Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток свиней (piPSCs) в нейральные клетки-предшественники (NPC)

Резюме

Этот протокол описывает метод химической дифференцировки и культивирования нейральных клеток-предшественников, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток свиней (piPSCs).

Аннотация

Нейроны, полученные из iPSC, являются привлекательными моделями in vitro для изучения нейрогенеза и ранних фенотипических изменений при психических заболеваниях, в основном когда большинство животных моделей, используемых в доклинических исследованиях, таких как грызуны, не могут соответствовать критериям для переноса результатов в клинику. Нечеловекообразные приматы, собаки и свиньи считаются более подходящими моделями для биомедицинских исследований и разработки лекарств, в основном из-за их физиологического, генетического и анатомического сходства с людьми. Модель свиней вызвала особый интерес в трансляционной нейробиологии, что позволяет проводить тестирование безопасности и аллотрансплантации. В данной статье описывается генерация свиных ИПСК и их дальнейшая дифференцировка в нейральные клетки-предшественники (НПК). Сгенерированные клетки экспрессировали NPC-маркеры Nestin и GFAP, подтвержденные методом ОТ-кПЦР, и были положительными на Nestin, b-Tubulin III и Vimentin по данным иммунофлуоресценции. Эти результаты демонстрируют доказательства генерации NPC-подобных клеток после индукции in vitro химическими ингибиторами из большой животной модели, что является интересной и адекватной моделью для исследований в области регенеративной и трансляционной медицины.

Введение

Несмотря на то, что многие исследователи стремятся лучше понять клеточные механизмы и патологическое развитие неврологических заболеваний у людей, существует множество ограничений для использования неинвазивных методов на людях, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), и невозможность в большинстве случаев применения инвазивных методов, таких как отслеживание трактов и внутриклеточная^запись. Также сложно получить посмертную ткань мозга хорошего качества, поскольку длительные агональные состояния доноров могут влиять на мозг и мешать исследованиям². Поэтому существует необходимость в животных моделях, которые уже несколько десятилетий используются в трансляционных исследованиях, и до сих пор вызывают сомнения. Выбор конкретной животной модели становится центральным вопросом в последних исследованиях и планировании экспериментов, что дает понять, что для получения согласованных результатов выбор наиболее подходящей модели требует глубоких знаний не только физиологии различных видов, но и, что немаловажно, конкретных^{целей исследования.}

Тем не менее, животные модели часто сталкиваются с ограничениями при капитуляции структуры и развития человеческого мозга, поскольку он обладает некоторыми уникальными особенностями развития, анатомическими, молекулярными и генетическими особенностями. Таким образом, несколько сложно интерпретировать и экстраполировать данные, собранные от животных, используемых в исследованиях, такие как данные от грызунов¹.

Среди большого разнообразия животных моделей, доступных в настоящее время, включая трансгенные модели, некоторые крупные животные считаются очень ценными, такие как нечеловекообразные приматы, собаки и свиньи^. Физиологическое, генетическое и анатомическое сходство между человеком и свиньей в отношении размера органов подчеркивает важность этих моделей в разработке диагностических и терапевтических подходов. В частности, модель свиней вызвала особый интерес в трансляционной нейробиологии, что позволило проводить тестирование безопасности и аллотрансплантации. Он использовался в исследованиях, связанных с сердечно-сосудистыми, легочными, желудочно-кишечными заболеваниями и, в частности, для тестирования новых методов лечения (например, в исследованиях регенеративной медицины со стволовыми клетками^{5, 6}).

В этом контексте модели in vitro, а точнее нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), являются привлекательными моделями для изучения нейрогенеза и ранних фенотипических изменений при психических заболеваниях, особенно в тех случаях, когда большинство животных моделей, используемых в доклинических исследованиях, таких как грызуны, не могут соответствовать критериям для переноса полученных результатов в клинику.

Использование ИПСК принесло большую пользу нейробиологии, позволив моделировать заболевания in vitro, в частности, с использованием нейронных клеток-предшественников (NPC), полученных из ИПСК (NPC), поскольку NPC оказались интересным инструментом^{для моделирования заболеваний} in vitro^. ИПСК были успешно получены от пациентов с болезнью Альцгеймера¹⁰, шизофренией¹¹ и многими другими заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, синдром Ретта, спинальная мышечная атрофия, синдром Дауна и боковой амиотрофический склероз. Также сообщалось о доклинических моделях животных с использованием NPC, полученных из iPSC, в качестве функциональных спинных трансплантатов с минимальным иммунным ответом или без него 12,13,14.

В данной работе описана генерация свиных ИПСК и дальнейшая химическая дифференцировка в предполагаемые нейронные клетки-предшественники (рис. 1 и рис. 2). Сгенерированные клетки экспрессировали NPC-маркеры Nestin и GFAP, подтвержденные методом ОТ-кПЦР, и были положительными на Nestin, β-Tubulin III и Vimentin методом иммунофлуоресценции. Эти результаты демонстрируют доказательства генерации NPC-подобных клеток после индукции in vitro химическими ингибиторами из большой животной модели, важной и адекватной модели для исследований в области регенеративной и трансляционной медицины.

протокол

Эти эксперименты были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных факультета зоотехнии и пищевой инженерии Университета Сан-Паулу (номера разрешений: n° 5130110517 и n°4134290716).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с использованием клеточного культивирования и инкубации проводятся в контролируемой атмосфере (38,5 °C и 20%_CO2 в воздухе, максимальная влажность). Пассирование клеток проводили путем 5-минутной инкубации с диссоциационным реагентом и восстанавливали клетки после центрифугирования (300 х г).

1. Перепрограммирование фибробластов свиньи в иПСК

1. Подготовка к эксперименту
   1. Приготовьте фибробласты и 293 питательные среды, состоящие из модифицированной среды Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ заменимых аминокислот и 1% антибиотиков (пенициллин/стрептомицин), если не указано иное.
   2. Приготовьте питательную среду для iPSC (перепрограммирующую среду), состоящую из низкоосмоляльного DMEM/F12 (оптимизированного для роста эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека) с добавлением 20% заменителя сыворотки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ глутамина, 3,85 мкМ β-меркаптоэтанола, 10 нг/мл bFGF и 1% антибиотиков.
   3. При необходимости засейте эмбриональные фибробласты мышей (MEF) в колбу T75 (10 мл) для получения 70-80% конфлюенции на следующий день (примерно 6 x 10⁵ на T75). На следующий день инактивируйте путем инкубации через 2 ч 30 мин с 200 мкл 0,5 мг/мл митомицина С (добавьте митомицин в Т75, содержащий MEF, без предварительной смены среды).
   4. После инкубационного периода восстанавливают клетки после инкубации диссоциативным раствором в течение 5 мин и высевают в лунки, предварительно покрытые желатином, в 6-луночный планшет в концентрации 1х10⁵ .
   5. Лунки обмазывают, инкубируя их 0,1% раствором желатина в течение 20 мин при 37 °С (примерно 1 мл раствора желатина на лунку, чтобы покрыть всю лунку) и немедленно аспирируют. Затем удалите раствор и замените его питательной средой (2 мл на лунку).
2. Трансфекция и производство лентивирусов
   1. Культивируют 293 клетки в колбах с культурой T75 до тех пор, пока она не достигнет примерно 90% конфлюенции.
   2. Диссоциировать клетки и затравить 5 x 10⁶ клеток в новой колбе T75 без антибиотиков.
   3. На следующий день приготовьте по два раствора в колбе (Т75) для трансфекции: 1:1,5 мл ИМДМ (без антибиотиков, без сыворотки) с соответствующей концентрацией каждого вектора (12 мкг ОСКМ; 1,2 мкг ТАТ; 1,2 мкг РЕВ; 1,2 мкг hgpm2 и 2,4 мкг VSVG_{2°generation);} и 2: 1,5 мл IMDM (без антибиотиков, без сыворотки) плюс 36 мкл реагента для липофекции (или в соответствии с рекомендациями производителя) ¹⁵.
   4. Смешайте растворы и выдержите в течение 15 минут.
   5. Тем временем замените среду из 293 клеток, добавив всего 7 мл IMDM с добавлением 10% FBS на колбу.
   6. По истечении инкубационного периода добавьте по 3 мл реагента липофекции + плазмиды в каждую колбу. Замените среду на IMDM 10% FBS через 6 ч (по желанию).
   7. Соберите среду (полный объем - 10 мл на Т75) в моментах времени 24, 48 и 72 ч. Отфильтруйте его с помощью фильтра из ПВДФ толщиной 0,45 мм и взвесьте для балансировки перед ультрацентрифугированием.
   8. Центрифуга в течение 1 часа 30 минут в час при давлении 48 960 x g.
   9. Выбросьте надосадочную жидкость, вылив внутрь, и инкубируйте оставшееся содержимое (примерно 200 мкл) в течение 1 ч при 4 °C.
   10. Ресуспендировать вирусную гранулу деликатно пипетируя вверх и вниз несколько раз и аликвотируя вирусный раствор.
3. Трансдукция
   1. Засейте 2х10⁴ фибробласта в лунку 6-луночного планшета. Включите лунки для молекулярного анализа (например, ПЦР) и контроля трансдукции (например, анализа GFP) (необязательно).
   2. На следующий день удалите 1 мл среды и добавьте 1 мкл гексадиметрина бромида (8 мкг/мл) и 50 мкл вирусного раствора.
   3. Инкубировать в течение 3–4 часов, после чего следует полная смена среды (2 мл) (день 0).
   4. Культивируют клетки в течение 5 дней, меняя среду каждые 2 дня.
   5. Предварительно приготовьте пластины, покрытые 0,1% желатиновой оболочкой, и МЭФ, как описано в пункте 1.1.3.
   6. Для диссоциации клеток и репликации клеток в перепрограммируемой среде промывают лунки 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Удалите PBS.
   7. Добавьте 1 мл диссоциационного реагента в лунку и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут.
   8. Перенесите клетки в коническую пробирку и центрифугируйте ячейки на 5 мин при 300 x g и ресуспендируйте их в 1-3 мл питательной среды iPSC.
   9. Подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра или счетчика клеток и засейте их в концентрации 1-2 x 10⁴ в лунки, ранее покрытые желатином 0,1% и покрытые MEF.
   10. Меняйте питательную среду для iPSC каждые 2 дня.
   11. Колонии iPSC (в пассаже 0, P0) появятся примерно через 10 дней периода перепрограммирования. Вручную выберите морфологически типичные колонии (круглые края и клетки с высоким соотношением ядер и цитоплазмы) с помощью иглы 26 G для отделения колонии и окружающих MEF.
   12. Переведите 1 колонию в новую лунку по отдельности с помощью наконечника пипетки объемом 10 или 100 мкл для клонального культивирования и определения характеристик предполагаемых клеточных линий iPSC.
4. Пассирование свинины iPSC
   1. Ручной пассинг и сбор колоний
      1. Очистите и переложите инвертированный микроскоп в ламинарный проточный колпак.
      2. Стерилизовать микроскоп ультрафиолетовым (УФ) излучением в течение 15 минут.
      3. Предварительно покрытые желатином и MEF лунки промойте PBS перед переносом колонии. Удалите PBS.
      4. Добавьте 2 мл среды iPSC.
      5. Найдите интересующую вас колонию в скважине, которая будет использоваться.
      6. С помощью скоса иглы инсулинового шприца отделите колонию от окружающих клеток.
      7. Если колония небольшая, отсоедините ее от лунки, пипетируя среду вверх и вниз по ее границам с помощью пипетки объемом 10 мкл.
      8. Если это более крупная колония, разрежьте ее иглой на несколько более мелких сегментов.
      9. Отсасывайте колонию или фрагменты колонии с помощью пипетки объемом 10 μл.
      10. Переложите его в новую скважину.
   2. Ферментативное пассирование клональных линий
      1. Промойте лунки с помощью PBS. Удалите PBS.
      2. Добавьте 1 мл диссоциационного реагента в лунку и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут.
      3. Перенесите примерно 100 мкл клеток в новую лунку. Это количество может варьироваться в зависимости от линии клеток; Поэтому настоятельно рекомендуется ежедневный визуальный анализ Confluency.

2. Индукция свиных ИПСК в NPC

1. Подготовка к эксперименту
   1. Приготовьте нейроиндукционную среду (NIM), состоящую на 50% из нейробазальной среды и 50% DMEM/F-12 с добавлением витамина B27-Minus A (20 мкл/мл), N2 (10 мкл/мл), 1 мкм глутамина (10 мкл/мл), пенициллин-стрептомицина (1 мкл/мл). Отфильтровать раствор в фильтре 0,22 мкм и добавить SB431542 ингибитор сигнализации BMP LDN193189 и ингибитор ALK в конечной концентрации 0,1 мкМ и 10 мкМ соответственно.
   2. Смажьте лунки из 6 лунок планшетом с 1 мл матричного раствора и инкубируйте при температуре 37 °С не менее 30 минут. Удалите матричный раствор и добавьте среду Е8 для культивирования iPSCs.
   3. На 13-й день протокола индукции приготовьте среду для расширения нейронов (NEM), состоящую на 50% из нейробазальной среды и 50% DMEM/F-12 с добавлением витамина B27-Minus A (20 μL/мл), N2 (10 μL/мл), NEAA (10 μL/мл), 1 mM глутамина (10 μL/мл), пенициллин-стрептомицина (1 μL/мл). Отфильтруйте раствор в фильтре 0,22 мкм и добавьте FGF2 и EGF до конечной концентрации 10 нг/мл.
2. Протокол введения в должность
   1. За день до того, как iPSCs достигнет 100% конфлюенции, перенесите клетки в новую лунку (расщепление 1:1). Промойте лунку, добавив 1 мл PBS. Удалите PBS.
   2. Добавьте 1 мл 0,5 мМ ЭДТА и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут.
   3. Удалите ЭДТА и добавьте 1 мл питательной среды E8.
   4. Аккуратно смойте ячейки из лунки и переложите содержимое в новую лунку, предварительно покрытую матричным раствором.
   5. На следующий день промойте лунки PBS. Удалите PBS и добавьте 2 мл NIM.
   6. Меняйте индукционную среду каждый день в течение 14 дней.
   7. На 14 день промойте лунки с помощью PBS. Удалите PBS.
   8. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток в лунку и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут.
   9. Перенесите ячейки в коническую трубку и центрифугуйте на 5 мин при 300 x g и ресуспендируйте их в 6 мл среды NEM.
   10. Добавьте 60 мкл (10 мкл/мл) раствора для восстановления после размораживания и перелейте по 2 мл раствора в каждую лунку с матричным покрытием.
   11. Меняйте среду NEM на следующий день, а затем каждые два дня.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Считается, что каждая скважина, прошедшая через протокол индукции, дает начало новой линии NPC. Поэтому их соответствующие клетки не следует смешивать.

3. Прохождение NPC

1. Хорошо вымойте 1 мл PBS. Удалите PBS.
2. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут.
3. Аккуратно промойте ячейки лунки и переложите содержимое в коническую трубку.
4. Центрифугируйте раствор в течение 5 минут при 300 x g. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 6 мл NEM.
5. Аккуратно гомогенизируйте гранулу и перелейте 2 мл раствора в новую лунку, предварительно покрытую матричным раствором.

Результаты

Характеристика piPSC
Целью характеризации было определение приобретения плюрипотентности перепрограммированных клеток. С этой целью проводили формирование эмбриоидов, иммунофлуоресцентное окрашивание по маркерам плюрипотентности, а также экспрессию ген...

Обсуждение

С помощью этого протокола фибробласты были перепрограммированы in vitro с использованием экзогенной экспрессии OCT4, SOX2, c-MYC и KLF4. Перепрограммированные клетки поддерживались in vitro в течение более чем 20 пассажей. Когда эти линии подвергались дифференцировке нейр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT	Invitrogen	# R70007
6 well plates	Costar	# 3516
anti-B-Tubulin III	abcam	# ab7751
anti-NANOG	abcam	# ab77095
anti-NESTIN	Millipore	# ABD69
anti-OCT4	Santa Cruz biotechnology	# SC8628
anti-SOX2	abcam	# ab97959
anti-SSEA1	Millipore	# MAB4301
anti-TRA1-60	Millipore	# MAB4360
anti-VIMENTIN	abcam	# ab8069
B27-Minus Vitamin A	Life Technologies	# 12587010
DMEM/F-12	Life Technologies	# 11960
donkey anti-goat 488	Invitrogen	#  A11055
EGF	Sigma	# E9644
Fetal Bovine Serum	Gibco	# 10099
FGF2	Peprotech	# 100-18B
GlutaMAX	Gibco	# 35050-061
Glutamine	Gibco	# 25030-081
goat anti-mouse 594	Invitrogen	#  A21044
goat anti-rabbit 488	Invitrogen	# A11008
Hexadimethrine bromide	Sigma Aldrich	# 107689
HighCapacity  kit	Life Technologies	# 4368814
IMDM	Gibco	# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	# 12660-012
Knockout serum replacement	Gibco	# 10828-028
LDN-193189	Sigma-Aldrich	# SML0559
Leukocyte Alkaline Phosphatase kit	Sigma Aldrich	# 86R
Lipofectamine P3000™	Invitrogen	# L3000-015
Matrigel	Corning	# 354277
Mitomycin C	Sigma Aldrich	# M4287-2MG
N2	Life Technologies	# 17502048
Nanodrop ND-1000	Nanodrop Technologies, Inc.
Neurobasal medium	Life Technologies	# 21103049
Non-essential amino-acids	Gibco	# 11140-050
Penicillin-Streptomycin	Gibco	# 15140-122
Revita Cell	Gibco	# A2644501
Rnase out	Life Technologies	# 10777019
SB431542	Stemgent	# 72232
StemPro Accutase	Gibco	# A11105-01
SW28 rotor	Beckman Coulter	# 342207
Trizol	Life Technologies	# 15596026
TrypLE Express	Gibco	# 12604-021
β-mercaptoethanol	Gibco	# 21985-023