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摘要

R 环构成了一类普遍存在的转录驱动的非 B DNA 结构，它们存在于所有基因组中，具体取决于 DNA 序列和拓扑学有利性。近年来，R 环与各种适应性和适应不良作用有关，并与人类疾病背景下的基因组不稳定性有关。因此，许多研究人员对基因组中这些结构的准确定位非常感兴趣。此处描述了 DRIP-seq（DNA：RNA 免疫沉淀，然后进行高通量测序）。这是一种稳健且可重复的技术，允许对 R 环进行准确和半定量的映射。还描述了该方法的最新迭代，其中使用超声处理 （sDRIP-seq） 完成碎裂，这允许对 R 环进行链特异性和高分辨率映射。因此，sDRIP-seq 解决了 DRIP-seq 方法在分辨率和链性方面的一些常见局限性，使其成为 R 环映射的首选方法。

摘要

R 环构成了一类普遍存在的转录驱动的非 B DNA 结构，它们存在于所有基因组中，具体取决于 DNA 序列和拓扑学有利性。近年来，R 环与各种适应性和适应不良作用有关，并与人类疾病背景下的基因组不稳定性有关。因此，许多研究人员对基因组中这些结构的准确定位非常感兴趣。此处描述了 DRIP-seq（DNA：RNA 免疫沉淀，然后进行高通量测序）。这是一种稳健且可重复的技术，允许对 R 环进行准确和半定量的映射。还描述了该方法的最新迭代，其中使用超声处理 （sDRIP-seq） 完成碎裂，这允许对 R 环进行链特异性和高分辨率映射。因此，sDRIP-seq 解决了 DRIP-seq 方法在分辨率和链性方面的一些常见局限性，使其成为 R 环映射的首选方法。

引言

R 环是三链核酸结构，主要在转录过程中形成，新生 RNA 转录本与模板 DNA 链杂交。这导致 RNA：DNA 杂交体的形成，并导致非模板 DNA 链在单链环状状态下发生位移。生化重构 1,2,3,4 和数学建模5 与其他生物物理测量 6,7 相结合，已经确定 R 环更有可能发生在表现出特定有利特性的区域。例如，由于与 DNA 双链体相比，DNA：RNA 杂交体的热力学稳定性更高，因此在鸟嘌呤 （G） 和胞嘧啶 （C） 的分布中表现出链不对称性的区域，使得 RNA 富含 G，这种特性称为正 GC 偏斜，因此在转录时倾向于形成 R 环8。已经进化出正 GC 偏斜的区域，例如许多真核基因 4,9,10,11 的早期部分，在体外和体内容易形成 R 环 3,4,12。负 DNA 超螺旋应力也非常有利于结构形成13,14，因为 R 环可以有效地吸收这种拓扑应力，并使周围的 DNA 纤维恢复到有利的松弛状态 5,15。

从历史上看，R 环结构被认为是 RNA 与 DNA 在转录过程中罕见的自发缠结的结果。然而，DNA：RNA 免疫沉淀 （DRIP） 与高通量 DNA 测序 （DRIP-seq） 相结合的发展允许首次对 R 环进行全基因组定位，并揭示这些结构在人类细胞中比预期的要普遍得多 4,16。R 环出现在哺乳动物基因组中数以万计的保守转录基因热点上，偏爱 GC 偏斜的 CpG 岛与基因的第一个内含子和许多基因的末端区域重叠17。总体而言，R 环在人类细胞中共占据基因组的 3%-5%，与其他生物体（包括酵母、植物、果蝇和小鼠）的测量结果一致 18,19,20,21,22。

对人类细胞中 R 环形成热点的分析表明，这些区域与特定的染色质特征相关23。一般来说，R 环存在于核小体占有率较低和 RNA 聚合酶密度较高的区域。在启动子处，R 环与两种共转录沉积的组蛋白修饰 H3K4me1 和 H3K36me3 的募集增加相关17。在基因末端，R 环与紧密排列的基因相关，这些基因经历有效的转录终止17，与之前的观察结果一致24。R 环还显示参与噬菌体、质粒、线粒体和酵母基因组25、26、27、28、29、30、31 复制起点的 DNA 复制起始。此外，76% 的易 R 环人 CpG 岛启动子作为早期组成型复制起点 32,33,34,35 发挥作用，进一步加强了 R 环和复制起点之间的联系。总的来说，这些研究表明 R 环代表了一种新型的生物信号，它可以以上下文依赖性方式触发特定的生物输出23。

早期，在免疫球蛋白类转换重组过程中，R 环显示在类转换序列上形成 3,36,37。这种编程的 R 环被认为通过引入双链 DNA 断裂来启动类别开关重组38。从那时起，有害的 R 环形成，通常被认为是由过度的 R 环形成引起的，与基因组不稳定性和过程有关，例如超重组、转录-复制碰撞、复制和转录应激（回顾 39,40,41,42,43).因此，改进 R 环结构的映射代表了更好地破译这些结构在健康和疾病中的分布和功能是一项令人兴奋且重要的挑战。

DNA：RNA 免疫沉淀 （DRIP） 依赖于 S9.6 单克隆抗体对 DNA：RNA 杂交体的高亲和力44。DRIP-seq 允许对 R 环形成进行稳健的全基因组分析 4,45。虽然有用，但由于使用限制性内切酶来实现温和的 DNA 片段化，该技术的分辨率有限。此外，DRIP-seq 不提供有关 R 环形成方向性的信息。在这里，我们报道了 DRIP-seq 的一种变体，它允许以链特异性方式以高分辨率映射 R 环。该方法依赖于在免疫沉淀之前进行超声处理对基因组进行片段化，因此该方法称为 sDRIP-seq（超声处理 DNA：RNA 免疫沉淀与高通量测序耦合）（图 1）。超声处理的使用可以提高分辨率并限制在 DRIP-seq 方法中观察到的限制性酶联碎裂偏差46。sDRIP-seq 产生的 R 环图与 DRIP-seq 和先前描述的高分辨率 DRIPc-seq 方法的结果非常一致，其中测序文库由免疫沉淀的 R 环结构的 RNA 链构建45。

面对众多可供选择的方法，用户可能想知道哪种基于 DRIP 的特定方法更适合他们的需求。我们提供以下建议。DRIP-seq 尽管存在局限性，但在技术上是最简单的，并且是此处讨论的所有三种方法中最稳健（产率最高）的;因此，它仍然具有广泛的用途。已经发布了大量 DRIP-seq 数据集，为新数据集提供了有用的比较点。最后，生物信息学分析管道更简单，因为数据不会滞留。建议新用户开始使用 DRIP 磨练他们的 R 环映射技能，然后进行定量聚合酶链反应 （qPCR） 和 DRIP-seq。sDRIP-seq 的技术难度略高：由于超声处理（如下所述），产量略有降低，并且测序文库过程略复杂。然而，搁浅和更高分辨率的增益是无价的。值得注意的是，sDRIP-seq 将捕获双链 RNA：DNA 杂交体和三链 R 环。由于文库构建步骤，DRIP-seq 不会捕获双链 RNA：DNA 杂交体。DRIPc-seq 对技术的要求最高，需要更多的起始材料。作为回报，它提供最高的分辨率和搁浅度。由于测序文库是由 R 环或杂交体的 RNA 部分构建的，因此 DRIPc-seq 可能会受到可能的 RNA 污染，特别是因为 S9.6 对 dsRNA 19,47,48 具有残余亲和力。sDRIP-seq 允许进行链特异性、高分辨率的映射，而无需担心 RNA 污染，因为测序文库来源于 DNA 链。总的来说，这三种方法仍然有用，并且存在不同程度的复杂性和略有不同的注意事项。然而，这三者都产生高度一致的数据集48，并且对 RNase H 预处理高度敏感，这是确保信号特异性的重要控制45,49。值得注意的是，鉴于对测序文库施加的大小选择，小杂交种（估计 <75 bp），例如在滞后链 DNA 复制启动位点（冈崎引物）周围瞬时形成的杂交体将被排除在外。同样，由于所有 DRIP 方法都涉及 DNA 片段化，因此需要负 DNA 超螺旋才能保持稳定性的不稳定 R 环将丢失5。因此，DRIP 方法可能会低估 R 环负载，尤其是对于短的、不稳定的 R 环，最好使用体内方法捕获45,48。值得注意的是，在亚硫酸氢钠处理后，R-loop 也可以以 S9.6 非依赖性方式在单个 DNA 分子上以深度覆盖、高分辨率和链特异性方式进行分析12。此外，使用催化失活的 RNase H1 酶的策略已被用于在体内绘制天然 R 环，突出了主要在暂停的启动子处形成的短而不稳定的 R 环 50,51,52。

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研究方案

以下方案针对在培养物中生长的人 Ntera-2 细胞系进行了优化，但它已经成功地适应了一系列其他人类细胞系（HEK293、K562、HeLa、U2OS）、原代细胞（成纤维细胞、B 细胞）以及其他经过小修饰的生物体（小鼠、果蝇）。

1. 细胞收获和裂解

  1. 培养 Ntera-2 细胞至 75%-85% 汇合。确保最佳细胞计数为 5 至 600 万个细胞，活细胞计数为 >90%，以开始任何 DRIP 程序。
  2. 用 1x PBS 洗涤细胞一次，加入 1.5 mL 胰蛋白酶-EDTA 1x，然后在 37 °C 下孵育 2 分钟，直到细胞从培养皿中解离。
  3. 加入 5 mL 温热培养基并移液充分，将细胞重悬到单细胞悬液中。将内容物转移到新的 15 mL 试管中，并以 300 x g 的速率轻轻沉淀细胞 3 分钟。
  4. 用 5 mL 的 1x PBS 洗涤细胞一次，然后以 300 x g 轻轻沉淀细胞 3 分钟。
  5. 将细胞完全重悬于 1.6 mL 的 TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.5,1 mM EDTA pH 8.0）中。加入 5 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL 储备液）和 50 μL SDS（20% 储备液），轻轻倒置试管 5 次，直到溶液变得粘稠。不要尝试移液溶液，只能倒置混合。
  6. 将试管在 37 °C 下孵育过夜。

2. DNA 提取

  1. 将 DNA 裂解物倒入预离心的 15 mL 高密度锁相凝胶管中，加入 1 体积 （1.6 mL） 的苯酚/氯仿异戊醇 （25：24：1）。轻轻倒置 5 次，并以 1,500 x g 离心 5 分钟。
  2. 将 1/10 体积的 3 M 乙酸钠 （NaOAc） （pH 5.2） 和 2.5 体积的 100% 乙醇加入新的 15 mL 试管中。倒入锁相凝胶管的顶部水相，轻轻倒置，直到 DNA 完全沉淀（最多 10 分钟）。
  3. 使用宽口径 1,000 μL 吸头缠绕 DNA 线，然后转移到干净的 2 mL 试管中，同时注意不要携带残留的上清液。
  4. 加入 1.5 mL 80% 乙醇洗涤 DNA，然后轻轻倒置试管 5 次。孵育 10 分钟。
  5. 重复上一步两次。在洗涤步骤中不要离心。最后一次洗涤后通过移液小心去除尽可能多的乙醇，同时尽量不要干扰 DNA。
  6. 倒置试管时让 DNA 完全风干。此步骤可能需要 30 分钟 -1 小时，具体取决于 DNA 的量。
  7. 直接在 DNA 沉淀上加入 125 μL TE 缓冲液，通过限制性内切酶消化使 DNA 形成片段化，或 100 μL TE 缓冲液，通过超声处理剪切 DNA。在冰上保持 1 小时，然后用大口径 200 μL 吸头吹液几次，轻轻重悬 DNA。在开始碎裂步骤之前，在冰上放置 1 小时。

3. DNA 片段化

注：对于基于限制性内切酶的 DRIP-seq，请遵循步骤 3.1。对于基于超声处理的 DRIP-seq，请跳至步骤 3.2。

  1. 限制性内切酶 （RE） 片段化
    1. 根据供应商的说明，使用 RE 混合物消化重悬的基因组 DNA（非常粘稠）。
      1. 向最终反应中加入 0.1 mM 亚精胺。使用 4-5 种酶的混合物，每种酶 30 U，总体积为 150 μL。
        注：DRIP-seq （HindIII， SspI， EcoRI， BsrGI， XbaI） 4 的初始混合物被开发为产生 5 kb 的平均片段长度。避免对 CpG 甲基化和基因组中备用的 GC 富集区域进行任何干扰。其他鸡尾酒也是可能的16）.这些混合物适用于人类和小鼠基因组，但可以根据需要进行调整。
      2. 将反应混合物在 37 °C 下孵育过夜。
        注：消化后的 DNA 混合物不应再具有粘性。此步骤中任何剩余的粘度都表明消解不完全。
      3. 如果观察到，则额外加入 10 U 每种酶，并在 37 °C 下再孵育 2-4 小时。
        注意：如果用户收获的细胞数量超过此处推荐的细胞，则可能无法消化整个沉淀。
    2. 将过夜消化的 DNA （150 μL） 轻轻移液到预离心的 2 mL 锁相凝胶光管中。加入 100 μL 水和 1 体积 （250 μL） 的苯酚/氯仿异戊醇 （25：24：1）。轻轻倒置 5 次，并以 16,000 x g 的速度旋转 10 分钟。
    3. 将 1.5 μL 糖原、1/10 体积的 3 M NaOAc （pH 5.2） 和 2.5 体积的 100% 乙醇添加到新的 1.5 mL 试管中。从锁相凝胶管中吸取 DNA，倒置 5 次混合。在 -20 °C 下孵育 1 小时。
    4. 在 4 °C 下以 16,000 x g 旋转 35 分钟。 用 200 μL 80% 乙醇洗涤 DNA，并在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟。
    5. 风干沉淀，并向沉淀中加入 50 μL TE 缓冲液。将试管放在冰上 30 分钟，然后轻轻重悬 DNA。
    6. 使用分光光度计测量片段化 DNA 的浓度 （OD260）。
    7. 可选但推荐：将 1 μg 消化的 DNA 上样到 0.8% 琼脂糖凝胶上，并附上大小标记物，以验证消化是否完成。在 100 V 下运行凝胶一小时。
      注：如果不完全，可以添加额外的酶。不完全消化会导致免疫沉淀后分辨率丧失。
    8. 此步骤后，在 37 °C 下用 4 μL 核糖核酸酶 H （RNase H） 处理 10 μg 消化的 DNA 1-2 小时，以确保免疫沉淀时检索的信号来自 DNA：RNA 杂交体。然后，进行 S9.6 免疫沉淀（步骤 4）。
      注：消化的 DNA 可在 -80 °C 下冷冻保存长达一个月，而不会显著降低产量。
  2. 超声处理
    1. 在 0.5 mL 微量离心管中对提取的全部或部分 DNA 进行超声处理，总体积为 100 μL。在超声仪上执行 15-20 个 30 秒开/30 秒关的循环（在 5、10 和 15 个循环后旋转，以确保均匀的超声处理）。
    2. 在分光光度计上测量超声处理 DNA 的浓度 （OD260）。
      注意：在此步骤中，DNA 的粘度应该已经消失。
    3. 运行琼脂糖凝胶以确认超声处理的 DNA 的大小分布 （300-500 bp）。
      注：过度超声处理 DNA 会导致 R 环结构断裂和解离，导致产量显著降低。
    4. 此步骤后，在 37 °C 下用 4 μL RNase H 处理 10 μg 超声处理 DNA 1-2 小时，以确保免疫沉淀时检索的信号来自 DNA：RNA 杂交体。然后，进行 S9.6 免疫沉淀（步骤 4）。

4. S9.6 免疫沉淀

注：无论 DNA 是通过 RE 还是超声处理进行片段化，免疫沉淀步骤都是相似的。

  1. 准备三管，分装 4.4 μg 片段化 DNA，每管终体积为 500 μL TE 缓冲液。从每管中保存 50 μL（体积的 1/10），以备后用作输入 DNA。
  2. 向 450 μL 稀释的 DNA 中加入 50 μL 的 10x 结合缓冲液（100 mM NaPO4 pH 7、1.4 M NaCl、0.5% Triton X-100）和 10 μL 的 S9.6 抗体 （1 mg/mL）。
  3. 在 4 °C 下在迷你管旋转器上以 7-10 rpm 孵育过夜。
  4. 对于每个试管，通过在室温下以 7-10 rpm 的转速在微型旋转器上倒置试管 10 分钟，用 700 μL 的 1x 结合缓冲液洗涤 50 μL 的蛋白质 A/G 琼脂糖珠浆。将珠子以 1,100 x g 离心 1 分钟，然后弃去上清液。重复此步骤一次。
  5. 将步骤 4.3 中的 DNA 添加到 50 μL 珠子中，并在 4 °C 下孵育 2 小时，同时在微型旋转器上以 7-10 rpm 倒置。
  6. 将珠子以 1,100 x g 旋转 1 分钟，然后弃去上清液。
  7. 用 750 μL 的 1x 结合缓冲液在微型旋转器上以 7-10 rpm 倒置 15 分钟来洗涤珠子。以 1,100 x g 离心 1 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
  8. 向磁珠中加入 250 μL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 8、10 mM EDTA pH 8、0.5% SDS）和 7 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL 储备液），并在 55 °C （12 rpm） 下旋转孵育 45 分钟。
  9. 将珠子以 1,100 x g 旋转 1 分钟。将上清液转移至预旋转的 2 mL 锁相凝胶光管中，加入 1 体积 （250 μL） 的苯酚/氯仿异戊醇 （25：24：1）。将试管倒置 5 次，并在室温下以 16,000 x g 离心 10 分钟。
  10. 将 1.5 μL 糖原、1/10 体积的 3M NaOAc （pH 5.2） 和 2.5 体积的 100% 乙醇添加到新的 1.5 mL 试管中。从锁相凝胶管中吸取 DNA，倒置 5 次混合。在 -20 °C 下孵育 1 小时。
  11. 在 4 °C 下以 16,000 x g 旋转 35 分钟。 用 200 μL 80% 乙醇洗涤 DNA，并在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟。
  12. 风干沉淀，并在每个试管中加入 15 μL 10 mM Tris-Cl （pH 8）。将试管放在冰上 20 分钟，然后轻轻重悬。将三个试管的内容物合并为一个试管 （45 μL）。
  13. 使用 5 μL 的 45 μL 重悬 DNA 通过 qPCR 检查 DRIP 效率（参见 代表性结果）。用 10 μL 水稀释 5 μL，每次反应使用 2 μL。

5. 仅对超声处理的 DNA 进行文库前步骤

注：超声处理导致 R 环的置换 ssDNA 链断裂。因此，三链 R 环结构在超声处理后转化为双链 DNA：RNA 杂交体。因此，在文库构建之前，这些 DNA：RNA 杂交体必须转化回双链 DNA。这里采用了第二链合成步骤。已成功使用的另一种方法是进行单链 DNA 连接，然后进行第二链合成53。

  1. 向步骤 4.12 中 40 μL 的 DRIP DNA 中，加入 20 μL 5x 第二链缓冲液（200 mM Tris pH 7、22 mM MgCl2、425 mM KCl）、10 mM dNTP 混合物（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTT 或 dUTP，如果用户计划实现链特异性 DRIP 测序），1 μL 16 mM NAD， 和 32 μL 水。充分混合并在冰上孵育 5 分钟。
  2. 加入 1 μL DNA 聚合酶 I（10 单位）、0.3 μL RNase H（1.6 单位）和 0.5 μL 大肠杆菌 DNA 连接酶。混合并在 16 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 立即使用比率为 1.6 倍的顺磁珠净化反应物。在 40 μL 10 mM Tris-Cl （pH 8） 中洗脱 DNA。

6. 仅针对 RE DNA 的文库前超声处理步骤

注意：DRIP 导致回收长度通常为千碱基的 RE 片段，因此不适合立即构建文库。

  1. 为了减小文库构建材料的大小，请在 0.5 mL 微量离心管中对免疫沉淀的 DNA 进行超声处理。在超声仪上执行 12 个 15 秒开/60 秒关的循环（6 个循环后旋转以确保均匀的超声处理）。继续执行步骤 7。
    注：免疫沉淀材料仍然携带三链 R 环，其对超声处理的反应与侧翼双链 DNA 不同。
  2. 可选步骤：为了均匀 DRIP 曲线，在超声处理前，在 37 °C 下用 1 μL RNase H 和 1x RNase H 缓冲液处理免疫沉淀材料 1 小时。

7. 文库构建

  1. 通过在步骤 4.12（RE 碎裂）或步骤 5.3（超声剪切）中的 40 μL 中加入 5 μL 的 10x 末端修复模块缓冲液、2.5 μL 的 10 mM ATP 和 2.5 μL 的末端修复模块酶（总共 50 μL）来进行末端修复。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。包括 1 μg RE 酶切和超声处理 （DRIP） 或超声处理 （sDRIP） 输入 DNA，以创建与输入 DNA 相对应的对照测序文库。
  2. 使用顺磁珠（1.6 倍比率）净化反应物，并在 34 μL 的 10 mM Tris-Cl （pH 8） 中洗脱。
  3. 通过添加 5 μL 缓冲液 2、10 μL 1 mM dATP 和 1 μL Klenow exo-（总共 50 μL）进行 A 拖尾。充分混合并将混合物在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  4. 使用顺磁珠（1.6 倍比率）净化反应物，并在 12 μL 10 mM Tris-Cl （pH 8） 中洗脱。
  5. 通过添加 15 μL 2x 快速连接缓冲液、1 μL 15 μM 接头和 2 μL 快速连接酶（总共 30 μL）来连接接头。充分混合并在室温下孵育 20 分钟。
  6. 使用顺磁珠（1 倍比率）净化反应物，并在 20 μL 10 mM Tris-Cl （pH 8） 中洗脱。
  7. 如果进行超声剪切并在步骤 5.1 中使用 dUTP，则添加 1.5 μL （1.5 U） 尿嘧啶 N-糖基化酶，并在 37 °C 下孵育 30 分钟，以获得链特异性 DRIP。
  8. PCR 扩增步骤 6.6 或 6.7 中的 10 μL 文库。加入 1 μL PCR 引物 1.0 P5（参见 材料表）、1 μL PCR 引物 2.0 P7（参见 材料表）、15 μL 预混液和 3 μL 水。搅拌均匀。
  9. 在热循环仪中，运行 表 1 所示的程序。
  10. 使用顺磁珠对库进行两步清理。首先使用 0.65 倍的比率去除超过 500 bp 的片段。保留上清液。在上清液上以 1 倍的比例进行，以去除 200 bp 以下的片段。在 12 μL 10 mM Tris-HCl （pH 8） 中洗脱。

8. 质量控制

  1. 要使用 Pfaffl 方法通过 qPCR 检查两个阴性和三个阳性基因座的 R 环富集，请使用步骤 6.10 中的 1 μL 纯化文库。用 10 μL 水稀释 1 μL 文库，每个基因座使用 2 μL。
  2. 使用高灵敏度 DNA 试剂盒检查步骤 6.10 中清理的文库的大小分布。

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结果

DRIP 和 sDRIP 可以通过 qPCR（图 2A）和/或测序（图 2B）进行分析。免疫沉淀步骤后，必须首先通过对阳性和阴性对照基因座以及 RNase H 处理的对照进行 qPCR 来确认实验质量。 表 2 提供了与多种人类细胞系中常用基因座相对应的引物。qPCR 的结果应显示为输入百分比，这对应于给定基因座裂解时携带 R 环的细胞百分比?...

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讨论

这里描述的是两种方案，用于使用 S9.6 抗体在潜在的任何生物体中绘制 R 环结构。DRIP-seq 代表了第一个开发的全基因组 R 环映射技术。这是一种简单、稳健且可重复的技术，允许绘制 R 环沿任何基因组的分布。第二种技术称为 sDRIP-seq，也是稳健且可重复的，但由于包含超声处理步骤和链式测序文库构建方案，因此实现了更高的分辨率和链特异性。这两种技术在免疫沉淀?...

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披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

Chedin 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院 （R01 GM120607） 的资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaCorresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers for library amplificationprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplificationPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntibodyKerafastENH001These three sources are equivalent
S9.6 AntibodyMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntibodyAbcamab234957

参考文献

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
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