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요약

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

초록

2000년 현재, 에드먼튼 프로토콜을 사용하여 췌장 이식의 성공은 여전히 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이들은 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수 및 면역 억제제의 장기 사용을 포함합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) islet 같은 세포 생성의 대체 소스로 잠재적인 후보로 간주 되었습니다. 우리의 이전 보고서는 성공적으로 인슐린 생산 세포 (CFC)에 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 유도 프로토콜의 설립을 설명했다. 그러나 유도 효율은 크게 다양했습니다. 이 논문에서는 hDPSC 유래 IpC(hDPSC-IpC)를 전달하기 위한 통합(마이크로 환경 및 유전 조작) 및 비통합(microenvironmental 조작) 유도 프로토콜을 통한 hDPSCs 췌장 유도 효율의 비교를 시연합니다. 결과는 다중 복용량 포도당 도전에 3 차원 식민지 구조, 수율, 췌장 mRNA 마커 및 기능성 속성의 관점에서 유도 접근 둘 다에 대한 뚜렷한 유도 효율을 건의합니다. 이러한 사실 인정은 임상적으로 적용 가능한 IpC 및 췌장 계보 생산 플랫폼의 미래 설립을 지원할 것입니다.

서문

당뇨병은 지속적인 글로벌 관심사입니다. 국제 당뇨병 연맹(IDF) 보고서에 따르면 당뇨병의 전 세계 보급률은 2000년 1억 5,100만 명에서 2015년 4억 1,500만 명으로 증가할 것으로추정했다. 최신 역학 기지를 둔 연구 결과는 추정된 세계적인 당뇨병 보급이 2017년에 4억 5천1백만에서 2045년1년에693,000,000로 증가할 것이라는 점을 예측했습니다. 에드먼튼 프로토콜을 이용한 췌장적 이식의 성공은 2000년에 처음 입증되었으며, 내인성 인슐린 생산을 유지하고 I형 당뇨병 환자3에서노모글리세믹 상태를 안정화시키는 것으로 나타났다. 그러나 Edmonton 프로토콜의 적용은 여전히 병목 현상에 직면해 있습니다. 타입-I 당뇨병을 가진 각 환자는 적어도 2-4 islet 기증자를 필요로 하기 때문에 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수는 주요 문제점입니다. 더욱이, 면역억제제의 장기간 사용은 생명을 위협하는부작용4,5를유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해 지난 10년간 당뇨병에 대한 잠재적 치료법의 개발은 주로 다양한 줄기 세포6에서효과적인 인슐린 생산 세포(IpC)의 생성에 초점을 맞추고 있다.

줄기 세포는 베타 세포의 손실에 기인하는 당뇨병 타입 I를 포함하여 많은 질병에서 대체 처리가 되었습니다. IpC의 이식은 이들 환자에서 혈당을 조절하는 새로운 유망한 방법입니다7. 통합 및 비통합 유도 프로토콜인 IpC 생성을 위한 두 가지 방법이 이 문서에서 제시됩니다. 유도 프로토콜은 성숙하고 기능적인 IPC8,9를얻기 위해 자연 췌장 발달 과정을 모방했다.

이 연구를 위해, hDPSC는 MSC 표면 마커 검출, 다중리 분화 전위 및 RT-qPCR을 위한 유동 세포측정을 특징으로 하여 줄기 성질 및 증식 유전자 마커(data)의 발현을 결정하기 위해8,9,10. hDPSC는 최종 내막, 췌장 내분비, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포 또는 IpC(도 1)를향해 각각7을유도하였다. 세포를 유도하기 위해, 3단계 유도 접근법은 백본 프로토콜로 사용되었다. 이 프로토콜을 통합되지 않는 프로토콜이라고 합니다. 통합 프로토콜의 경우, 필수 췌장 전사 인자 인 PDX1은hDPSC에서 과발현된 PDX1을 3단계 분화 프로토콜을 사용하여 hDPSC에서 과도하게 발현되었다. 통합되지 않는 프로토콜과 통합 프로토콜의 차이점은 통합 프로토콜이 아닌 통합 프로토콜에서 PDX1의 과발현입니다. 췌장 분화는 이 연구에서 통합 및 비 통합 프로토콜 사이에서 비교되었습니다.

프로토콜

이 작품은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 출라롱콘 대학 치과 학부인 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 인간 DPSC (hDPSC)는 사랑니 문제로 인해 노모와 어금니 모두에서 추출 된 인간의 치과 펄프 조직에서 분리되었다. 승인된 프로토콜(HREC-DCU 2018/054)에 따라 환자로부터 통보된 동의를 얻었다.

1. 통합 유도 프로토콜

  1. PDX1을 운반하는 렌티바이러스 벡터의 준비
    1. 바이러스 성 포장을 위해 인간 배아 신장 (HEK) 293FT 세포를 사용하십시오. 배양 및 DMEM의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)에서 이러한 세포를 유지 하여 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L-글루타민, 1 % 항생제 - 항진성으로 보충.
    2. PDX1-렌즈바이러스벡터를 각각 10μg의 공동 배분하여 각각 포장 및 봉투 플라스미드와 표적 유전자 플라스미드의 20 μg을 헤K293FT 세포로 결합하여 칼슘 인산염 트랜스퍼션 시스템(예를 들어, psPAX2, pMD2)을 생성한다. G, 및 인간 pWPT-PDX111. 감염 시 세포가 80%-90% 컨실수 있는지 확인합니다.
    3. 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 48 및 72h에서 배설 후 수집한다.
    4. 0.45 μm 필터를 통해 수집된 매체를 필터링하는 행위; 100 kDa 명목 분자량 컷오프(NMWCO)에서 원심 필터로 바이러스를 농축한다.
  2. PDX1 과발현
    1. 70-80% 컨할수 있는 통로 3-5 hDPSC를 사용합니다. 시도및 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 씨앗 1 x 106 hDPSC는 60mm 조직 배양 처리 접시에 하룻밤 동안 배양한다.
    2. 24시간 후, 폴리브레인 전처리 셀(4 μg/mL 폴리브레네, 37°C 미만 30분, CO2 5%CO2)을원하는 복합감염성(MOI)에서 트랜스듀하기 위해 1.1.4단계에서 얻은 신선한 바이러스 입자를 첨가한다. 예를 들어, 이 경우 사용되는 MOI는 20입니다. 세포 배양인인큐베이터에서 세포를 37°C에서 5%CO2로유지한다.
    3. 24h 감염 기간 후, 바이러스 성 입자를 포함하는 매체를 폐기하십시오. 신선한 배양 매체를 추가하고 48 h에 대한 세포를 계속 성장. 모든 배양은 37°C 및 5% CO2로유지됩니다.
    4. 유도 단계로 진행하기 전에 감염된 세포의 집계 된 형태여부를 확인하십시오. PDX1 전염은 유전자 발현분석(보충도 1)에의해 확인된다.
      참고: 다음 단계로 진행하기 전에 현미경으로 세포 형태학을 확인하십시오.
    5. 수확및 미세환경 유도 접근법으로서 3단계 유도 프로토콜(단계 1.3)으로 진행한다.
  3. 3단계 유도 프로토콜
    참고: 3단계 유도 프로토콜은 혈청 이없는 매체(SFM)-A, SFM-B 및 SFM-C를 사용하여 hDPSC의 일련의 췌장 분화를 최종 엔데드럼, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포/IpC로 각각 발생시켰습니다.
    1. 배양 배지를 폐기한 다음 1x 인산염 버퍼링 용액(PBS)으로 변환된 hDPSC를 세척합니다.
    2. 세포에 0.25% 트립신-EDTA 용액을 추가하고 37°C, 5% CO2에서1분 동안 배양한다.
    3. 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포를 부드럽게 플러시하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 각 수집 튜브에 세포와 알리쿼트 1 x 106 세포를 계산합니다.
    4. 468 x g(상대 원심력: RCF), 4°C에서 셀 서스펜션을 원심분리하여 5분 동안 분리합니다. 상체를 버리고 셀 펠릿을 저장합니다.
    5. 제1췌장 유도 배지, 즉 혈청이 없는 배지(SFM)-A. 낮은 부착 배양판(60mm)에 세포를 시드하는 제1췌도 유도 배지의 3mL에서 펠릿을 재연한다. 3일 동안 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지한다.
      참고: 다음 단계로 진행하기 전에 반전된 현미경으로 세포 형태학을 관찰합니다.
    6. SFM-A를 제거하고 두 번째 유도 매체, 즉 SFM-B의 3mL을 추가합니다. 37°C, 5% CO2에서다음 2일 동안 세포를 유지한다.
      참고: 다음 단계로 진행하기 전에 반전된 현미경으로 세포 형태학을 관찰합니다.
    7. SFM-B를 제거하고 세 번째 유도 매체, 즉 SFM-C의 3mL을 추가합니다. 세포 배양에서 다음 5일 동안 세포를 유지하여 37°C에서 5%CO2로유지한다. 매 48 시간마다 매체를 변경합니다. 5 일 후에 그들의 형태를 관찰하십시오.
      참고: 각 유도 매체는 설명된 바와 같이 상이한 시약으로 보충됩니다. SFM-A: 1% 소 혈청 알부민 (BSA), 1 x 인슐린 -transferrin-selenium (ITS), 4 nM 의 활성, 1 nM의 나트륨 부티레이트, 및 베타 메카포에탄올의 50 μM; SFM-B: 1% BSA, 1배 ITS, 0.3 mM 타우린; 및 SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM 타우린, 글루카곤 같은 펩티드 (GLP)-1, 1 mM 니코티나미드, 1x 비필수 아미노산 (NEAA).
    8. 각 단계 후에 반전된 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오. 세포는 더 집계되고 식민지로 떠있을 것입니다.
    9. 추가 분석을 위해 세포 식민지를 수집합니다. 식민지 형태와 크기를 확인합니다. 췌장 유전자 마커 발현 분석 및 기능 분석을 수행합니다(포도당 자극 C-펩티드 분비 분석).

2. 비통합 유도 프로토콜

참고: 비통합 프로토콜은 미세환경 유도 접근법8,9로3단계 유도 프로세스를 가진 IC를 전달하기 위한 백본 프로토콜이다.

  1. 70%-80%의 인플루엔자에 3-5 hDPSC를 사용합니다.
  2. 배양 매체를 폐기하고 1x PBS로 hDPSC를 세척합니다.
  3. 세포에 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 37°C, 5% CO2에서1분 동안 배양한다.
  4. 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포를 부드럽게 피펫하여 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 각 수집 튜브에 세포 와 알리쿼트 1 x 106 세포를 계산합니다.
    1. 468 x g (RCF), 4 °C, 5 분에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
    2. SFM-A에서 펠릿을 다시 중단하고 낮은 부착 배양 플레이트(60mm)에 시드합니다. 3 일 동안 37 °C 및 5 % CO2에서 세포를 배양합니다. 반전된 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오.
    3. SFM-A를 제거하고, SFM-B(3일차)를 추가한 다음, 37°C, 5% CO2하에서 다음 2일 동안 세포를 유지한다.
    4. SFM-B를 제거하고, SFM-C(5일)를 추가한 다음, 37°C, 5% CO2하에서 다음 5일 동안 세포를 유지한다. SFM-C는 48h마다 변경됩니다.
      참고: 각 유도 매체는 설명된 바와 같이 상이한 시약으로 보충됩니다. SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM 의 활성A, 1 nM의 나트륨 부티레이트, 및 베타-메르카포에탄올의 50 μM; SFM-B: 1% BSA, 1배 ITS, 0.3 mM 타우린; 및 SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM 타우린, GLP-1의 100 nM, 1 mM 니코티나미드, 1x NEAA.
    5. 각 단계 후 와 10 일 반전 현미경에서 세포 형태학을 확인해야합니다.
      참고: 세포가 더 집계되고 식민지로 떠들것입니다.
    6. 추가 분석을 위해 세포 식민지를 수집합니다. 식민지 형태와 크기를 확인합니다. 췌장 유전자 마커 발현 분석 및 기능 분석을 수행합니다(포도당 자극 C-펩티드 분비 분석).

결과

이 문서에서는 유도 프로토콜의 결과를 비교했습니다. 두 유도 프로토콜의 다이어그램은 그림 2A,C에 설명되어있습니다. 두 프로토콜 모두에서, 평가는 가벼운 현미경으로 수행되었고, 이미지는 ImageJ로 분석되었다. hDPSC는 유도 프로토콜 모두에서 유도 첫날부터 식민지와 같은 구조를 형성할 수 있었습니다. 식민지의 형태는 둥글고 조밀했으며, 모든 식민지는 ?...

토론

MsC에서 더 높은 IpC 생산을 달성하는 것은 당뇨병 치료에 필수적인 역할을합니다. 통합 프로토콜의 중요한 단계는 변환 및 변환된 세포의 품질에 사용되는 세포의 품질에 의존합니다. 성공적인 트랜스퍼션을 위해 확인해야 하는 몇몇 세포 요구 사항은 세포 건강, 세포 은행 관리 및 세포가 미상 활성 상태에 있다는 것을 보장하고 있습니다. 또한, 트랜스듀스 된 세포의 생존가능성을 모니터링하는 ...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

SK, WR, QDL은 수의학 줄기세포 및 생명공학 연구단위인 라타다피섹톰포트 엔다우먼트 펀드, 출라롱콘대학교의 지원을 받았습니다. TO와 PP는2세기 프로젝트로 출라롱콘 학술 발전에 의해 지원되었다. CS는 수의학 학부의 보조금을 지원하는 연구에 의해 지원되었다, 출라롱콘 학술 발전 2세기 프로젝트, 수의학 줄기 세포 및 생명 공학 연구 단위, Ratchadaphiseksomphot 엔다우먼트 기금, 출라롱콘 대학, 정부 연구 기금.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific Corporation, USA15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture DishCorning®430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific Corporation12800017
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Corporation10270106
GlutaMAX™Thermo Fisher Scientific Corporation35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4Sigma-AldrichP3813-10PAKOne pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific Corporation25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal FilterMerck Millipore, USAUFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmidAddgene12256Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µmMerck MilliporeSLHV033RB
pMD2.G plasmidAddgene12259Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection ReagentMerck MilliporeTR-1003-G
psPAX2 plasmidAddgene12260Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human ProteinMerck MilliporeGF300
Beta-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific Corporation21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)Sigma-AldrichA6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1Sigma-AldrichG3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Invitrogen41400-045
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs)Thermo Fisher Scientific Corporation11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mmEppendorf30701011
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
TaurineSigma-AldrichT0625

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