外化肠道部分，并允许评估肠道渗透性、中性粒细胞迁移研究以及其他应用。

iLoop 是在活体动物身上进行的非恢复性手术。麻醉必须在实验过程中持续监测，并强制评估饱和深度。最关键的步骤包括 （1） iLoop 的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs	BD	326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"	BD	305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle	BD	309659
15ml Centrifuge Tube	Corning	14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate	FisherScientific	07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape	FisherScientific	15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)	FST	12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)	FisherScientific	06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes	Thomas Scientific	c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)	Sarstedt	41.1501.105
Moria Fine Scissors	FST	14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)	Falcon	352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant	Dechra	12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)	FST	1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting	HenrySchein	SS694
Student Fine Forceps, Angled	FST	91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle	Millipore Sigma	Z248029
96 Well Cell Culture Plate	Corning	3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	BioWhittaker	10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution	Corning	21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)	BioLegend	127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen	C36950
Dithiotreitol	FisherScientific	BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	R&D Systems	511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000	Sigma	60842-46-8
Isoflurane	Halocarbon	12164-002-25
Leukotriene B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)	BD Pharmingen	557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)	BD Bioscience	553142
Recombinant Murine IFN-γ	Peprotech	315-05
Recombinant Murine TNF-α	Peprotech	315-01A