猪诱导的多能干细胞 （piPSC） 分化为神经祖细胞 （NPC）

摘要

该方案描述了一种来源于猪诱导多能干细胞 （piPSC） 的神经祖细胞的化学分化和培养方法。

摘要

iPSC 衍生的神经元是研究精神疾病神经发生和早期表型变化的 有吸引力的体外 模型，主要是当临床前研究中使用的大多数动物模型（如啮齿动物）无法满足将研究结果转化为临床的标准时。非人灵长类动物、犬科动物和猪被认为是更适合用于生物医学研究和药物开发目的的模型，主要是因为它们在生理、遗传和解剖学上与人类相似。猪模型对转化神经科学特别感兴趣，使安全性和同种异体移植测试成为可能。本文描述了猪 iPSC 的产生及其进一步分化为神经祖细胞 （NPC）。生成的细胞表达 NPC 标志物 Nestin 和 GFAP，经 RT-qPCR 证实，免疫荧光显示 Nestin 、 b-Tubulin III 和 Vimentin 阳性。这些结果显示了大型动物模型的化学抑制剂 体外诱导后 产生 NPC 样细胞的证据，这是再生和转化医学研究的有趣且适当的模型。

引言

尽管许多研究人员旨在更好地了解人类神经系统疾病的细胞机制和病理发展，但对人类使用磁共振成像 （MRI） 等非侵入性技术存在许多限制，并且在大多数情况下不可能应用侵入性技术，例如区域追踪和细胞内记录¹.获得高质量的死后脑组织也具有挑战性，因为供体长时间的痛苦状态可能会影响大脑并干扰研究²。因此，直到今天，在转化研究中已经使用了几十年的动物模型既相关又值得怀疑。特定动物模型的选择正在成为最近实验设计和规划中的一个中心问题，清楚地表明，为了获得一致的结果，选择最合适的模型不仅需要对不同物种的生理学有深入的了解，而且重要的是，需要对研究的具体目标有深入的了解³。

然而，动物模型在屈服人类大脑结构和发育时经常存在局限性，因为它具有一些独特的发育、解剖学、分子和遗传特征。因此，解释和推断从研究中使用的动物收集的数据（例如来自啮齿动物的数据¹）有些困难。

在当今可用的各种动物模型（包括转基因模型）中，一些大型动物被认为非常有价值，例如非人灵长类动物、犬科动物和猪⁴。人类和猪在器官大小方面的生理、遗传和解剖学相似性强调了这些模型在开发诊断和治疗方法中的重要性。特别是，猪模型在转化神经科学中引起了特别的兴趣，使安全性和同种异体移植测试成为可能。它已用于与心血管、肺、胃肠道疾病相关的研究，特别是用于测试新疗法（例如，在干细胞的再生医学研究中^{5， 6}）。

在这种情况下，体外模型，以及更具体地说诱导的多能干细胞 （iPSC） 衍生的神经元，是允许研究精神疾病神经发生和早期表型变化的有吸引力的模型，主要是当临床前研究中使用的大多数动物模型（如啮齿动物）无法满足将研究结果转化为临床的标准时。

iPSC 的使用允许在体外进行疾病建模，特别是通过使用 iPSC 衍生的神经祖细胞 （NPC），使神经科学受益匪浅，因为 NPC 已被证明是体外疾病建模的有趣工具 ^7,8,9。iPSC 已成功从阿尔茨海默病¹⁰、精神分裂症¹¹ 和许多其他疾病（如帕金森病、雷特综合征、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合征和肌萎缩侧索硬化症）患者中产生，由 Mungenast 及其合作者汇编²。临床前动物模型系统也报道了使用 iPSC 衍生的 NPC 作为功能性脊柱移植物，检测到免疫反应最小或没有免疫反应 12,13,14。

在此，描述了猪 iPSC 的产生和进一步化学分化为推定的神经祖细胞（图 1 和图 2）。生成的细胞表达 NPC 标志物 Nestin 和 GFAP，经 RT-qPCR 证实，免疫荧光显示 Nestin 、 β-Tubulin III 和 Vimentin 阳性。这些结果显示了大型动物模型的化学抑制剂体外诱导后产生 NPC 样细胞的证据，这是再生和转化医学研究的重要且适当的模型。

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研究方案

这些实验得到了圣保罗大学动物科学与食品工程学院动物实验伦理委员会的批准（许可证编号：n° 5130110517 和 n°4134290716）。

注：所有涉及细胞培养和孵育的程序均在受控气氛（空气中 38.5 °C 和 20% CO₂ ，最大湿度）中进行。通过与解离试剂孵育 5 分钟进行细胞传代，离心 （300 x g） 后回收细胞。

1. 猪成纤维细胞重编程为 iPSC

1. 实验准备
   1. 除非另有说明，否则制备成纤维细胞和 293 培养基，由 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基 （IMDM） 组成，补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、0.1 mM 非必需氨基酸和 1% 抗生素（青霉素/链霉素）。
   2. 制备由低渗透压 DMEM/F12（针对人胚胎和诱导多能干细胞的生长进行了优化）组成的 iPSC 培养基（重编程培养基），补充有 20% 血清替代品、0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 谷氨酰胺、3.85 μM β-巯基乙醇、10 ng/mL bFGF 和 1% 抗生素。
   3. 需要时，将小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 接种到 T75 培养瓶 （10 mL） 中，以在第二天获得 70-80% 的汇合度（每个 T75 约 6 x 10⁵ ）。第二天，与 200 μL 0.5 mg/mL 丝裂霉素 C 孵育 2 小时 30 分钟（在含有 MEF 的 T75 中加入丝裂霉素，无需事先更换培养基）。
   4. 孵育期后，用解离溶液孵育 5 分钟后回收细胞，并在 6 孔板中以 1x10⁵ 浓度接种到先前涂有明胶的孔中。
   5. 通过在 37 °C 下与 0.1% 明胶溶液孵育 20 分钟（每孔约 1 mL 明胶溶液以覆盖整个孔）来包被孔并立即吸出。然后，去除溶液并更换为培养基（每孔 2 mL）。
2. 转染和慢病毒生产
   1. 在 T75 培养瓶中培养 293 个细胞，直至达到约 90% 汇合。
   2. 解离细胞，并在每个新 T75 培养瓶中接种 5 x 10⁶ 个细胞，无需抗生素。
   3. 第二天，每个培养瓶 （T75） 准备两种用于转染的溶液：1：1.5 mL IMDM（无抗生素，无血清）和适当浓度的每种载体（12 μg OSKM;1.2 μg TAT;1.2 μg REV;1.2 μg hgpm2 和 2.4 μg VSVG_{2°generation，}）;和 2：1.5 mL IMDM（无抗生素、无血清）加 36 μL 脂质转染试剂（或遵照制造商的建议） ¹⁵。
   4. 混合溶液并孵育 15 分钟。
   5. 同时，更换 293 个细胞的培养基，每个培养瓶仅添加 7 mL 补充有 10% FBS 的 IMDM。
   6. 孵育期后，在每个培养瓶中加入 3 mL 脂质转染试剂 + 质粒。6 小时后用 IMDM 10% FBS 替换培养基（可选）。
   7. 在 24、48 和 72 小时时间点收集培养基（完整体积 - 每 T75 10 mL）。用 0.45 mm PVDF 过滤器过滤，并在超速离心前称重以进行平衡。
   8. 以 48,960 x g 离心 1 小时 30 分钟。
   9. 倾倒弃去上清液，并将剩余内容物（约 200 μL）在 4 °C 下孵育 1 小时。
   10. 重悬病毒沉淀，小心翼翼地上下吹打数次，然后分装病毒溶液。
3. 转 导
   1. 在 6 孔板的每孔中接种 2x10⁴ 个成纤维细胞。包括用于分子分析（例如 PCR）和转导对照（例如 GFP 分析）（可选）的孔。
   2. 第二天，去除 1 mL 培养基，加入 1 μL 溴化己二烯碱 （8 μg/mL） 和 50 μL 病毒溶液。
   3. 孵育 3 至 4 小时，然后完全更换培养基 （2 mL）（第 0 天）。
   4. 培养细胞 5 天，每 2 天更换一次培养基。
   5. 如前所述，预先制备 0.1% 明胶包被和 MEF 板，如第 1.1.3 项所述。
   6. 要在重编程培养基中解离细胞并重新铺板细胞，请使用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS） 洗涤孔。去除 PBS。
   7. 每孔加入 1 mL 解离试剂，并将细胞在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   8. 将细胞转移到锥形管中，以 300 x g 的离心速度离心细胞 5 分钟，然后将它们重悬于 1-3 mL 的 iPSC 培养基中。
   9. 使用 Neubauer 腔室或细胞计数器设备对细胞进行计数，并以 1-2 x 10⁴ 的浓度将它们接种到先前的 0.1% 明胶包被和 MEF 覆盖的孔中。
   10. 每 2 天更换一次 iPSC 培养基。
   11. iPSC 集落（第 0 代，P0 传代）将在重编程期的大约 10 天出现。使用 26 G 针手动挑选形态学上典型的集落（圆形边缘和具有高核质比的细胞）以分离集落和周围的 MEF。
   12. 使用 10 或 100 μL 移液器吸头，每个新孔单独转移 1 个菌落，用于克隆培养和推定的 iPSC 细胞系的表征。
4. 猪 iPSC 传代
   1. 手动传代和菌落挑选
      1. 清洁倒置显微镜并将其转移到层流罩中。
      2. 用紫外线 （UV） 对显微镜消毒 15 分钟。
      3. 在集落转移之前，用 PBS 洗涤先前的明胶和 MEF 包被的孔。去除 PBS。
      4. 加入 2 mL iPSC 培养基。
      5. 在将使用的井中找到感兴趣的菌落。
      6. 使用胰岛素注射器针头的斜面，将集落与周围细胞分离。
      7. 如果菌落很小，用 10 μL 移液器上下移液培养基的边界，将其从孔中分离。
      8. 如果它是一个较大的菌落，请用针将其切成几个较小的片段。
      9. 用 10 μL 移液器吸出菌落或菌落的片段。
      10. 将其转移到新井中。
   2. 克隆系的酶促传代
      1. 使用 PBS 洗涤孔。去除 PBS。
      2. 每孔加入 1 mL 解离试剂，并将细胞在 37 °C 下孵育 5 分钟。
      3. 将大约 100 μL 细胞转移到新孔中。该量可能因不同的细胞系而异;因此，强烈建议每天对 Confluency 进行可视化分析。

2. 猪 iPSC 诱导成 NPC

1. 实验准备
   1. 制备神经诱导培养基 （NIM），由 50% Neurobasal 培养基和 50% DMEM/F-12 组成，并补充有 B27-Minus 维生素 A （20 μL/mL）、N2 （10 μL/mL）、1 mM 谷氨酰胺 （10 μL/mL）、青霉素-链霉素 （1 μL/mL）。在 0.22 μm 过滤器中过滤溶液，并添加终浓度分别为 0.1 μM 和 10 μM 的 BMP 信号转导抑制剂 LDN193189 和 ALK 抑制剂 SB431542。
   2. 用 1 mL 基质溶液包被 6 孔板的孔，并在 37 °C 下孵育至少 30 分钟。去除基质溶液并添加 E8 培养基用于 iPSC 培养。
   3. 在诱导方案的第 13 天，制备神经扩增培养基 （NEM），由 50% 神经基础培养基和 50% DMEM/F-12 组成，补充有 B27-Minus 维生素 A （20 μL/mL）、N2 （10 μL/mL）、NEAA （10 μL/mL）、1 mM 谷氨酰胺 （10 μL/mL）、青霉素-链霉素 （1 μL/mL）。在 0.22 μm 过滤器中过滤溶液，并添加 FGF2 和 EGF，使其最终浓度为 10 ng/mL。
2. 诱导方案
   1. 在 iPSC 达到 100% 汇合的前一天，将细胞转移到新孔中（1：1 分裂）。加入 1 mL PBS 洗涤孔。去除 PBS。
   2. 加入 1 mL 的 0.5 mM EDTA，并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
   3. 去除 EDTA 并加入 1 mL E8 培养基。
   4. 轻轻地从孔中洗去细胞，并将内容物转移到先前涂有基质溶液的新孔中。
   5. 第二天，用 PBS 洗涤孔。去除 PBS 并加入 2 mL 的 NIM。
   6. 每天更换诱导培养基，持续 14 天。
   7. 第 14 天，使用 PBS 洗涤孔。去除 PBS。
   8. 每孔加入 1 mL 细胞解离试剂，并将细胞在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   9. 将细胞转移到锥形管中，以 300 x g 的离心力离心细胞 5 分钟，然后重悬于 6 mL NEM 培养基中。
   10. 加入 60 μL （10 μL/mL） 解冻后回收溶液，并将 2 mL 溶液转移至每个基质包被的孔中。
   11. 第二天更换 NEM 培养基，然后每两天更换一次。
       注意：通过诱导方案的每个孔都被认为会产生新的 NPC 线。因此，它们各自的细胞不应混合。

3. 鼻咽癌传代

1. 用 1 mL PBS 充分洗涤。去除 PBS。
2. 加入 1 mL 细胞解离试剂，并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
3. 轻轻洗涤孔中的细胞，并将内容物转移到锥形管中。
4. 将溶液以 300 x g 离心 5 分钟。去除上清液并加入 6 mL 的 NEM。
5. 轻轻匀浆沉淀，并将 2 mL 溶液转移至先前涂有基质溶液的新孔中。

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结果

piPSC 的表征
表征旨在确定重编程细胞多能性的获得。为此，进行了胚状体形成、多能性标志物的免疫荧光染色以及基因表达和自发分化为拟胚体 （EB）。

生成的细胞集落在细胞簇中呈现平坦、紧凑的形态，具有明确的边界，正如 piPSCs^16、17 所预期的那样，与成纤维细胞形态非常不同。它们?...

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讨论

通过该方案，使用 OCT4 、 SOX2 、 c-MYC 和 KLF4 的外源表达对成纤维细胞进行 体外 重编程。重编程的细胞 在体外 维持 20 次以上传代。当这些谱系使用化学抑制剂进行神经元分化时，它们表达神经元祖细胞的标志物 Nestin 和 GFAP，经 RT-qPCR 证实，并通过免疫荧光对 Nestin 、 β-Tubulin III 和 Vimentin 呈阳性。有趣的是，可能是由于用于分化为 NPC 样细胞?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT	Invitrogen	# R70007
6 well plates	Costar	# 3516
anti-B-Tubulin III	abcam	# ab7751
anti-NANOG	abcam	# ab77095
anti-NESTIN	Millipore	# ABD69
anti-OCT4	Santa Cruz biotechnology	# SC8628
anti-SOX2	abcam	# ab97959
anti-SSEA1	Millipore	# MAB4301
anti-TRA1-60	Millipore	# MAB4360
anti-VIMENTIN	abcam	# ab8069
B27-Minus Vitamin A	Life Technologies	# 12587010
DMEM/F-12	Life Technologies	# 11960
donkey anti-goat 488	Invitrogen	#  A11055
EGF	Sigma	# E9644
Fetal Bovine Serum	Gibco	# 10099
FGF2	Peprotech	# 100-18B
GlutaMAX	Gibco	# 35050-061
Glutamine	Gibco	# 25030-081
goat anti-mouse 594	Invitrogen	#  A21044
goat anti-rabbit 488	Invitrogen	# A11008
Hexadimethrine bromide	Sigma Aldrich	# 107689
HighCapacity  kit	Life Technologies	# 4368814
IMDM	Gibco	# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	# 12660-012
Knockout serum replacement	Gibco	# 10828-028
LDN-193189	Sigma-Aldrich	# SML0559
Leukocyte Alkaline Phosphatase kit	Sigma Aldrich	# 86R
Lipofectamine P3000™	Invitrogen	# L3000-015
Matrigel	Corning	# 354277
Mitomycin C	Sigma Aldrich	# M4287-2MG
N2	Life Technologies	# 17502048
Nanodrop ND-1000	Nanodrop Technologies, Inc.
Neurobasal medium	Life Technologies	# 21103049
Non-essential amino-acids	Gibco	# 11140-050
Penicillin-Streptomycin	Gibco	# 15140-122
Revita Cell	Gibco	# A2644501
Rnase out	Life Technologies	# 10777019
SB431542	Stemgent	# 72232
StemPro Accutase	Gibco	# A11105-01
SW28 rotor	Beckman Coulter	# 342207
Trizol	Life Technologies	# 15596026
TrypLE Express	Gibco	# 12604-021
β-mercaptoethanol	Gibco	# 21985-023