Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas porcinas (piPSC) en células progenitoras neurales (NPC)

Resumen

Este protocolo describe un método para la diferenciación química y el cultivo de células progenitoras neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas porcinas (piPSCs).

Resumen

Las neuronas derivadas de iPSC son modelos in vitro atractivos para estudiar la neurogénesis y los cambios fenotípicos tempranos en las enfermedades mentales, principalmente cuando la mayoría de los modelos animales utilizados en la investigación preclínica, como los roedores, no pueden cumplir con los criterios para trasladar los hallazgos a la clínica. Los primates no humanos, caninos y porcinos se consideran modelos más adecuados para la investigación biomédica y el desarrollo de fármacos, principalmente debido a sus similitudes fisiológicas, genéticas y anatómicas con los humanos. El modelo porcino ha ganado un interés particular en la neurociencia traslacional, lo que permite realizar pruebas de seguridad y alotrasplante. En este trabajo se describe la generación de iPSCs porcinas junto con su posterior diferenciación en células progenitoras neurales (NPCs). Las células generadas expresaron los marcadores NPC Nestin y GFAP, confirmados por RT-qPCR, y fueron positivos para Nestin, b-Tubulin III y Vimentin por inmunofluorescencia. Estos resultados muestran la evidencia de la generación de células tipo NPC tras la inducción in vitro con inhibidores químicos a partir de un modelo animal grande, un modelo interesante y adecuado para la investigación en medicina regenerativa y traslacional.

Introducción

A pesar de que muchos investigadores tienen como objetivo comprender mejor los mecanismos celulares y el desarrollo patológico de las enfermedades neurológicas en humanos, existen muchas limitaciones para el uso de técnicas no invasivas en humanos, como la resonancia magnética (RM), y la imposibilidad, en la mayoría de los casos, de aplicar técnicas invasivas como el trazado del tracto y el registro intracelular¹. También es difícil obtener tejido cerebral post-mortem de buena calidad, ya que los estados agónicos prolongados de los donantes pueden afectar el cerebro e interferir con los estudios². Por lo tanto, existe la necesidad de que los modelos animales, que se han utilizado durante varias décadas en la investigación traslacional, sean relevantes y cuestionables hasta hoy. La elección de un modelo animal en particular se está convirtiendo en una cuestión central en el diseño y la planificación experimental reciente, dejando claro que para obtener resultados consistentes, la selección del modelo más apropiado requiere un conocimiento profundo no solo de la fisiología de las diferentes especies, sino también, lo que es más importante, de los objetivos específicos de la investigación³.

Sin embargo, los modelos animales suelen presentar limitaciones a la hora de capitular la estructura y el desarrollo del cerebro humano, ya que tiene algunas características de desarrollo, anatómicas, moleculares y genéticas únicas. Por lo tanto, es algo difícil interpretar y extrapolar los datos recopilados de los animales utilizados en la investigación, como los datos de los roedores¹.

Entre la gran variedad de modelos animales disponibles hoy en día, incluidos los modelos transgénicos, algunos animales grandes se consideran muy valiosos, como los primates no humanos, los caninos y los porcinos⁴. Las similitudes fisiológicas, genéticas y anatómicas entre los seres humanos y los porcinos en cuanto al tamaño de los órganos enfatizan la importancia de estos modelos en el desarrollo de enfoques diagnósticos y terapéuticos. Especialmente, el modelo porcino ha ganado un interés particular en la neurociencia traslacional, lo que permite realizar pruebas de seguridad y alotrasplante. Se ha utilizado en investigaciones relacionadas con afecciones cardiovasculares, pulmonares, gastrointestinales y, en particular, para probar nuevas terapias (por ejemplo, en estudios de medicina regenerativa con células madre^{5, 6}).

En este contexto, los modelos in vitro, y más concretamente las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), son modelos atractivos para permitir el estudio de la neurogénesis y los cambios fenotípicos tempranos en las enfermedades mentales, principalmente cuando la mayoría de los modelos animales utilizados en la investigación preclínica, como los roedores, no son capaces de cumplir los criterios para trasladar los hallazgos a la clínica.

El uso de iPSCs ha beneficiado enormemente a la neurociencia al permitir el modelado de enfermedades in vitro, particularmente mediante el uso de células progenitoras neurales (NPC) derivadas de iPSCs, ya que las NPCs han demostrado ser una herramienta interesante para el modelado de enfermedades in vitro ^7,8,9. Las iPSC se han generado con éxito a partir de pacientes con enfermedad de Alzheimer¹⁰, esquizofrenia¹¹ y muchas otras enfermedades como la enfermedad de Parkinson, el síndrome de Rett, la atrofia muscular espinal, el síndrome de Down y la esclerosis lateral amiotrófica, según lo recopilado por Mungenast y colaboradores². También se han descrito sistemas de modelos animales preclínicos que utilizan NPC derivadas de iPSC como injertos funcionales de columna vertebral con una respuesta inmunitaria mínima o nula detectada 12,13,14.

En este trabajo, se describe la generación de iPSCs porcinas y su posterior diferenciación química en células progenitoras neurales putativas (Figura 1 y Figura 2). Las células generadas expresaron los marcadores NPC Nestin y GFAP, confirmados por RT-qPCR, y fueron positivos para Nestin, β-Tubulin III y Vimentin por inmunofluorescencia. Estos resultados muestran la evidencia de la generación de células tipo NPC tras la inducción in vitro con inhibidores químicos a partir de un modelo animal grande, un modelo importante y adecuado para la investigación en medicina regenerativa y traslacional.

Protocolo

Estos experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética en Experimentación Animal de la Facultad de Ciencia Animal e Ingeniería de Alimentos de la Universidad de São Paulo (números de permiso: n° 5130110517 y n°4134290716).

NOTA: Todos los procedimientos que involucran cultivo celular e incubaciones se realizan en una atmósfera controlada (38,5 °C y 20% de_CO2 en el aire, humedad máxima). El paso celular se realizó mediante incubación de 5 min con reactivo de disociación y las células se recuperaron después de la centrifugación (300 x g).

1. Reprogramación de fibroblastos porcinos en iPSC

1. Preparación del experimento
   1. Prepare fibroblastos y 293 medios de cultivo que consistan en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y un 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina) a menos que se indique lo contrario.
   2. Prepare el medio de cultivo iPSC (medio de reprogramación) que consiste en DMEM/F12 de baja osmolalidad (optimizado para el crecimiento de células madre embrionarias humanas y pluripotentes inducidas) suplementado con un 20% de reemplazo sérico, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de glutamina, 3,85 μM de β-mercaptoetanol, 10 ng/mL de bFGF y 1% de antibióticos.
   3. Cuando sea necesario, siembre fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en un matraz T75 (10 mL) para obtener un 70-80% de confluencia al día siguiente (aproximadamente 6 x 10⁵ por T75). Al día siguiente, inactivar mediante una incubación de 2 h 30 min con 200 μL de 0,5 mg/mL de mitomicina C (añadir mitomicina en el T75 que contiene MEFs sin cambio previo de medio).
   4. Después del período de incubación, recupere las células después de la incubación con una solución de disociación durante 5 min y siembre en pocillos previamente recubiertos con gelatina en una placa de 6 pocillos a una concentración de 1x10⁵ .
   5. Cubrir los pocillos incubándolos con una solución de gelatina al 0,1% durante 20 min a 37 °C (aproximadamente 1 mL de solución de gelatina por pocillo para cubrir todo el pocillo) e inhalar inmediatamente. Luego, retire la solución y reemplácela con medio de cultivo (2 mL por pocillo).
2. Transfección y producción lentiviral
   1. Cultive 293 células en matraces de cultivo T75 hasta que alcance aproximadamente el 90% de confluencia.
   2. Disociar las células y sembrar 5 x 10⁶ células por nuevo matraz T75 sin antibióticos.
   3. Al día siguiente, prepare dos soluciones por matraz (T75) para la transfección: 1: 1,5 mL de IMDM (sin antibióticos, sin suero) con la concentración adecuada de cada vector (12 μg de OSKM; 1,2 μg de TAT; 1,2 μg de REV; 1,2 μg de hgpm2 y 2,4 μg de VSVG_{2° generación);} y 2: 1,5 mL de IMDM (sin antibióticos, sin suero) más 36 μL de reactivo de lipofección (o según lo recomendado por el fabricante) ¹⁵.
   4. Mezclar las soluciones e incubar durante 15 min.
   5. Mientras tanto, reemplace el medio de las 293 celdas, agregando solo 7 mL de IMDM suplementado con 10% de FBS por matraz.
   6. Después del período de incubación, agregue 3 mL del reactivo de lipofectión + plásmidos en cada matraz. Reemplace el medio con IMDM 10% FBS después de 6 h (opcional).
   7. Recoja el medio (volumen completo: 10 ml por T75) en los puntos de tiempo de 24, 48 y 72 h. Fíltrelo con un filtro de PVDF de 0,45 mm y péselo para equilibrarlo antes de la ultracentrifugación.
   8. Centrífuga durante 1 h 30 min hour a 48.960 x g.
   9. Deseche el sobrenadante vertiendo e incube el contenido restante (aproximadamente 200 μL) durante 1 h a 4 °C.
   10. Vuelva a suspender el pellet viral pipeteando delicadamente hacia arriba y hacia abajo varias veces y la solución viral alícuota.
3. Transducción
   1. Siembra 2x10⁴ fibroblastos por pocillo de una placa de 6 pocillos. Incluye pocillos para análisis moleculares (p. ej., PCR) y controles de transducción (p. ej., análisis GFP) (opcional).
   2. Al día siguiente, retire 1 ml de medio y agregue 1 μl de bromuro de hexadimetrina (8 μg/mL) y 50 μl de la solución viral.
   3. Incubar durante 3 a 4 h, seguido de un cambio completo de medio (2 mL) (Día 0).
   4. Cultivo de células durante 5 días, cambiando de medio cada 2 días.
   5. Prepare previamente placas recubiertas de gelatina al 0,1% y MEF como se describe en el punto 1.1.3.
   6. Para disociar las células y replatear las células en el medio de reprogramación, lave los pocillos con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Eliminar PBS.
   7. Añadir 1 mL de reactivo de disociación por pocillo e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
   8. Transfiera las células a un tubo cónico y centrifugue las células durante 5 min a 300 x g y vuelva a suspenderlas en 1-3 mL de medio de cultivo iPSC.
   9. Cuente las células utilizando una cámara de Neubauer o un equipo de contador de células y siembrórelas a una concentración de 1-2 x 10⁴ en pocillos previamente recubiertos de gelatina y MEF al 0,1%.
   10. Cambie el medio de cultivo iPSC cada 2 días.
   11. Las colonias de iPSC (en el pasaje 0, P0) aparecerán aproximadamente a los 10 días del período de reprogramación. Selección manual de colonias morfológicamente típicas (bordes redondeados y células con una alta relación nuclear-citoplasma) utilizando una aguja de 26 G para separar la colonia y los MEF circundantes.
   12. Transfiera 1 colonia por pocillo nuevo, individualmente, utilizando una punta de pipeta de 10 o 100 μL, para el cultivo clonal y la caracterización de líneas celulares iPSC putativas.
4. Pasaje porcino iPSC
   1. Pase manual y selección de colonias
      1. Limpie y transfiera un microscopio invertido a una campana de flujo laminar.
      2. Esterilice el microscopio con luz ultravioleta (UV) durante 15 min.
      3. Lave los pocillos previamente recubiertos de gelatina y MEF con PBS antes de la transferencia de la colonia. Eliminar PBS.
      4. Añadir 2 mL de medio iPSC.
      5. Localice la colonia de interés en el pozo que se utilizará.
      6. Usando el bisel de una aguja de jeringa de insulina, separe la colonia de las células circundantes.
      7. Si la colonia es pequeña, sepárela del pocillo pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo por sus bordes con una pipeta de 10 μL.
      8. Si se trata de una colonia más grande, córtala en algunos segmentos más pequeños con la aguja.
      9. Aspirar la colonia o fragmentos de la colonia con una pipeta de 10 μL.
      10. Transfiéralo al nuevo pozo.
   2. Conducción enzimática de líneas clonales
      1. Lave los pozos con PBS. Eliminar PBS.
      2. Añadir 1 mL de reactivo de disociación por pocillo e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
      3. Transfiera aproximadamente 100 μL de células a un nuevo pocillo. Esta cantidad puede variar entre las diferentes líneas celulares; Por lo tanto, se recomienda encarecidamente el análisis visual diario de la confluencia.

2. Inducción de iPSCs porcinos en NPCs

1. Preparación del experimento
   1. Prepare el medio de inducción neural (NIM) compuesto por un 50% de medio neurobasal y un 50% de DMEM/F-12 suplementado con B27-Minus vitamina A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), 1 mM de glutamina (10 μL/mL), penicilina-estreptomicina (1 μL/mL). Filtre la solución en un filtro de 0,22 μm y añada el inhibidor de señalización de BMP LDN193189 y el inhibidor de ALK SB431542 a una concentración final de 0,1 μM y 10 μM, respectivamente.
   2. Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos con 1 mL de solución de matriz e incube a 37 °C durante al menos 30 minutos. Retire la solución de matriz y agregue el medio E8 para el cultivo de iPSC.
   3. En el día 13 del protocolo de inducción, prepare un Medio de Expansión Neural (NEM) compuesto por un 50% de medio Neurobasal y un 50% de DMEM/F-12 suplementado con B27-Minus Vitamina A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), NEAA (10 μL/mL), 1 mM de glutamina (10 μL/mL), penicilina-estreptomicina (1 μL/mL). Filtre la solución en un filtro de 0,22 μm y añada FGF2 y EGF hasta alcanzar una concentración final de 10 ng/mL.
2. Protocolo de inducción
   1. El día antes de que las iPSC alcancen el 100% de confluencia, transfiera las células a un nuevo pocillo (división 1:1). Lave el pozo agregando 1 mL de PBS. Eliminar PBS.
   2. Añadir 1 mL de EDTA 0,5 mM e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
   3. Retire el EDTA y agregue 1 mL de medio de cultivo E8.
   4. Lave suavemente las células del pocillo y transfiera el contenido a un nuevo pocillo previamente recubierto con una solución de matriz.
   5. Al día siguiente, lave los pozos con PBS. Retire el PBS y agregue 2 mL de NIM.
   6. Cambie el medio de inducción todos los días durante 14 días.
   7. El día 14, lave los pozos con PBS. Eliminar PBS.
   8. Añadir 1 mL de reactivo de disociación celular por pocillo e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
   9. Transfiera las células a un tubo cónico y centrifugue las celdas durante 5 min a 300 x g y vuelva a suspenderlas en 6 mL de medio NEM.
   10. Agregue 60 μL (10 μL/mL) de una solución de recuperación posterior a la descongelación y transfiera 2 mL de la solución a cada pocillo recubierto de matriz.
   11. Cambie el medio NEM al día siguiente y luego cada dos días.
       NOTA: Se considera que cada pozo que pasó por el protocolo de inducción da lugar a una nueva línea de NPC. Por lo tanto, sus respectivas células no deben mezclarse.

3. Pase de NPC

1. Lavar bien con 1 mL de PBS. Eliminar PBS.
2. Añadir 1 mL de reactivo de disociación celular e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
3. Lave suavemente las celdas del pocillo y transfiera el contenido a un tubo cónico.
4. Centrifugar la solución durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante y agregue 6 mL de NEM.
5. Homogeneizar suavemente el pellet y transferir 2 mL de la solución a un nuevo pocillo previamente recubierto con solución de matriz.

Resultados

Caracterización de piPSC
La caracterización tuvo como objetivo determinar la adquisición de pluripotencia de las células reprogramadas. Para ello, se llevó a cabo la formación de embrioides, la tinción con inmunofluorescencia para marcadores de pluripotencia, y la expresión génica y diferenciación espontánea en cuerpos embrioides (EBs).

Las colonias celulares generadas presentaron una morfología plana y compacta en grupos celula...

Discusión

A través de este protocolo, los fibroblastos fueron reprogramados in vitro utilizando la expresión exógena de OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4. Las células reprogramadas se mantuvieron in vitro durante más de 20 pasajes. Cuando estos linajes se sometieron a la diferenciación neuronal mediante inhibidores químicos, expresaron los marcadores de las células progenitoras neuronales Nestin y GFAP, confirmados por RT-qPCR, y fueron positivos para Nestina, β...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT	Invitrogen	# R70007
6 well plates	Costar	# 3516
anti-B-Tubulin III	abcam	# ab7751
anti-NANOG	abcam	# ab77095
anti-NESTIN	Millipore	# ABD69
anti-OCT4	Santa Cruz biotechnology	# SC8628
anti-SOX2	abcam	# ab97959
anti-SSEA1	Millipore	# MAB4301
anti-TRA1-60	Millipore	# MAB4360
anti-VIMENTIN	abcam	# ab8069
B27-Minus Vitamin A	Life Technologies	# 12587010
DMEM/F-12	Life Technologies	# 11960
donkey anti-goat 488	Invitrogen	#  A11055
EGF	Sigma	# E9644
Fetal Bovine Serum	Gibco	# 10099
FGF2	Peprotech	# 100-18B
GlutaMAX	Gibco	# 35050-061
Glutamine	Gibco	# 25030-081
goat anti-mouse 594	Invitrogen	#  A21044
goat anti-rabbit 488	Invitrogen	# A11008
Hexadimethrine bromide	Sigma Aldrich	# 107689
HighCapacity  kit	Life Technologies	# 4368814
IMDM	Gibco	# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	# 12660-012
Knockout serum replacement	Gibco	# 10828-028
LDN-193189	Sigma-Aldrich	# SML0559
Leukocyte Alkaline Phosphatase kit	Sigma Aldrich	# 86R
Lipofectamine P3000™	Invitrogen	# L3000-015
Matrigel	Corning	# 354277
Mitomycin C	Sigma Aldrich	# M4287-2MG
N2	Life Technologies	# 17502048
Nanodrop ND-1000	Nanodrop Technologies, Inc.
Neurobasal medium	Life Technologies	# 21103049
Non-essential amino-acids	Gibco	# 11140-050
Penicillin-Streptomycin	Gibco	# 15140-122
Revita Cell	Gibco	# A2644501
Rnase out	Life Technologies	# 10777019
SB431542	Stemgent	# 72232
StemPro Accutase	Gibco	# A11105-01
SW28 rotor	Beckman Coulter	# 342207
Trizol	Life Technologies	# 15596026
TrypLE Express	Gibco	# 12604-021
β-mercaptoethanol	Gibco	# 21985-023