표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

요약

Dysregulated 장 상피 장벽 기능 및 면역 반응은 생리적인 모형의 부족 때문에 제대로 조사되지 않는 선동적인 장 질병의 특징입니다. 여기서는 생체 내 점막 투과성 및 백혈구 모집을 연구하기 위해 잘 혈관화되고 외부화된 장 세그먼트를 사용하는 마우스 장 루프 모델을 설명합니다.

초록

장 점막은 발광 박테리아와 외인성 물질의 통행을 방지하면서 영양분과 물의 파라세포 수송을 허용하는 동적 장벽을 형성하는 상피 세포의 단일 층에 의해 줄지어 있습니다. 이 층의 위반은 발광 내용및 면역 세포의 모집에 증가 투과성 귀착됩니다, 둘 다 염증성 장 질환 (IBD)을 포함하여 창자에 있는 병리학 상태의 특징입니다.

다형성 핵 호중구(PMN)의 상피 장벽 기능 및 환피상전환(TEpM)을 조절하는 메커니즘은 정량적 분석을 허용하는 생체 내 실험 적 방법의 부족으로 인해 불완전하게 이해된다. 여기서, 우리는 ileum 또는 근위 결장의 외부화된 장 세그먼트를 채택하는 강력한 뮤린 실험 모형을 기술합니다. 외부장 루프(iLoop)는 완전히 혈관화되어 있으며 상피 세포 단층층을 통해 투과성 및 PMN 이동을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 전 생체 내챔버 기반 접근 방식에 비해 생리적 이점을 제공합니다.

우리는 이 모델의 두 가지 적용을 자세하게 보여줍니다: (1) 내루피알 주사 후 혈청에서 형광 라벨덱스트랜스의 검출을 통한 장 투과성의 정량적 측정, (2) 장 내 상피로 이동된 PMN의 정량적 평가는 항문 내 항막내 도입 후 장 루멘으로. 우리는 이 모형의 타당성을 입증하고 대조군에 비해 상피 단단한 접합 관련 단백질 JAM-A가 결여된 마우스에 있는 iLoop를 이용한 결과를 제공합니다. JAM-A는 염증 반응 도중 PMN TEpM뿐만 아니라 상피 장벽 기능을 조절하기 위하여 보였습니다. iLoop를 사용하여 우리의 결과는 이전 연구 결과를 확인하고 항상성 및 질병 도중 생체내에 있는 장 투과성 및 PMN TEpM의 규칙에 있는 JAM-A의 중요성을 강조합니다.

iLoop 모델은 장 내 항상성 및 염증의 생체 내 연구에서 재현 가능한 고도로 표준화된 방법을 제공하며 IBD와 같은 질병의 장 장벽 기능 및 점막 염증에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.

서문

장 점막은 기둥 장 상피 세포 (IeCs), 기본 라미나 프로프리아 면역 세포 및 근막 점막의 단일 층을 포괄합니다. 영양분의 흡수에 그것의 역할 이외에, 장 상피는 발광 장성 박테리아, 병원체 및 규정식 항원에서 바디 내부를 보호하는 물리적 장벽입니다. 또한, IeCs 및 lamina propria 면역 세포는 문맥과 자극에 따라 내성 또는 반응을 유도하는 면역 반응을 조정합니다. 상피 장벽의 붕괴는 병리학점막 염증의 발병을 선행하고 궤양성 대장염과 크론병^{1,2,3,4,5,6,7을}모두 포괄하는 염증성 장질환(IBD)에 기여할 수 있다고 보고되었다. 궤양성 대장염을 가진 개인은 다형성 핵 호중구(PMN)의 과도한 환전성 이동(TEpM)을 존재하여 토굴 농양을 형성하고, 질병의 중증도와 연관된 발견^8,9. 손상된 상피 장벽 기능및 과도한 면역 반응은 IBD의 특징이지만, 장 투과성 및 면역 세포 모집의 정량적 평가를 수행하기 위한 생체 내 분석의 부족이 장 점막으로.

장 상피 투과성을 연구하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법은 반투과성 다공성 멤브레인^{삽입물 10,11,12에}배양된 IEC 단층제를 사용하여 전 생체 챔버 기반 접근법을 채용한다. 상피 장벽 무결성은 형광전기 저항(TEER) 또는 플루오레세인 이소티오카네이트(FITC)의 파라세포 플럭스의 측정에 의해 모니터링되며,^{기저구(13,14,15)에}대한 대피에서 표기된 dextran을 표기한다. 유사하게, PMN TEpM은 전형적으로 하부^{챔버(16)에}첨가되는 화학요법제에 대한 응답으로 연구된다. PMN은 상부 챔버에 배치되고 인큐베이션 기간 이후에, 기저 구획으로 마이그레이션된 PMN은 수집및 정량화된다. 이러한 방법은 유용하고, 수행하기 쉽고, 매우 재현가능하지만, 분명히 감소주의적 접근 방식이며 반드시 생체 내 조건의 정확한 반사를 나타내는 것은 아닙니다.

마우스에서, 장 내 세포 투과성을 연구하는 일반적인 분석은 FITC-dextran의 경구 영역및 혈액^{혈청(13,17)에서}FITC-dextran 외관의 후속 측정에 의한 것이다. 이 분석의 단점은 지역 장 기여보다는 위장관의 전반적인 장벽 무결성에 대한 평가를 나타낸다는 것입니다. 또한, 에반스 블루는 일반적으로 생체 내 혈관 누설을 평가하는 데사용되며 마우스 및^{쥐(19, 20,21)에서}장점 막투도를 평가하기 위해 사용되어 왔다. 장 점막에서 에반스 블루의 정량화는 하룻밤 포르마이드에서 배양을 사용하는 조직에서 추출이 필요합니다. 따라서 동일한 조직을 사용하여 장상피성 투과성 및 호중구 침투를 연구할 수 없습니다.

여기서 우리는 생체 내에서 대장 점막 투과성 및 백혈구 환전 이동에 재현 가능한 데이터를 수집하는 데 필요한 동물의 수를 줄이는 간단한 프로토콜을 강조합니다. 따라서 추가 분석을 위해 수확할 수 있는 장 루프의 무결성을 손상시키지 않으면서 혈액 혈청에서 쉽게 감지할 수 있는 FITC-덱스트랜스를 사용하는 것이 좋습니다. 참고, 장 계측 루프는 세균 감염(예: 살모넬라, 리스테리아 단세포유전자 및 대장균)^{22,23,24,25뿐만} 아니라 장 투과성(26)을 연구하기 위해 다양한 종(마우스, 쥐,^토끼,송아지 포함)에서 사용되어 왔다. 그러나, 우리의 지식의 최고에 IBD에 일반적으로 관련 되 고 ileum 또는 결장 과 같은 창 자에 있는 특정 지역에서 PMN TEpM의 메커니즘을 조사 하는 연구.

여기서 우리는 장 내 루프 (iLoop) 모델을 설명하며, 이는 ileum 또는 근위 결장의 잘 혈관화되고 외부화 된 장 세그먼트를 사용하는 생체 내의 견고하고 신뢰할 수있는 미세 수술 방법입니다. iLoop 모형은 생리적으로 관련있고 마취의 밑에 살아있는 마우스에 장 장벽 무결성 및 PMN TEpM의 평가를 허용합니다. 우리는 두 가지 응용 프로그램을 시연 : 1) iLoop 2) 강력한 chemottractant Leukotriene B4 (LTB₄₎ ^27의인트라피컬 주입 후 iLoop 루멘에서 전환 PMN의 정량화 후 4kDa FITC-dextran의 혈청 수준의 정량화 . 더욱이, ILOOP 모델을 활용하여 잼-a-null마우스 또는 마우스가 IC에 JAM-A의 선택적 손실을 품고있다(빌린-크레크; Jam-a ^fl/fl)대조마우스에 비해, 우리는 장 투과성 및 호중구 환전에 단단한 접합 관련 단백질 JAM-A에 대한 주요 기여를 보고한 이전 연구를 확증할 수 있다^{15,28,29,30,31.}

iLoop 모델은 체외 학적 으로 확증하는 데 사용할 수있는 고기능적이고 생리적 인 방법입니다. 더욱이, 이것은 화학, 사이토카인, 세균병원균, 독소, 항체 및 치료제를 포함하여 루프 루멘에 주입될 수 있는 각종 시약을 연구할 수 있는 다목적 실험 모델입니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 국립 보건원의 지침과 정책에 따라 수행되었으며 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 수술 전 준비

참고: 이 방법은 8-12주 된 C57BL/6 유전적 배경에서 성인 마우스를 채용하여 생성되었다. 모든 마우스는 정상적인 차우와 물에 대한 광고 리비툼 액세스를 가진 엄격한 특정 병원체 없는 조건하에서 보관되었다. 결과는 C57BL/6, 잼-a-null 마우스(Jam-a-/-)또는 IEC에 JAM-A의 선택적 손실을 품고 있는 마우스(Villin-cre; 잼 -a^{fl / fl)}및 쓰레기 메이트 잼 - afl^{/ fl} 컨트롤 이전에 설명 된³⁰.

1. 지역 준비
   1. 깨끗한 공간에서 수술을 하십시오. 그러나 장 루프 모델은 무균/멸균 기술이 필요하지 않은 비생존 수술입니다. 수의 위생 관행을 관찰하고 청소 수술 기구를 사용합니다 (즉, 비누로 문질러물로 헹구고 물로 헹구고 70 % 에탄올이 뒤따릅니다).
   2. 온도 조절 수술 보드 (또는 가열 패드)와 적응 광원을 켜서 마취 및 수술 중에 저체온증으로부터 동물을 유지합니다.
   3. 흡수성이 없는 4-0 실크 수술 봉합사의 6cm 세그먼트를 절단하여 합자를 준비합니다.
   4. 타원 모양에 따라 중앙에 절단 된 면 거즈 (5cm x 5cm)를 준비하십시오. 이들은 미드 라인 복강경절제술을 커버하고 외부 iLoop와 동물 모피 사이의 직접 접촉을 방지하는 데 사용됩니다. 페트리 접시 용기에 따뜻한 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 잘라낸 거즈를 담그세요.
   5. 장기와 외부 iLoop를 처리하는 데 사용되는 따뜻한 HBSS에 담근 젖은 면봉을 준비합니다.
   6. 따뜻한 HBSS로 채워진 10mL 주사기를 준비하고 노란색 먹이 튜브에 부착하십시오. 이 주사기는 수술 중 노출 된 조직을 보습하고 배설물 함량의 iLoop를 부드럽게 플러시하는 데 사용됩니다.
2. 동물 제제
   1. 승인된 동물 프로토콜에 따라 동물을 마취합니다. 이 프로토콜에서 이소플루란과 산소의 혼합은 마취 기화기를 통해 투여된다. 제조업체의 지시에 따라 산소 유량량을 1 L/min으로 조정합니다. 기화기를 5%로 설정하고 유도 챔버를 미리 충전합니다. 5분 후 이소플루란 기화기를 2%-2.5%로 줄입니다.
   2. 인덕션 챔버에 동물을 3 분 - 5 분 동안 배치 한 다음 가열 된 수술 보드에 동물을 옮기고 마취 노세콘 플러그를 연결합니다. 접착제 테이프를 사용하여 4 개의 사지에 의해 동물을 척추 위치에 억제하십시오.
      참고: 마취 대안으로, 식염수 용액 (0.9 % NaCl)에서 희석 된 케타민 (80 mg / kg - 100 mg / kg)과 자일라진 (5 mg / kg - 10 mg / kg)의 혼합물은 내과 연골 주사에 의해 관리 될 수 있습니다. 마취는 마취 깊이를 보장하기 위해 케타민 / 자일라진 (초기 투여의 0.1 - 0.25 배)의 근육 내 투여에 의해 수술 전반에 걸쳐 유지되어야합니다. 사용 가능한 경우, 이소플루란 마취 기화기는 더 나은 재현성, 생존력을 보장하고 동물의 통증을 예방하는 것이 좋습니다.
   3. 각막 탈수를 방지하기 위해 양눈에 안과 연고를 적용합니다.
   4. 심박수(약 500비트/분) 및 리듬, 점막 색상(핑크), 모세관 리필 시간(< 2초), 호흡률(40~60μc 이하), 온도(36.5°C)^32를포함하는 신체 검사를 수행한다.
   5. 다음 단계로 진행하기 전에 페달 철수 반사로 마취 깊이를 평가합니다. 발가락과 발가락 패드 사이의 피부의 고통스러운 자극 (핀치)을 사용합니다. 마우스는 다리를 수축하고 제거하여 반응합니다. 이 페달 반사는 동물이 심히 마취될 때 사라집니다.
      참고: 기초와 페달 반사의 모니터링은 최소 15 분마다 마취 전반에 걸쳐 권장됩니다. 마취 깊이평가를위한 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침은 다음과 같은 모니터링을 권장합니다 : (a) 꼬리, 발 및 점막 (예 : 혀)의 색상. 감소 된 혈액 관류 또는 호흡 곤란을 나타내는 정상및 창백한 또는 파란색으로 분홍색색; (b) 호흡 패턴을 규칙적 대 불규칙한 호흡으로 평가한다. 직장 온도 프로브, 설치류 옥시미터 및 심박수 모니터는 각각 체온, 심장 및 호흡률의 평가에 사용할 수 있습니다.

2. 일루 루프의 생성

1. 피부 준비: 70% 에탄올에 담근 알코올 면봉이나 거즈 스폰지로 복부 미드라인의 털을 닦아주세요. 저체온증을 방지하기 위해 알코올로 모피의 넓은 영역을 적시지 마십시오.
2. 가위를 사용하여 중간 라인 복강경 절제술을 수행합니다. 복부 의 중간에 수직 절개를 하고 (길이 약 2cm) 복막을 노출합니다. 복부 내 장기를 손상시키지 않도록주의하십시오.
3. 노출 된 복강 내 구멍 위에 미리 절단 된 젖은 면 거즈를 놓습니다.
4. 젖은 면봉을 사용하여 케이쿰을 동원하고 외부화하십시오. 젖은 면 거즈에 조심스럽게 케이쿰을 놓습니다.
   참고 : Caecum은 동물의 성별과 무관한 대부분의 마우스에서 복강의 왼쪽 소달 사분면에 국한됩니다.
5. 젖은 면봉을 사용하여 말단 단부(단단)가 케이쿰(도1B)에부착되는 일루를 동원하고 부드럽게 외부화한다.
6. 장막 혈관과 혈액 공급의 중단없이 젖은 면 거즈에 말단 일루의 적어도 6cm를 배포합니다. 혈액 공급은 출혈이 없고 조직이 분홍색색(도 1B)을유지하면 유지된다.
   참고: 노란 먹이 튜브에 부착된 10mL 주사기를 사용하여 따뜻한 HBSS(2~3분마다)로 항상 습한 조직을 유지하여 노출된 조직의 건조를 피하십시오(1.1.6단계).
7. 케이컴에 가깝게, 장막에 ileum을 공급하는 주요 동맥을 식별합니다. 그런 다음 중요한 혈관이없는 막질에 두 개의 결찰 부위를 찾습니다.
8. 무딘 조직 집게를 사용하여, 단단히 말단 ileum을 잡아 (케이쿰에 가장 가까운) 미세 팁 집게를 사용하여, 혈관을 피하는 메Sentery를 회귀. 천공을 가로 질러 실크 봉합사를 놓고 수술 매듭을 묶어 첫 번째 결찰 (루프의 말단 끝)을 만듭니다.
9. 제1 합자로부터 4cm 떨어진 곳에 눈자를 사용하여 2.8단계(도 1C)에서언급한 바와 같이 두 번째 합자(루프의 근접 끝)를 생성한다.
10. 4cm 일막 루프를 분리하기 위해 각 결집 옆에 조심스럽게 절단된 미세 한 가위를 사용하여 혈액 공급과 막막이 그대로 유지됩니다.
    참고: iLoop의 외부 세그먼트의 양쪽 끝을 잘라낸 다음 발광 내용물(대변 물질)과의 간섭을 방지하는 데 필요한 단계로 부드럽게 플러시하여, 격리된 세그먼트의 전체 길이에 걸쳐 FITC-dextrans 또는 화학 물질 자극의 분산을 용이하게 하고 삼각순환의 보다 정확한 정량화를 허용합니다. 이 절차는 또한 시약의 지정된 볼륨의 주입 후 점막의 균일 한 팽창과 동물 사이의 더 나은 재현성을 허용합니다.
11. 10mL 주사기에 부착된 유연한 노란색 공급 튜브를 사용하여 온난한 HBSS로 일릴 루프 세그먼트의 함량을 부드럽게 플러시합니다(1.1.6단계 참조).
12. 실크 봉합사를 사용하여 플러시 된 일릴 루프의 두 컷 끝을 리게이트합니다.
13. 30G 바늘로 1mL 주사기를 사용하여 FITC-dextrans(Step 4.2) 또는 케모킨(Step 5.3)과 같은 시약의 250 μL을 장 루멘에 천천히 주입한다. 일막 루프는 점막의 적당한 팽창을 일으키는 팽창합니다(도 1D).
    참고: 막심 동맥의 반대편에 있는 루프 루멘에 시약을 주입합니다. 혈관을 찢고 출혈을 유도하기 위해 주입하는 동안 동물에서 일루루프를 꺼내지 않도록주의하십시오.
14. 젖은 면봉을 사용하여 일루 루프, 근위 일루, 케이쿰을 부드럽게 되돌려 놓습니다.
15. 바늘 홀더, 해부학 적 집게 및 3.0 흡수할 수 없는 실크 봉합사를 역절단 바늘로 사용하여 복벽을 닫습니다.
16. 인큐베이션 기간 동안 온도 조절 마취 챔버에 동물을 배치합니다.

3. 근접 결장 루프의 생성 (pcLoop)

참고: pcLoop의 생성에 사용된 마우스에 대한 자세한 내용은 프로토콜 섹션의 시작 부분에 제공된 정보를 참조하십시오.

1. 2.1 단계를 수행합니다. - 2.4. 일루프에 대해 위에서 설명한 대로.
2. 젖은 면 봉면을 사용하여 전체 일루를 외부화하고 젖은 면 거즈 위에 놓습니다. 메소콜론에 있는 근위 결장및 혈액 공급을 확인합니다. 근위 결장을 동원하고 미세 팁 집게를 사용하여 메소콜론내 혈관이 없는 부위에 제1 합자를 케이쿰(도2B)으로부터약 0.5cm 의 결단체로 생성한다.
3. 제1 합자로부터 2cm를 측정하고 메소콜론(그림2C)에서혈액 공급이 없는 영역에서 두 번째 합자를 생성한다.
4. 2cm 길이의 pcLoop를 분리하기 위해 각 결집 옆에 조심스럽게 잘라내는 미세 한 가위를 사용하십시오.
   참고: 2.10 단계 의 노트에서 언급 했듯이 조명 내용의 부드럽게 세척되는 pcLoop를 격리하기 위해 양 끝을 차단하는 것이 중요합니다. 대장 조직과 메소콜론을 조심스럽게 잘라 내어 작은 혈관이 장 루멘으로 출혈하는 것을 방지합니다. 필요한 경우 열 소감을 사용하여 절개 부위의 출혈을 제한하십시오.
5. 10mL 주사기에 부착된 유연한 노란색 수유 튜브를 사용하여 대변을 제거하기 위해 따뜻한 HBSS로 pcLoop를 부드럽게 플러시합니다(1.1.6단계 참조).
6. 실크 봉합사를 사용하여 플러시 pcLoop의 두 컷 끝을 리게이트합니다.
7. 30G 바늘로 1mL 주사기를 사용하여 FITC-dextrans(Step 4.2) 또는 케모킨(Step 5.3)과 같은 시약의 200 μL을 내장 루멘에 천천히 주입한다. pcLoop는 점막의 적당한 팽창을 일으키는 팽창합니다(도 2D).
   참고: 간질 동맥의 반대편에 있는 pcLoop 루멘에 시약을 주입합니다. 동물 간의 일관성을 보장하고 점막의 동등한 팽창을 보장하기 위해 2cm 길이의 pcLoop를 만듭니다.
8. 젖은 면봉을 사용하여 합선 pcLoop, 일루 및 케이쿰을 복강에 부드럽게 배치합니다.
9. 바늘 홀더, 해부학 적 집게 및 3.0 흡수할 수 없는 실크 봉합사를 역절단 바늘로 사용하여 복벽을 닫습니다.
10. 인큐베이션 기간 동안 온도 조절 마취 챔버에 동물을 배치합니다.

4. 장 투과성에 대한 정량적 평가: 4 kDa FITC-dextran 분석

1. 일루 루프 또는 pcLoop를 수행 (위에서 설명한 대로).
2. 30G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여, 장 루멘에 250 μL(ileum- 단계 2.13) 또는 200 μL(콜론 - 단계 3.7) 4kDa FITC-dextran 용액(HBS에서 1 mg/mL)을 주입한다. 사용하지 않은 FITC-dextran 용액을 빛으로부터 보호하여 세럼 수집 후 표준 곡선을 준비합니다.
3. ileal 루프의 경우 pcLoop 단계3.8 ~ 3.10에 대해 2.14 ~ 2.16 단계를 따릅니다. 간략하게, 기관 및 iLoop를 복강으로 다시 제자리에 놓고 복벽을 닫습니다.
4. 가열 된 마취 챔버에 120 분 동안 동물을 놓습니다.
5. 잠복기가 복부 벽을 열고 나서, 심장에 접근하고 혈액을 수집하는 25G 바늘로 1 mL 주사기를 사용하여 심장 구멍을 수행합니다. 혈액을 1.3mL 혈청 응고 활성제 튜브로 옮기고 부드럽게 섞어 빛으로부터 보호되는 얼음을 유지합니다. 마우스 당 적어도 500 μL의 혈액을 수집합니다.
   참고: 동물은 참수 또는 자궁 경부 탈구와 같은 물리적 방법을 사용하고 승인 된 동물 프로토콜에 따라 마취 될 때 안락사됩니다.
6. 제조업체의 권장 사항에 따라 실온에서 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 혈청 응고 활성제 튜브. 혈청(supernatant)을 수집하고 1.7mL 원심분리기 튜브로 옮킨다. 튜브를 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.
7. 혈액 혈청에서 형광의 정량화
   1. 대조군 마우스의 혈청에서 FITC-dextran 4 kDa의 표준 곡선을 준비합니다(식염수 또는 HBSS는 유효한 대안입니다). 1 mg/mL FITC-dextran의 시작 농도로 2배 연속 희석을 만듭니다. FITC-dextran 4 kDa 농도는 0.25 mg/mL 및 2 μg/mL 사이의 범위를 측정합니다.
   2. 제조업체의 지침 및 게시된^{프로토콜(33)에}따라 시료와 표준의 동일한 부피를 검정 96웰 플레이트(평평한 바닥)로 전송하고 형광판 판독기(엑터490 nm, 배출 520 nm)에서 FITC를 측정한다. 실험 대조군으로 정규화된 접이식 변화로 표준 곡선 또는 현재 투과성 값을 기반으로 FITC 농도를 계산합니다.

5. 케모킨과 의 반루무날 자극 후 장 루멘으로 이동된 PMN의 정량적 평가

참고: 기준선 수준에서 장 점막에 상주하는 PMN은 극소수에 달합니다. 프로 염증 성 사이토카인을 가진 동물의 전처리는 장 점막으로 혈류량에서 PMN 모집을 용이하게 하는 선동적인 환경을 초래합니다.

1. 30G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여, 인산염 완충성 살린(PBS)의 200μL에서 종양 괴사 계수 계수 계 α수(TNFα)의 100 ng 및 인터페론 γ(INFγ)의 100 ng의 멸균 용액의 인분막(i.p.) 주입을 수행한다.
2. 4 -24 h의 프로 염증 성 사이토카인을 사용하여 전처리 한 후, 일루 루프 또는 pcLoop를 수행하십시오(위에서 설명한 대로).
3. 30G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여, HBSS에서 화학요법용루코트리엔 B4(LTB₄₎1nM의 250 μL(ileum- 단계 2.13) 또는 200 μL(콜론 - 단계 3.7) 중 장 루멘에 주입한다.
   참고: 류코트리엔 B4 (LTB_4)는PMN에 대한 강력한 화학 요법으로이 프로토콜에 사용된다. N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine(fMLF) 또는 체모킨(C-X-C 모티프) 리간드 1(CXCL1/KC)과 같은 다른 화학요법제는 또한 PMN을 콜로니컬^{루멘(30)으로}유의하게 모집하도록 유도하는 데 사용될 수 있다.
4. ileal 루프의 경우 2.14 ~ 2.16 단계를 따릅니다. pcLoop의 경우 3.8에서 3.10 단계를 따릅니다. 간략하게, 기관 및 iLoop를 복강으로 다시 제자리에 놓고 복벽을 닫습니다.
5. 가열 된 마취 챔버에 60 분 동안 동물을 놓습니다.
6. 장 루프 콘텐츠 컬렉션
   1. 용액을 준비하고 얼음에 저장: 일레루프와 pcLoop의 경우 칼슘과 마그네슘이 없는 멸균 PBS에 2m 에틸렌디아미네트라아세트산(EDTA), 5m 디티오트레이톨(DTT), 2%의 FBS를 함유한 워시 버퍼를 준비한다.
   2. 잠복기 후 마취 유지 보수 하에서 복부 벽을 열고 iLoop (일루 루프 또는 pcLoop)를 당깁니다. 참수 또는 자궁 경부 탈구와 같은 물리적 방법을 사용하여 마취 하에있을 때, 그리고 승인 된 동물 프로토콜에 따라 동물을 안락사.
   3. 감기 PBS로 루프를 헹구고 잔류 혈액 오염 물질을 제거하고 조직 물티슈로 PBS를 초과 흡수합니다. 루프 함량을 1.7mL 원심분리기 튜브(일루프용 약 250μL, pcLoop의 경우 200μL)로 조심스럽게 수집합니다. 500 μL 냉세척 버퍼로 루프를 플러시하고 수집 직후 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
      참고: DTT는 점액을 용해하는 데 도움이 됩니다. iLoop 발광 함량이 매우 점성 (마우스 유전 배경에 따라) DTT를 포함하는 세척 버퍼로 1:2 또는 1:3을 희석시.
   4. 셀 스트레이너 캡이 있는 5mL 라운드 하단 튜브를 사용하여 35 μm 나일론 메쉬 필터를 통해 발광 콘텐츠 솔루션을 전달합니다. 이 단계는 조직 단편 및 세포 응집체를 제거하는 데 도움이됩니다. 셀 스트레이너를 세척 버퍼 1mL로 헹구세요.
   5. 4°C에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기 튜브. 500 μL - 1 mL 세척 버퍼, 5 분, 4 ° C에 대한 400 x g에서 원심 분리기와 함께 상류체, 헹구는 펠릿을 폐기하십시오.
   6. 칼슘과 마그네슘없이 멸균 PBS에 2 % FBS를 포함하는 유세포 분석 완충 (FCB)의 200 μL에서 iLoop 발광 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포는 튜브에 보관하거나 유동 세포피성 염색 및 분석을 위해 96웰 원형 하단 플레이트로 이송될 수 있다.
7. 유동 세포측정물 염색 및 분석
   1. 보상 통제: 백혈구
      1. 멸균 0.5 M EDTA (pH 8.0)로 미리 채워진 25 G 바늘로 1 mL 주사기를 준비합니다. 예상 혈액 부피당 10% EDTA(1mL 혈액에 대한 EDTA 100 μL).
      2. 심장 천자에 의해 마취하에 혈액을 수집합니다. 혈액을 1.7 mL 튜브로 옮긴 다음 원심분리기는 400 x g에서 10분, 4°C로 전달합니다.
         참고: 마우스가 마취 하에 있는 동안 승인된 동물 프로토콜(예: 자궁 경부 탈구)에 따라 사망을 확인하는 물리적 방법을 사용합니다.
      3. 상체를 흡인합니다. 적혈구의 용액을 위한 암모늄-염화물 칼륨(ACK) 용해 완충제의 1mL에서 펠릿을 재연한다. 얼음에 3 분 - 5 분 동안 배양. 원심분리기 400 x g 5 분, 4 °C. 펠릿이 여전히 빨간색이면 펠릿이 흰색으로 변할 때까지 이 ACK 리시스 버퍼 단계를 반복합니다.
      4. 1 mL FCB및 플레이트 0.5 x 10⁶- 1 x 10^6의 셀당 펠릿을 다시 중단합니다. 96웰 의 라운드 하단 플레이트의 다섯 우물을 준비합니다. 접시를 얼음 위에 놓습니다.
         참고: 루프 발광 내용이 포함된 동일한 96웰 플레이트를 사용합니다(단계 5.6.6 참조).
   2. 유동 세포피 얼룩
      1. 원심 분리기 는 400 x g,4 °C에서 5 분 동안 96 웰 플레이트를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 정제 된 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32의 50 μL로 펠릿을 Fc 블록 (FCB의 100 μL 당 1 μg)으로 재연하십시오. 5 분 동안 인큐베이션 - 얼음에 10 분.
      2. iLoop 발광 함량의 면역 염색: 모든 플루오로크롬-공주 항체(FCB에서 1:50 희석)를 포함하는 혼합물을 준비합니다: 안티 CD45-PerCP, 안티 CD11b-PE 및 반대로 Ly-6G-Alexa Fluor 647. 100 μL의 최종 부피를 위해, 우물 당 조합의 50 μL을 추가합니다.
      3. 보상용 백혈구의 면역염색(FCB의 1:50 희석): FCB 의 50 μL(비염색시, 잘 1), 각 개별 형광소-공주 항체(우물 2 -4), 50 μL의 모든 플루오크롬-컨주 항체(잘 5)를 사용하십시오. 100 μL의 최종 부피.
      4. 빛으로부터 보호되는 얼음에 30분 동안 접시를 배양합니다.
      5. 400 x g,4 °C에서 5 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 FCB의 200 μL로 세척하십시오. 이 세탁 단계를 두 번 반복하십시오.
      6. 혈액 샘플에 FCB 150 μL/웰을 추가합니다.
      7. iLoop 발광 콘텐츠 샘플에 100 μL/웰 FCB를 추가합니다. 그런 다음 50 μL / 형광 계수 구슬의 우물.
   3. 유동 세포측정 분석
      1. CD45 양성 이벤트 및 Ly-6G-/Gr-1 및 CD11b^30의표현을 위한 게이트.
      2. 시료 부피의 100 μL을 정지 조건으로 사용하십시오.
      3. 형광 계수 구슬의 제조업체가 제공한 정보에 따라 iLoop 루멘으로 마이그레이션된 PMN의 절대 수를 계산합니다.
         참고: 데이터는 (1) 루멘^30,34,35,(2) 티슈 그램당 PMN의 총 수와⁽³⁾ 원통의 부피에 대한 공식을 사용하여 mm당 PMN의 수로 제시될 수 있다: V= π(pi) r 2h(부피용 V, 반경에 대한 r 및 h).

결과

일루프 및 pcLoop 모델의 회로도 표현은 각각 도 1과 도 2에묘사됩니다. 해부학 사진은 장세그먼트(도 1B 및 도 2B)의외부화를 포함한 절차의 중요한 단계를 표시하며, 혈액 공급의 최소한의 교란을 허용하는 결찰에 적합한 위치의 식별(도 1C 및 도 2C)및 시약 용액(...

토론

IBD와 같은 병리학 적 조건하에서 장 장벽 기능 및 면역 세포 모집의 장애 조절을 담당하는 메커니즘은 불완전하게 이해됩니다. 여기서, 우리는 ileum 또는 근위 결장의 잘 혈관화된 외부장 세그먼트를 채택하고 장 투과성, 호중구 이주 연구 및 그밖 응용의 평가를 허용하는 강력한 생체 내 murine 모형을 상세히 기술합니다.

iLoop는 살아있는 동물에서 수행되는 비 회복 수술입니다...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs	BD	326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"	BD	305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle	BD	309659
15ml Centrifuge Tube	Corning	14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate	FisherScientific	07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape	FisherScientific	15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)	FST	12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)	FisherScientific	06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes	Thomas Scientific	c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)	Sarstedt	41.1501.105
Moria Fine Scissors	FST	14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)	Falcon	352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant	Dechra	12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)	FST	1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting	HenrySchein	SS694
Student Fine Forceps, Angled	FST	91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle	Millipore Sigma	Z248029
96 Well Cell Culture Plate	Corning	3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	BioWhittaker	10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution	Corning	21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)	BioLegend	127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen	C36950
Dithiotreitol	FisherScientific	BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	R&D Systems	511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000	Sigma	60842-46-8
Isoflurane	Halocarbon	12164-002-25
Leukotriene B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)	BD Pharmingen	557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)	BD Bioscience	553142
Recombinant Murine IFN-γ	Peprotech	315-05
Recombinant Murine TNF-α	Peprotech	315-01A