体外 人体牙浆干细胞向胰腺血统的诱导

摘要

本协议对区分人类牙浆干细胞（hDPSC）与 体外胰腺谱系的两种不同的诱导协议进行了比较:综合协议和非综合协议。综合协议产生更多的胰岛素产生细胞（IPCs）。

摘要

截至2000年，使用埃德蒙顿协议治疗I型糖尿病胰岛移植的成功仍然面临一些障碍。其中包括数量有限的尸体胰腺捐献者和免疫抑制剂的长期使用。默森奇马尔干细胞（MSCs）被认为是胰岛细胞生成的替代来源的潜在候选者。我们以前的报告成功地说明了建立诱导协议，将人类牙髓干细胞（hDPSC）与胰岛素生成细胞（IPCs）区分。然而，上岗效率差别很大。本文通过综合（微环境和遗传操作）和非集成（微环境操作）诱导协议，演示了通过综合（微环境和遗传操作）来提供 hDPSC 衍生 IPC （hDPSC-IPCs） 的 hDPSC 胰腺感应效率的比较。结果表明，在多剂量葡萄糖挑战下，在三维菌落结构、产量、胰腺mRNA标记和功能特性方面，诱导方法具有明显的感应效率。这些发现将支持未来建立一个临床适用的IPC和胰腺血统生产平台。

引言

糖尿病是一个持续的全球关注。国际糖尿病联合会（IDF）的一份报告估计，全球糖尿病患病率将从2000年的1.51亿增加到2015年的^4.15亿。最新的流行病学研究预测，全球糖尿病患病率将从2017年的4.51亿增加到2045^年的6.93亿。胰岛移植利用埃德蒙顿协议的成功首次证明在2000年，当它被证明保持内源性胰岛素生产和稳定规范的血糖状况在I型糖尿病患者^3。然而，埃德蒙顿协议的应用仍然面临瓶颈问题。尸体胰腺捐献者数量有限是主要问题，因为每个I型糖尿病患者至少需要2-4个小岛捐赠者。此外，长期使用免疫抑制剂可能会导致危及生命的副作用^4，5。为了解决这个问题，在过去十年中，糖尿病的潜在疗法的开发主要侧重于从各种来源的干细胞⁶中产生有效的胰岛素生成细胞（IPCs）。

干细胞成为许多疾病的替代疗法，包括糖尿病I型，这是由β细胞的损失引起的。IPC移植是控制^{这些患者血}糖的新方法。本文介绍了生成 IPC 的两种方法，即集成和非集成感应协议。诱导协议模仿自然胰腺发育过程，使成熟和功能IPC^8，9。

在这项研究中，hDPSC的特点是MSC表面标记检测的流细胞学，多系分分潜力，和RT-qPCR，以确定干性特性和增殖基因标记（未显示的数据）8，9，10的表达。hDPSC被诱导走向明确的内皮，胰腺内皮，胰腺内分泌，胰腺β细胞或IPC（图1），分别^7。为了诱导细胞，使用三步感应方法作为骨干协议。此协议称为非综合协议。在综合协议中，基本胰腺转录因子PDX1在 hDPSC 中表达过度，然后使用三步分化协议在 hDPSC 中引入过度表达PDX1。 非集成协议和集成协议之间的区别在于PDX1在集成协议中过度表达，而不是在非集成协议中过度表达。在这项研究中，胰腺分化被比较为综合和非综合协议。

研究方案

这项工作是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并经朱拉隆功大学牙科学院人类研究伦理委员会批准。由于智齿问题，人类DPC（hDPSC）从从前摩尔和摩尔中提取的人类牙浆组织中被分离出来。根据批准的协议（HREC-DCU 2018/054）从患者那里获得知情同意。

1. 综合上岗协议

1. 携带PDX1的扁豆载体的准备
   1. 使用人类胚胎肾（HEK）293FT细胞进行病毒包装。培养和维持这些细胞在杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） 补充 10% 胎儿牛血清 （FBS）， 1% L-谷氨酰胺， 和 1% 抗生素抗菌剂.
   2. 使用磷酸钙转染系统（如psPAX2、pMD2）将每包10微克的包装和包络质粒和20微克的靶向基因质粒共同转化为 HEK293FT 细胞，生成PDX1-伦蒂病毒载体。 G，和人类pWPT-PDX1¹¹。确保细胞在感染期间是 80%-90% 的汇流。
   3. 转染后，在 48 小时和 72 小时收集含有扁豆颗粒的介质。
   4. 通过 0.45 μm 过滤器过滤收集的介质;在 100 kDa 名义分子重量截止 （NMWCO） 下用离心过滤器将病毒集中。
2. PDX1 过度表达
   1. 使用 70-80% 汇合的 3-5 hDPSC 通道。使用细胞计数器尝试和计数细胞。种子 1 x 10⁶ hDPSC 到 60 毫米组织培养处理盘上，并在一夜之间孵育。
   2. 24小时后，加入从第1.1.4步获得的新鲜病毒颗粒，在所需的感染倍数（MOI）中转录多啤酒酯预处理细胞（4微克/mL多布伦，30分钟低于37°C和_5%CO2）。例如，在这种情况下，使用的 MOI 是 20。在 37 °C 时将细胞保持在细胞培养孵化器中的细胞 24 小时，并保持 5% CO_2。
   3. 24小时感染期后，丢弃含有病毒颗粒的介质。添加新鲜的培养基，并继续生长48小时的细胞。所有文化都保持在37°C和5%CO_2。
   4. 在进入感应步骤之前，检查转染细胞的聚合形态。PDX1转导通过基因表达分析得到证实（补充图1）。
      注意:在进入下一步之前，请在显微镜下检查细胞形态。
   5. 收获并进入三步感应协议（第 1.3 步），作为微环境诱导方法。
3. 三步上岗协议
   注:三步诱导协议导致hDPSC的胰腺分化系列，以确定内皮、胰腺内分泌/内分泌和胰腺β细胞/IPC分别使用无血清介质（SFM）-A、SFM-B和SFM-C。
   1. 丢弃培养基，然后用 1 倍磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 清洗转导的 hDPSC。
   2. 在细胞中加入0.25%的试用蛋白-EDTA溶液，在37°C、5%CO2下孵育1分钟。
   3. 添加培养介质，以阻止试金素活性，并轻轻地冲洗细胞，以获得单细胞悬浮。将细胞和阿利库特 1 x 10⁶ 细胞数入每个收集管中。
   4. 以 468 x g（ 相对离心力:RCF）离心细胞悬架为 4 °C，为 5 分钟。丢弃超高超，保存细胞颗粒。
   5. 将颗粒重新填充到第一个胰腺感应介质的 3 mL 中，即无血清介质 （SFM）-A. 将细胞播种在低附件培养板（60 mm）上。将细胞保持在 37 °C 和 5% CO₂ 3 天。
      注意:在进入下一步之前，在倒置显微镜下观察细胞形态。
   6. 移除 SFM-A 并添加第二感应介质的 3 mL，即 SFM-B。在接下来的两天里，将细胞保持在37°C，5%CO_2。
      注意:在进入下一步之前，在倒置显微镜下观察细胞形态。
   7. 移除 SFM-B 并添加第三感应介质的 3 mL，即 SFM-C。将细胞在未来5天中保持在37°C的细胞培养器中，5%的_CO2。每 48 小时更改一次介质。5天后观察它们的形态。
      注:每个感应介质都辅以不同的试剂，如所述:SFM-A: 1% 牛血清白蛋白 （BSA）， 1x 胰岛素转移素- 氦 （ITS）， 4 nM 活性剂 A， 1 nM 丁酸钠， 和 50μM 的β-麦芽醇;SFM-B:1% BSA、1x ITS 和 0.3 mM 牛磺酸;和SFM C: 1.5% BSA， 1x ITS， 3 mM 牛磺酸， 100 nM 的胰高血糖素样肽 （GLP）-1， 1 mM 烟酰胺， 和 1x 非必需氨基酸 （NEAA）.。
   8. 确保每一步后在倒置显微镜下检查细胞形态。细胞将变得更加聚集和漂浮作为殖民地。
   9. 收集细胞群落以作进一步分析。检查殖民地形态和大小。执行胰腺基因标记表达分析和功能分析（葡萄糖刺激C-肽分泌分析）。

2. 非综合上岗协议

注:非集成协议是交付IPC的骨干协议，采用三步感应过程作为微环境感应方法^8、9。

1. 在 70%-80% 的汇流下使用通道 3-5 hDPSC。
2. 丢弃培养基，用 1 倍 PBS 清洗 hDPSC。
3. 在细胞中加入0.25%的试金素-EDTA溶液，在37°C、5%CO2下孵育1分钟。
4. 添加培养介质，以阻止试金石活性，并轻轻地移液细胞，以获得单细胞悬浮。将细胞和阿利库特 1 x 10⁶ 细胞数入每个收集管中。
   1. 将细胞悬架离心，468 x g （RCF），4 °C，5分钟。丢弃超高纳特。
   2. 将颗粒重新沉入 SFM-A 中，并播种到低附件培养板（60 mm）上。在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养细胞 3 天。在倒置显微镜下检查细胞形态。
   3. 取出 SFM-A，添加 SFM-B（第 3 天），然后在接下来的 2 天内保持细胞在 37 °C 以下，5% CO_2。
   4. 取出 SFM-B，添加 SFM-C（第 5 天），然后在接下来的 5 天内保持细胞在 37 °C 以下，5% CO_2。SFM-C 每 48 小时更改一次。
      注:每个感应介质都辅以不同的试剂，如所述:SFM-A: 1% BSA， 1x ITS， 4 nM 活性剂 A， 1 nM 丁酸钠， 和 50μM 的β-麦芽醇;SFM-B:1% BSA、1x ITS 和 0.3 mM 牛磺酸;和 Sfm C: 1.5% Bsa， 1x Its， 3 mm 牛磺酸， 100 nm 的 Glp - 1， 1 mm 烟酰胺， 和 1x Nea 。
   5. 确保在每一步之后和第10天检查倒置显微镜下的细胞形态。
      注:细胞将变得更加聚合，并将作为殖民地漂浮。
   6. 收集细胞群落以作进一步分析。检查殖民地形态和大小。执行胰腺基因标记表达分析和功能分析（葡萄糖刺激C-肽分泌分析）。

结果

本文比较了两种上岗协议的结果。两个上岗协议的图表在图2A，C中都有说明。在这两个协议中，评估都是在光显微镜下进行的，图像是用 ImageJ 分析的。hDPSC 能够从上岗的第一天起在两个上岗协议中形成类似殖民地的结构。殖民地的形态是圆的和密集的，所有的殖民地漂浮在文化容器在整个上岗期间（图2B，D）。还确定了两个?...

讨论

实现 MSC 的 IPC 产量提高在糖尿病治疗中起着至关重要的作用。集成协议的关键步骤依赖于用于转导的细胞质量和转导细胞的质量。一些细胞要求，应该检查成功的转导是确保细胞健康，细胞银行管理和细胞处于间歇活动状态。此外，监测转导细胞的生存能力也起着重要作用。转导不太成功是由于受刺激细胞¹²的生存能力差造成的。对于非综合协议，形态外观和浮动菌落应实现，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific Corporation, USA	15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish	Corning®	430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific Corporation	12800017
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Corporation	10270106
GlutaMAX™	Thermo Fisher Scientific Corporation	35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific Corporation	25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter	Merck Millipore, USA	UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid	Addgene	12256	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm	Merck Millipore	SLHV033RB
pMD2.G plasmid	Addgene	12259	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck Millipore	TR-1003-G
psPAX2 plasmid	Addgene	12260	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein	Merck Millipore	GF300
Beta-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific Corporation	21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1	Sigma-Aldrich	G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Invitrogen	41400-045
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs)	Thermo Fisher Scientific Corporation	11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm	Eppendorf	30701011
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625