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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

R-Schleifen stellen eine vorherrschende Klasse von transkriptionsgesteuerten Nicht-B-DNA-Strukturen dar, die in allen Genomen in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und der topologischen Begünstigung vorkommen. In den letzten Jahren wurden R-Schleifen mit einer Vielzahl von adaptiven und maladaptiven Rollen in Verbindung gebracht und mit genomischer Instabilität im Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die genaue Kartierung dieser Strukturen im Genom ist daher für viele Forscher von großem Interesse. DRIP-seq (DNA:RNA Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung) wird hier beschrieben. Es handelt sich um eine robuste und reproduzierbare Technik, die eine genaue und semiquantitative Kartierung von R-Schleifen ermöglicht. Eine neuere Iteration des Verfahrens wird ebenfalls beschrieben, bei der die Fragmentierung mit Hilfe der Beschallung (sDRIP-seq) durchgeführt wird, die ein strangspezifisches und hochauflösendes Mapping von R-Schleifen ermöglicht. sDRIP-seq adressiert somit einige der üblichen Einschränkungen der DRIP-seq-Methode in Bezug auf Auflösung und Litzenfestigkeit, was sie zu einer Methode der Wahl für das R-Loop-Mapping macht.

Zusammenfassung

R-Schleifen stellen eine vorherrschende Klasse von transkriptionsgesteuerten Nicht-B-DNA-Strukturen dar, die in allen Genomen in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und der topologischen Begünstigung vorkommen. In den letzten Jahren wurden R-Schleifen mit einer Vielzahl von adaptiven und maladaptiven Rollen in Verbindung gebracht und mit genomischer Instabilität im Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die genaue Kartierung dieser Strukturen im Genom ist daher für viele Forscher von großem Interesse. DRIP-seq (DNA:RNA Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung) wird hier beschrieben. Es handelt sich um eine robuste und reproduzierbare Technik, die eine genaue und semiquantitative Kartierung von R-Schleifen ermöglicht. Eine neuere Iteration des Verfahrens wird ebenfalls beschrieben, bei der die Fragmentierung mit Hilfe der Beschallung (sDRIP-seq) durchgeführt wird, die ein strangspezifisches und hochauflösendes Mapping von R-Schleifen ermöglicht. sDRIP-seq adressiert somit einige der üblichen Einschränkungen der DRIP-seq-Methode in Bezug auf Auflösung und Litzenfestigkeit, was sie zu einer Methode der Wahl für das R-Loop-Mapping macht.

Einleitung

R-Schleifen sind dreisträngige Nukleinsäurestrukturen, die sich hauptsächlich während der Transkription bilden, wenn das entstehende RNA-Transkript mit dem Matrizen-DNA-Strang hybridisiert wird. Dies führt zur Bildung eines RNA:DNA-Hybrids und bewirkt die Verschiebung des Nicht-Template-DNA-Strangs in einen einzelsträngigen geloopten Zustand. Die biochemische Rekonstitution 1,2,3,4 und die mathematische Modellierung5 in Kombination mit anderen biophysikalischen Messungen 6,7 haben gezeigt, dass R-Schleifen mit größerer Wahrscheinlichkeit über Regionen auftreten, die spezifische günstige Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel werden Regionen, die eine Strangasymmetrie in der Verteilung von Guaninen (G) und Cytosinen (C) aufweisen, so dass die RNA G-reich ist, eine Eigenschaft, die als positiver GC-Skew bezeichnet wird, aufgrund der höheren thermodynamischen Stabilität des DNA:RNA-Hybriden im Vergleich zum DNA-Duplex bei der Transkription bevorzugt8. Regionen, die eine positive GC-Verzerrung entwickelt haben, wie z. B. die frühen Teile vieler eukaryotischer Gene 4,9,10,11, neigen dazu, in vitro und in vivo R-Schleifen zu bilden 3,4,12. Negativer superhelikaler DNA-Stress begünstigt ebenfalls die Strukturbildung13,14, da R-Schleifen solche topologischen Spannungen effizient absorbieren und die umgebende DNA-Faser in einen günstigen entspannten Zustand zurückversetzen 5,15.

In der Vergangenheit ging man davon aus, dass R-Schleifen-Strukturen aus seltenen, spontanen Verschränkungen von RNA mit DNA während der Transkription resultieren. Die Entwicklung der DNA:RNA-Immunpräzipitation (DRIP) in Verbindung mit der Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (DRIP-seq) ermöglichte jedoch die erste genomweite Kartierung von R-Schleifen und zeigte, dass diese Strukturen in menschlichen Zellen weitaus häufiger vorkommen als erwartet 4,16. R-Schleifen treten über Zehntausende von konservierten, transkribierten, genetischen Hotspots in Säugetiergenomen auf, mit einer Vorliebe für GC-verzerrte CpG-Inseln, die das erste Intron von Genen und die terminalen Regionen zahlreicher Gene überlappen17. Insgesamt nehmen R-Schleifen zusammen 3 % bis 5 % des Genoms in menschlichen Zellen ein, was mit Messungen in anderen Organismen übereinstimmt, einschließlich Hefen, Pflanzen, Fliegen und Mäusen 18,19,20,21,22.

Die Analyse von R-Schleifen-bildenden Hotspots in menschlichen Zellen zeigte, dass solche Regionen mit spezifischen Chromatinsignaturen assoziiertsind 23. R-Schleifen sind im Allgemeinen in Regionen mit geringerer Nukleosomenbelegung und höherer RNA-Polymerase-Dichte zu finden. An Promotoren sind R-Schleifen mit einer erhöhten Rekrutierung von zwei co-transkriptionell abgelagerten Histonmodifikationen, H3K4me1 und H3K36me3, assoziiert17. An den Gentermini assoziieren R-Schleifen mit eng angeordneten Genen, die eine effiziente Transkriptionsterminierung durchlaufen17, was mit früheren Beobachtungenübereinstimmt 24. Es wurde auch gezeigt, dass R-Schleifen an der Initiierung der DNA-Replikation an den Replikationsursprüngen von Bakteriophagen, Plasmiden, Mitochondrien und den Hefegenomen 25,26,27,28,29,30,31 beteiligt sind. Darüber hinaus fungieren 76% der R-Schleifen-anfälligen humanen CpG-Inselpromotoren als frühe, konstitutive Replikationsursprünge 32,33,34,35, was die Verbindungen zwischen R-Schleifen und Replikationsursprüngen weiter verstärkt. Zusammengenommen deuten diese Studien darauf hin, dass R-Schleifen eine neuartige Art von biologischem Signal darstellen, das kontextabhängig spezifische biologische Ausgänge auslösen kann23.

Schon früh wurde gezeigt, dass sich R-Schleifen an Klassenschaltersequenzen während des Prozesses der Immunglobulinklassenschalter-Rekombination bilden 3,36,37. Es wird angenommen, dass solche programmierten R-Schleifen durch die Einführung von doppelsträngigen DNA-Brüchen eine Klassenwechsel-Rekombination initiieren38. Seitdem wird die schädliche R-Schleifenbildung, von der allgemein angenommen wird, dass sie aus einer übermäßigen R-Schleifenbildung resultiert, mit genomischer Instabilität und Prozessen wie Hyperrekombination, Transkriptions-Replikations-Kollisionen, Replikation und transkriptionellem Stress in Verbindung gebracht (für die Überprüfung 39,40,41,42,43). Infolgedessen stellt eine verbesserte Kartierung von R-Loop-Strukturen eine spannende und wesentliche Herausforderung dar, um die Verteilung und Funktion dieser Strukturen in Gesundheit und Krankheit besser zu entschlüsseln.

Die DNA:RNA-Immunpräzipitation (DRIP) beruht auf einer hohen Affinität des monoklonalen Antikörpers S9.6 für DNA:RNA-Hybride44. DRIP-seq ermöglicht ein robustes genomweites Profiling der R-Loop-Bildung 4,45. Diese Technik ist zwar nützlich, hat aber eine begrenzte Auflösung, da Restriktionsenzyme verwendet werden, um eine sanfte DNA-Fragmentierung zu erreichen. Darüber hinaus liefert DRIP-seq keine Informationen über die Richtungsabhängigkeit der R-Loop-Bildung. Hier berichten wir über eine Variante von DRIP-seq, die es ermöglicht, R-Schleifen mit hoher Auflösung auf strangspezifische Weise zu kartieren. Diese Methode beruht auf Beschallung, um das Genom vor der Immunpräzipitation zu fragmentieren, und wird daher als sDRIP-seq (sonication DNA:RNA immunoprecipitation coupled with high throughput sequencing) bezeichnet (Abbildung 1). Der Einsatz von Ultraschall ermöglicht eine höhere Auflösung und begrenzt die bei DRIP-seq-Ansätzen beobachteten Restriktionsverzerrungen der enzymgebundenen Fragmentierung46. sDRIP-seq erzeugt R-Loop-Karten, die in starker Übereinstimmung mit den Ergebnissen sowohl von DRIP-seq als auch von der zuvor beschriebenen hochauflösenden DRIPc-seq-Methode sind, bei der Sequenzierungsbibliotheken aus den RNA-Strängen immunpräzipitierter R-Loop-Strukturen aufgebaut werden45.

Angesichts einer Fülle von Methoden, aus denen Sie wählen können, fragen sich die Benutzer möglicherweise, welcher spezielle DRIP-basierte Ansatz für ihre Bedürfnisse vorzuziehen ist. Wir bieten die folgenden Ratschläge an. DRIP-seq ist trotz seiner Einschränkungen technisch am einfachsten und die robusteste (höchste Ausbeute) aller drei hier besprochenen Methoden; Es bleibt also im Großen und Ganzen nützlich. Es wurden zahlreiche DRIP-seq-Datensätze veröffentlicht, die einen nützlichen Vergleichspunkt für neue Datensätze bieten. Schließlich ist die bioinformatische Analysepipeline einfacher, da die Daten nicht gestrandet sind. Es wird empfohlen, dass neue Benutzer damit beginnen, ihre R-Loop-Mapping-Fähigkeiten mit DRIP zu verbessern, gefolgt von quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und DRIP-seq. sDRIP-seq stellt einen etwas höheren technischen Schwierigkeitsgrad dar: Die Ausbeuten sind aufgrund der Beschallung leicht reduziert (siehe unten) und der Prozess der Sequenzierungsbibliothek ist etwas komplexer. Dennoch ist der Gewinn durch Strandedness und höhere Auflösung von unschätzbarem Wert. Es wird darauf hingewiesen, dass sDRIP-seq sowohl zweisträngige RNA:DNA-Hybride als auch dreisträngige R-Schleifen erfasst. Aufgrund der Aufbauschritte der Bibliothek wird DRIP-seq keine zweisträngigen RNA:DNA-Hybride erfassen. DRIPc-seq ist technisch anspruchsvollste und erfordert eine höhere Menge an Ausgangsmaterialien. Dafür bietet es die höchste Auflösung und Verseilung. Da Sequenzierungsbibliotheken aus dem RNA-Anteil von R-Schleifen oder Hybriden aufgebaut sind, kann DRIPc-seq unter einer möglichen RNA-Kontamination leiden, zumal S9.6 eine Restaffinität für dsRNA 19,47,48 besitzt. sDRIP-seq ermöglicht ein strangspezifisches, hochauflösendes Mapping, ohne sich Gedanken über RNA-Kontaminationen machen zu müssen, da Sequenzierungsbibliotheken von DNA-Strängen abgeleitet werden. Insgesamt sind diese drei Methoden nach wie vor nützlich und weisen unterschiedliche Komplexitätsgrade und leicht unterschiedliche Vorbehalte auf. Alle drei produzieren jedoch hochkongruente Datensätze48 und sind hochsensitiv gegenüber der RNase H-Vorbehandlung, die eine wesentliche Kontrolle zur Sicherstellung der Signalspezifität darstellt45,49. Es wird darauf hingewiesen, dass angesichts der Größenauswahl, die den Sequenzierungsbibliotheken auferlegt wird, kleine Hybriden (schätzungsweise <75 bp), wie z. B. solche, die sich vorübergehend um nachlaufende DNA-Replikations-Priming-Stellen (Okazaki-Primer) bilden, ausgeschlossen werden. Da alle DRIP-Methoden eine DNA-Fragmentierung beinhalten, gehen instabile R-Schleifen, die für ihre Stabilität ein negatives DNA-Supercoiling erfordern, verloren 5. Daher könnten DRIP-Ansätze die R-Loop-Lasten unterschätzen, insbesondere für kurze, instabile R-Loops, die am besten mit in vivo-Ansätzen erfasst werden können45,48. Es wird darauf hingewiesen, dass R-Schleifen auch in einer S9.6-unabhängigen Weise bei tiefer Abdeckung, hoher Auflösung und in einer strangspezifischen Weise an einzelnen DNA-Molekülen nach einer Natriumbisulfit-Behandlung profiliert werden können12. Darüber hinaus wurden Strategien unter Verwendung eines katalytisch inaktiven RNase H1-Enzyms eingesetzt, um native R-Schleifen in vivo zu kartieren, wobei kurze, instabile R-Schleifen hervorgehoben wurden, die sich hauptsächlich an pausierten Promotorenbilden 50,51,52.

Protokoll

Das folgende Protokoll ist für die in Kultur gezüchtete humane Ntera-2-Zelllinie optimiert, wurde aber erfolgreich ohne Modifikation an eine Reihe anderer humaner Zelllinien (HEK293, K562, HeLa, U2OS), Primärzellen (Fibroblasten, B-Zellen) sowie an andere Organismen mit kleinen Modifikationen (Mäuse, Fliegen) angepasst.

1. Zellernte und Lyse

  1. Kultivieren Sie Ntera-2-Zellen auf eine Konfluenz von 75 % bis 85 %. Stellen Sie sicher, dass die optimale Zellzahl 5 bis 6 Millionen Zellen mit einer lebensfähigen Anzahl von >90 % beträgt, um ein DRIP-Verfahren zu starten.
  2. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS, fügen Sie 1x 1,5 ml Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie dann 2 Minuten bei 37 °C, bis sich die Zellen von der Schale lösen.
  3. Fügen Sie 5 ml warmes Medium hinzu und pipettieren Sie es gut, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu resuspendieren. Übertragen Sie den Inhalt in ein neues 15 mL Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen vorsichtig bei 300 x g für 3 min.
  4. Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL 1x PBS und pelletieren Sie die Zellen vorsichtig bei 300 x g für 3 min.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen vollständig in 1,6 mL TE-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Fügen Sie 5 μl Proteinase K (20 mg/ml Stammlösung) und 50 μl SDS (20% ige Stammlösung) hinzu und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig fünfmal um, bis die Lösung viskos wird. Versuchen Sie nicht, die Lösung zu pipettieren, sondern nur durch Inversion zu mischen.
  6. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 °C.

2. DNA-Extraktion

  1. Gießen Sie das DNA-Lysat in ein vorgesponnenes 15-ml-Phasenlock-Gelröhrchen mit hoher Dichte und fügen Sie 1 Volumen (1,6 ml) Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu. Fünfmal vorsichtig umdrehen und 5 min bei 1.500 x g herunterschleudern.
  2. Geben Sie 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100 % Ethanol in ein neues 15 ml-Röhrchen. Gießen Sie die obere wässrige Phase aus dem Phase-Lock-Gelröhrchen ein und invertieren Sie vorsichtig, bis die DNA vollständig ausgefällt ist (bis zu 10 Minuten).
  3. Spulen Sie die DNA-Fäden mit einer 1.000-μl-Spitze mit breiter Öffnung auf und übertragen Sie sie in ein sauberes 2-ml-Röhrchen, wobei Sie darauf achten, dass der Restüberstand nicht mitgenommen wird.
  4. Waschen Sie die DNA, indem Sie 1,5 ml 80%iges Ethanol hinzufügen und das Röhrchen fünfmal vorsichtig umdrehen. 10 Min. inkubieren.
  5. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt zweimal. Zentrifugieren Sie nicht während der Waschschritte. Entfernen Sie vorsichtig so viel Ethanol wie möglich, indem Sie nach dem letzten Waschen pipettieren und dabei versuchen, die DNA nicht zu stören.
  6. Lassen Sie die DNA vollständig an der Luft trocknen, während Sie das Röhrchen umdrehen. Dieser Schritt kann je nach DNA-Menge 30 min -1 h dauern.
  7. Geben Sie 125 μl TE-Puffer direkt auf das DNA-Pellet, um die DNA durch Restriktionsenzymverdau zu fragmentieren, oder 100 μl TE-Puffer, um die DNA durch Ultraschall zu scheren. Lassen Sie die DNA 1 Stunde lang auf Eis und resuspendieren Sie sie vorsichtig, indem Sie einige Male mit einer 200-μl-Spitze mit breiter Bohrung pipettieren. 1 Stunde auf Eis liegen lassen, bevor Sie mit dem Fragmentierungsschritt beginnen.

3. DNA-Fragmentierung

HINWEIS: Für Restriktionsenzym-basiertes DRIP-seq befolgen Sie Schritt 3.1. Für beschallungsbasiertes DRIP-seq fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.

  1. Fragmentierung des Restriktionsenzyms (RE)
    1. Verdauen Sie die resuspendierte genomische DNA (sehr viskos) mit einem Cocktail aus REs gemäß den Anweisungen des Lieferanten.
      1. Fügen Sie 0,1 mM Spermidin zur Endreaktion hinzu. Verwenden Sie einen Cocktail aus 4-5 Enzymen mit 30 U von jedem Enzym in einem Gesamtvolumen von 150 μL.
        HINWEIS: Der erste Cocktail für DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 wurde entwickelt, um eine durchschnittliche Fragmentlänge von 5 Kilobasen zu erzeugen. Vermeiden Sie jegliche Interferenz mit der CpG-Methylierung und schonen Sie GC-reiche Regionen des Genoms. Andere Cocktails sind auch möglich16). Diese Cocktails sind sowohl für das Genom von Menschen als auch von Mäusen geeignet, können aber je nach Bedarf angepasst werden.
      2. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 37 °C inkubiert.
        HINWEIS: Das DNA-Gemisch nach dem Verdau sollte nicht mehr zähflüssig sein. Jede verbleibende Viskosität in diesem Schritt ist ein Hinweis auf einen unvollständigen Aufschluss.
      3. Falls beobachtet, fügen Sie weitere 10 U von jedem Enzym hinzu und inkubieren Sie weitere 2-4 Stunden bei 37 °C.
        HINWEIS: Benutzer verdauen möglicherweise nicht das gesamte Pellet, wenn sie mehr Zellen als hier empfohlen geerntet haben.
    2. Pipettieren Sie die über Nacht verdaute DNA (150 μl) vorsichtig in ein vorgesponnenes 2-ml-Phase-Lock-Gel-Lichtröhrchen. 100 μl Wasser und ein Volumen (250 μl) Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) zugeben. Fünfmal vorsichtig invertieren und 10 min lang bei 16.000 x g herunterschleudern.
    3. Geben Sie 1,5 μl Glykogen, 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100 % Ethanol in ein neues 1,5 ml-Röhrchen. Pipettieren Sie die DNA aus dem Phase-Lock-Gelröhrchen und mischen Sie durch fünfmaliges Umdrehen. 1 h bei -20 °C inkubieren.
    4. Bei 16.000 x g für 35 min bei 4 °C schleudern. Die DNA mit 200 μl 80%igem Ethanol waschen und bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C schleudern.
    5. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und fügen Sie dem Pellet 50 μl TE-Puffer hinzu. Lassen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis und resuspendieren Sie die DNA vorsichtig.
    6. Messen Sie die Konzentration (OD260) der fragmentierten DNA mit einem Spektralphotometer.
    7. Optional, aber empfohlen: Laden Sie 1 μg verdaute DNA auf ein 0,8%iges Agarosegel zusammen mit einem Größenmarker, um zu überprüfen, ob der Verdau abgeschlossen ist. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang bei 100 V laufen.
      HINWEIS: Wenn unvollständig, kann zusätzliches Enzym hinzugefügt werden. Eine unvollständige Verdauung kann nach Immunpräzipitation zum Verlust der Auflösung führen.
    8. Nach diesem Schritt werden 10 μg verdaute DNA 1-2 h lang bei 37 °C mit 4 μl Ribonuklease H (RNase H) behandelt, um sicherzustellen, dass das bei der Immunpräzipitation zurückgewonnene Signal von DNA:RNA-Hybriden abgeleitet wird. Fahren Sie dann mit der Immunpräzipitation S9.6 (Schritt 4) fort.
      HINWEIS: Die verdauten DNAs können bis zu einem Monat lang bei -80 °C eingefroren werden, ohne dass es zu nennenswerten Ertragsverlusten kommt.
  2. Sonorisierung
    1. Beschallen Sie die gesamte oder einen Teil der extrahierten DNA in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Gesamtvolumen von 100 μl. Führen Sie 15-20 Zyklen von 30 s EIN / 30 s AUS an einem Ultraschallgerät durch (Schleudern nach 5, 10 und 15 Zyklen, um eine homogene Beschallung zu gewährleisten).
    2. Messen Sie die Konzentration (OD260) der beschallten DNA mit einem Spektralphotometer.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt sollte die Viskosität der DNA verschwunden sein.
    3. Führen Sie ein Agarose-Gel durch, um die Größenverteilung der beschallten DNA (300-500 bp) zu bestätigen.
      HINWEIS: Eine Überbeschallung der DNA kann zu einer erheblichen Verringerung der Ausbeute führen, die durch Bruch und Dissoziation von R-Loop-Strukturen entsteht.
    4. Nach diesem Schritt werden 10 μg beschallte DNA 1-2 h lang bei 37 °C mit 4 μl RNase H behandelt, um sicherzustellen, dass das bei der Immunpräzipitation zurückgewonnene Signal von DNA:RNA-Hybriden stammt. Fahren Sie dann mit der Immunpräzipitation S9.6 (Schritt 4) fort.

4. S9.6 Immunpräzipitation

HINWEIS: Die Schritte der Immunpräzipitation sind ähnlich, unabhängig davon, ob die DNA durch REs oder Ultraschall fragmentiert wurde.

  1. Bereiten Sie drei Röhrchen vor und aliquotieren Sie 4,4 μg fragmentierte DNA in einem Endvolumen von 500 μl TE-Puffer pro Röhrchen. Sparen Sie 50 μl (1/10 des Volumens) aus jedem Röhrchen, um es später als Eingangs-DNA zu verwenden.
  2. Geben Sie 50 μl 10x Bindungspuffer (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5 % Triton X-100) und 10 μl S9,6-Antikörper (1 mg/ml) zu den 450 μl der verdünnten DNA.
  3. Über Nacht bei 4 °C auf einem Mini-Röhrenrotator bei 7-10 U/min inkubieren.
  4. Waschen Sie für jedes Röhrchen 50 μl Protein A/G Agarose-Bead-Slurry mit 700 μl 1x Bindungspuffer, indem Sie die Röhrchen auf einem Mini-Rotator bei 7-10 U/min bei Raumtemperatur für 10 min invertieren. Die Kügelchen 1.100 x g für 1 min abdrehen und den Überstand wegwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  5. Die DNA aus Schritt 4.3 zu den 50 μl Kügelchen geben und 2 h bei 4 °C inkubieren, während sie bei 7-10 U/min auf einem Mini-Rotator invertieren.
  6. Die Kügelchen 1 Minute lang bei 1.100 x g schleudern und den Überstand wegwerfen.
  7. Waschen Sie die Kügelchen mit 750 μL 1x Bindungspuffer, indem Sie sie bei 7-10 U/min auf einem Mini-Rotator für 15 min invertieren. Schleudern Sie 1 Minute lang bei 1.100 x g herunter und werfen Sie den Überstand weg. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  8. Geben Sie 250 μl des Elutionspuffers (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5 % SDS) und 7 μl Proteinase K (20 mg/mL Stamm) zu den Beads und inkubieren Sie mit Rotation bei 55 °C (12 U/min) für 45 min.
  9. Die Perlen 1 Minute lang bei 1.100 x g runterdrehen. Den Überstand in ein vorgesponnenes 2-ml-Phasenlock-Gel-Lichtröhrchen geben und ein Volumen (250 μl) Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzufügen. Die Röhrchen fünfmal umdrehen und 10 min bei 16.000 x g bei Raumtemperatur herunterschleudern.
  10. Geben Sie 1,5 μl Glykogen, 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100 % Ethanol in ein neues 1,5 ml-Röhrchen. Pipettieren Sie die DNA aus dem Phase-Lock-Gelröhrchen und mischen Sie durch fünfmaliges Umdrehen. 1 h bei -20 °C inkubieren.
  11. Bei 16.000 x g für 35 min bei 4 °C schleudern. Die DNA mit 200 μl 80%igem Ethanol waschen und bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C schleudern.
  12. Trocknen Sie die Pellets an der Luft und geben Sie 15 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8) in jedes Röhrchen. Lassen Sie die Röhren 20 Minuten auf Eis und suspendieren Sie sie vorsichtig wieder. Kombinieren Sie den Inhalt der drei Röhrchen in einem Röhrchen (45 μL).
  13. Überprüfen Sie die DRIP-Effizienz durch qPCR mit 5 μl der 45 μl resuspendierten DNA (siehe Repräsentative Ergebnisse). Verdünnen Sie die 5 μl in 10 μl Wasser und verwenden Sie 2 μl pro Reaktion.

5. Schritt vor der Bibliothek nur für beschallte DNA

HINWEIS: Die Beschallung führt dazu, dass der verschobene ssDNA-Strang der R-Schleifen bricht. So werden dreisträngige R-Loop-Strukturen bei der Beschallung in zweisträngige DNA:RNA-Hybride umgewandelt. Infolgedessen müssen diese DNA:RNA-Hybriden vor dem Aufbau der Bibliothek wieder in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Hier kommt ein zweiter Schritt der Strangsynthese zum Einsatz. Ein alternativer Ansatz, der erfolgreich angewandt wurde, besteht darin, stattdessen eine einzelsträngige DNA-Ligation durchzuführen, gefolgt von einer zweiten Strangsynthese53.

  1. Zu den 40 μl DRIP-DNA aus Schritt 4.12 werden 20 μl 5x zweiter Strangpuffer (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und dTTT oder dUTP, wenn der Benutzer eine strangspezifische DRIP-Sequenzierung plant), 1 μL 16 mM NAD hinzugefügt, und 32 μL Wasser. Gut mischen und 5 min auf Eis inkubieren.
  2. Fügen Sie 1 μl DNA-Polymerase I (10 Einheiten), 0,3 μl RNase H (1,6 Einheiten) und 0,5 μl E . coli-DNA-Ligase hinzu. Mischen und bei 16 °C 30 min inkubieren.
  3. Reinigen Sie die Reaktion sofort mit paramagnetischen Kügelchen mit einem Verhältnis von 1,6x. Eluieren Sie die DNA in 40 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).

6. Beschallungsschritt vor der Bibliothek nur für RE-DNA

HINWEIS: DRIP führt zur Rückgewinnung von RE-Fragmenten, die oft kilobasenlang sind und daher nicht für den sofortigen Bibliotheksaufbau geeignet sind.

  1. Um die Größe des Materials für den Bibliotheksaufbau zu reduzieren, beschallen Sie die immunpräzipitierte DNA in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie 12 Zyklen von 15 s EIN / 60 s AUS auf einem Ultraschallgerät durch (Schleudern nach sechs Zyklen, um eine homogene Beschallung zu gewährleisten). Fahren Sie mit Schritt 7 fort.
    HINWEIS: Das immunpräzipitierte Material trägt immer noch die dreisträngigen R-Schleifen, die anders auf die Beschallung reagieren als die flankierende doppelsträngige DNA.
  2. Optionaler Schritt: Um die DRIP-Profile auszugleichen, behandeln Sie das immunpräzipitierte Material vor der Beschallung 1 h lang mit 1 μl RNase H in 1x RNase H-Puffer bei 37 °C.

7. Bau der Bibliothek

  1. Führen Sie eine Endreparatur durch, indem Sie zu den 40 μl aus Schritt 4.12 (RE-Fragmentierung) oder Schritt 5.3 (Ultraschallscherung) 5 μl 10x Puffer des Endreparaturmoduls, 2,5 μl 10 mM ATP und 2,5 μl Enzym des Endreparaturmoduls (insgesamt 50 μl) hinzufügen. Gut mischen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 1 μg RE-verdaute und beschallte (DRIP) oder beschallte (sDRIP) Eingangs-DNA hinzu, um Kontrollsequenzierungsbibliotheken zu erstellen, die der Eingangs-DNA entsprechen.
  2. Reinigen Sie die Reaktion mit paramagnetischen Kügelchen (1,6-faches Verhältnis) und eluieren Sie sie in 34 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  3. Führen Sie ein A-Tailing durch, indem Sie 5 μl Puffer 2, 10 μl 1 mM dATP und 1 μl Klenow-Exo- (insgesamt 50 μl) hinzufügen. Gut vermischen und die Mischung 30 min bei 37 °C inkubieren.
  4. Reinigen Sie die Reaktion mit paramagnetischen Kügelchen (1,6-faches Verhältnis) und eluieren Sie in 12 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  5. Ligate-Adapter durch Zugabe von 15 μl 2x Quick Ligation Puffer, 1 μl 15 μM Adapter und 2 μl Quick Ligase (insgesamt 30 μl). Gut mischen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Reinigen Sie die Reaktion mit paramagnetischen Beads (1x-Verhältnis) und eluieren Sie in 20 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  7. Wenn in Schritt 5.1 eine Ultraschallscherung durchgeführt und dUTP verwendet wurde, fügen Sie 1,5 μl (1,5 U) Uracil N-Glykosylase hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um einen strangspezifischen DRIP zu erhalten.
  8. PCR-Amplifikation von 10 μl der Bibliothek aus Schritt 6.6 oder 6.7. Fügen Sie 1 μl PCR-Primer 1.0 P5 (siehe Materialtabelle), 1 μl PCR-Primer 2.0 P7 (siehe Materialtabelle), 15 μl Mastermix und 3 μl Wasser hinzu. Gut mischen.
  9. Führen Sie das Programm in einem Thermocycler wie in Tabelle 1 gezeigt aus.
  10. Fahren Sie mit einer zweistufigen Bereinigung der Bibliothek mit paramagnetischen Kügelchen fort. Verwenden Sie zunächst ein Verhältnis von 0,65x, um Fragmente über 500 bp zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand auf. Fahren Sie mit einem 1x-Verhältnis am Überstand fort, um Fragmente unter 200 bp zu entfernen. Eluieren Sie in 12 μL von 10 mM Tris-HCl (pH 8).

8. Qualitätskontrolle

  1. Um R-Loop-Anreicherungen mit qPCR an zwei negativen und drei positiven Loci mit der Pfaffl-Methode zu überprüfen, verwenden Sie 1 μl der Clean-up-Bibliothek aus Schritt 6.10. 1 μl der Bibliothek in 10 μl Wasser verdünnen und 2 μl pro Locus verwenden.
  2. Überprüfen Sie die Größenverteilung der bereinigten Bibliothek aus Schritt 6.10 mit einem hochempfindlichen DNA-Kit.

Ergebnisse

Sowohl DRIP als auch sDRIP können durch qPCR (Abbildung 2A) und/oder Sequenzierung (Abbildung 2B) analysiert werden. Nach dem Immunpräzipitationsschritt muss die Qualität des Experiments zunächst durch qPCR an positiven und negativen Kontrollloci sowie mit RNase H-behandelten Kontrollen bestätigt werden. Primer, die häufig verwendeten Loci in mehreren menschlichen Zelllinien entsprechen, sind in Tabelle 2 ...

Diskussion

Hier werden zwei Protokolle beschrieben, um R-Loop-Strukturen in potenziell jedem Organismus unter Verwendung des S9.6-Antikörpers zu kartieren. DRIP-seq ist die erste entwickelte genomweite R-Loop-Kartierungstechnik. Es handelt sich um eine einfache, robuste und reproduzierbare Technik, die es ermöglicht, die Verteilung von R-Schleifen entlang eines beliebigen Genoms abzubilden. Die zweite Technik, sDRIP-seq genannt, ist ebenfalls robust und reproduzierbar, erreicht aber eine höhere ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Arbeit im Chedin-Labor wird durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R01 GM120607) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaCorresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers for library amplificationprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplificationPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntibodyKerafastENH001These three sources are equivalent
S9.6 AntibodyMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntibodyAbcamab234957

Referenzen

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