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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo presenta un confronto tra due diversi protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) verso le linee pancreatiche in vitro:il protocollo integrativo e il protocollo non integrativo. Il protocollo integrativo genera più cellule produttrici di insulina (IPC).

Abstract

A partire dal 2000, il successo del trapianto di isole pancreatiche utilizzando il protocollo di Edmonton per il trattamento del diabete mellito di tipo I ha ancora affrontato alcuni ostacoli. Questi includono il numero limitato di donatori di pancreas cadaverico e l'uso a lungo termine di immunosoppressori. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state considerate un potenziale candidato come fonte alternativa di generazione di cellule simili a isole. I nostri rapporti precedenti hanno illustrato con successo la creazione di protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) dalle cellule produttrici di insulina (IPC). Tuttavia, l'efficienza di induzione variava notevolmente. In questo articolo, dimostriamo il confronto tra l'efficienza di induzione pancreatica delle hDPSC tramite protocolli di induzione integrativi (microambiente e genetica) e non integrativi (manipolazione microambiente) per la fornitura di IPC derivati da hDPSC (hDPSC-IPC). I risultati suggeriscono un'efficienza di induzione distinta per entrambi gli approcci di induzione in termini di struttura della colonia tridimensionale, resa, marcatori di mRNA pancreatico e proprietà funzionali sulla sfida del glucosio multidosaggio. Questi risultati supporteranno la futura creazione di una piattaforma di produzione di IPC e lignaggio pancreatico clinicamente applicabile.

Introduzione

Il diabete mellito è una preoccupazione globale in corso. Un rapporto dell'International Diabetes Federation (IDF) ha stimato che la prevalenza globale del diabete aumenterebbe da 151 milioni nel 2000 a 415 milioni nel 20151,2. L'ultimo studio basato sull'epidemiologia ha previsto che la prevalenza stimata del diabete in tutto il mondo aumenterà da 451 milioni nel 2017 a 693 milioni nel 20451. Il successo del trapianto di isole pancreatiche utilizzando il protocollo di Edmonton è stato dimostrato per la prima volta nel 2000, quando è stato dimostrato che mantiene la produzione endogena di insulina e stabilizza la condizione normoglicemica nei pazienti diabetici di tipo I3. Tuttavia, l'applicazione del protocollo di Edmonton deve ancora affrontare un problema di collo di bottiglia. Il numero limitato di donatori di pancreas cadaverico è il problema principale poiché ogni paziente con diabete di tipo I richiede almeno 2-4 donatori di isole. Inoltre, l'uso a lungo termine di agenti immunosoppressivi può causare effetti collaterali potenzialmente letali4,5. Per affrontare questo problema, lo sviluppo di una potenziale terapia per il diabete nell'ultimo decennio si è concentrato principalmente sulla generazione di cellule produttrici di insulina (IPC) efficaci da varie fonti di cellule staminali6.

Le cellule staminali sono diventate un trattamento alternativo in molte malattie, tra cui il diabete di tipo I, che è causato dalla perdita di cellule beta. Il trapianto di IPC è il nuovo metodo promettente per il controllo della glicemia in questipazienti 7. In questo articolo vengono presentati due approcci per la generazione di IPC, protocolli di induzione integrativi e non integrativi. Il protocollo di induzione ha imitato il naturale processo di sviluppo pancreatico per ottenere le IPC mature e funzionali8,9.

Per questo studio, le hDPSC sono state caratterizzate da citometria a flusso per il rilevamento di marcatori di superficie MSC, potenziale di differenziazione multilinea e RT-qPCR per determinare l'espressione della proprietà di staminalità e dei marcatori genici proliferativi (dati non mostrati)8,9,10. Le hDPSC sono state indotte verso l'endoderma definitivo, l'endoderma pancreatico, il pancreas endocrino e le beta-cellule pancreatiche o IPC (Figura 1), rispettivamente7. Per indurre le cellule, è stato utilizzato un approccio di induzione in tre fasi come protocollo backbone. Questo protocollo è stato chiamato protocollo non integrativo. Nel caso del protocollo integrativo, il fattore essenziale di trascrizione pancreatica, PDX1, è stato sovraespresso nelle hDPSC seguito dall'induzione di PDX1 sovraespresso nelle hDPSC utilizzando un protocollo di differenziazione in tre fasi. La differenza tra protocollo non integrativo e protocollo integrativo è la sovraespressione di PDX1 nel protocollo integrativo e non nel protocollo non integrativo. La differenziazione pancreatica è stata confrontata tra i protocolli integrativi e non integrativi in questo studio.

Protocollo

Questo lavoro è stato eseguito in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana, Facoltà di Odontoiatria, Università Chulalongkorn. Le DPSC umane (hDPSC) sono state isolate dai tessuti della polpa dentale umana estratti sia dai premolari che dai molari a causa di problemi ai denti del giudizio. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti in base a un protocollo approvato (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocollo di induzione integrativa

  1. Preparazione del vettore lentivirale che trasporta PDX1
    1. Utilizzare cellule di rene embrionale umano (HEK) 293FT per il confezionamento virale. Coltura e mantenimento di queste cellule nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di L-glutammina e l'1% di antibiotico-antimicotico.
    2. Generare vettori di PDX1-lentivirusmediante co-trasfezione di 10 μg ciascuno dei plasmidi di imballaggio e involucro e 20 μg del plasmide del gene bersaglio in cellule HEK293FT utilizzando il sistema di trasfezione del fosfato di calcio, ad esempio psPAX2, pMD2. G, e umano pWPT-PDX111. Assicurarsi che le cellule siano confluenti all'80% -90% durante il periodo di infezione.
    3. Raccogliere il mezzo contenente particelle lentivirali a 48 e 72 ore dopo la trasfezione.
    4. Filtrare il mezzo raccolto attraverso un filtro da 0,45 μm; concentrare i virus con un filtro centrifugo a 100 kDa di peso molecolare nominale cut-off (NMWCO).
  2. Sovraespressione PDX1
    1. Utilizzare passaggi 3-5 hDPSC che sono confluenti al 70-80%. Tripsinizzare e contare le cellule usando un contatore di cellule. Semina 1 x 106 hDPSC su un piatto da 60 mm trattato con coltura tissutale e incuba durante la notte.
    2. 24 ore dopo, aggiungere particelle virali fresche ottenute dallo step 1.1.4 per trasdurre cellule pretrattizzate con polibrene (4 μg/mL di polibrene, 30 min sotto i 37 °C e 5% di CO2)alla molteplicità desiderata di infezione (MOI). Ad esempio, in questo caso, MOI utilizzato è 20. Mantenere le cellule nell'incubatore di colture cellulari per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
    3. Dopo il periodo di infezione di 24 ore, scartare il mezzo contenente particelle virali. Aggiungere nuovi mezzi di coltura e continuare a far crescere le cellule per 48 ore. Tutte le colture sono mantenute a 37 °C e 5% CO2.
    4. Controllare la morfologia aggregata delle cellule trasfettate prima di procedere alla fase di induzione. La trasduzione della PDX1 è confermata dall'analisi dell'espressionegenica ( Figura supplementare 1).
      NOTA: Controllare la morfologia cellulare al microscopio prima di procedere ai passaggi successivi.
    5. Raccogliere e procedere a un protocollo di induzione in tre fasi (fase 1.3) come approccio di induzione microambiente.
  3. Protocollo di induzione in tre fasi
    NOTA: Il protocollo di induzione in tre fasi ha portato alla serie di differenziazione pancreatica delle hDPSC in endoderma definitivo, endoderma pancreatico/endocrino e beta-cellule/IPC pancreatiche utilizzando rispettivamente il mezzo privo di siero (SFM)-A, SFM-B e SFM-C.
    1. Scartare il terreno di coltura e quindi lavare le hDPSC trasdotte con 1x soluzione tamponata con fosfato (PBS).
    2. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% alle cellule e incubare per 1 minuto a 37 °C, 5% CO2.
    3. Aggiungere il terreno di coltura per interrompere l'attività della tripsina e lavare delicatamente le cellule per ottenere la sospensione a singola cellula. Contare le cellule e aliquote 1 x 106 celle in ogni tubo di raccolta.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 468 x g (Forza Centrifuga Relativa: RCF), 4 °C, per 5 min. Scartare il surnatante e salvare il pellet cellulare.
    5. Ripresa del pellet in 3 mL di primo mezzo di induzione pancreatica, cioè mezzo privo di siero (SFM)-A. Seminare le cellule su una piastra di coltura a basso attacco (60 mm). Mantenere le celle a 37 °C e 5% CO2 per 3 giorni.
      NOTA: Osservare la morfologia delle cellule al microscopio invertito prima di procedere al passaggio successivo.
    6. Rimuovere SFM-A e aggiungere 3 ml del secondo mezzo di induzione, cioè SFM-B. Mantenere le celle per i prossimi 2 giorni a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Osservare la morfologia delle cellule al microscopio invertito prima di procedere al passaggio successivo.
    7. Rimuovere SFM-B e aggiungere 3 mL del terzo mezzo di induzione, cioè SFM-C. Mantenere le cellule per i successivi 5 giorni in un incubatore di colture cellulari mantenuto a 37 °C con il 5% di CO2. Cambiare il mezzo ogni 48 ore. Osservare la loro morfologia dopo 5 giorni.
      NOTA: Ogni mezzo di induzione è integrato con diversi reagenti come descritto; SFM-A: 1% albumina sierica bovina (BSA), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 4 nM di activina A, 1 nM di butirrato di sodio e 50 μM di beta-mercaptoetanolo; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM di peptide glucagone-simile (GLP)-1, 1 mM nicotinamide e 1x aminoacidi non essenziali (NEAA).
    8. Assicurati di controllare la morfologia cellulare al microscopio invertito dopo ogni passaggio. Le cellule diventeranno più aggregate e galleggieranno come colonie.
    9. Raccogliere colonie cellulari per ulteriori analisi. Controlla la morfologia e le dimensioni della colonia. Eseguire l'analisi dell'espressione del marcatore genico pancreatico e l'analisi funzionale (test di secrezione del peptide C stimolato dal glucosio).

2. Protocollo di induzione non integrativo

NOTA: Il protocollo non integrativo è il protocollo backbone per la fornitura degli IPC con il processo di induzione in tre fasi come approccio di induzione microambiente8,9.

  1. Utilizzare passaggi 3-5 hDPSC al 70% -80% di confluenza.
  2. Scartare il terreno di coltura e lavare le hDPPC con 1x PBS.
  3. Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% sulle cellule e incubare per 1 minuto a 37 °C, 5% CO2.
  4. Aggiungere il terreno di coltura per fermare l'attività della tripsina e pipettare delicatamente le cellule per ottenere la sospensione a singola cellula. Contare le cellule e aliquota 1 x 106 celle in ciascun tubo di raccolta.
    1. Centrifugare la sospensione cellulare a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Scartare il surnatante.
    2. Risuppendi il pellet in SFM-A e semina su una piastra di coltura a basso attacco (60 mm). Colturare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 3 giorni. Controllare la morfologia cellulare al microscopio invertito.
    3. Rimuovere SFM-A, aggiungere SFM-B (Giorno 3) e quindi mantenere le cellule per i prossimi 2 giorni sotto i 37 °C, 5% CO2.
    4. Rimuovere SFM-B, aggiungere SFM-C (Giorno 5) e quindi mantenere le cellule per i prossimi 5 giorni sotto i 37 °C, 5% CO2. SFM-C viene cambiato ogni 48 ore.
      NOTA: Ogni mezzo di induzione è integrato con diversi reagenti come descritto; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM di activina A, 1 nM di butirrato di sodio e 50 μM di beta-mercaptoetanolo; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM di GLP-1, 1 mM nicotinamide e 1x NEAA.
    5. Assicurati di controllare la morfologia cellulare al microscopio invertito dopo ogni passaggio e al giorno 10.
      NOTA: le cellule diventeranno più aggregate e fluttueranno come colonie.
    6. Raccogliere colonie cellulari per ulteriori analisi. Controlla la morfologia e le dimensioni della colonia. Eseguire l'analisi dell'espressione del marcatore genico pancreatico e l'analisi funzionale (test di secrezione del peptide C stimolato dal glucosio).

Risultati

In questo articolo, sono stati confrontati i risultati di entrambi i protocolli di induzione. I diagrammi di entrambi i protocolli di induzione sono illustrati in Figura 2A,C. In entrambi i protocolli, la valutazione è stata eseguita al microscopio ottico e le immagini sono state analizzate con ImageJ. Le hDPSC sono state in grado di formare strutture simili a colonie dal primo giorno di induzione in entrambi i protocolli di induzione. La morfologia della colonia era rotond...

Discussione

Ottenere una maggiore produzione di IPC da MSC svolge un ruolo essenziale nella terapia del diabete. I passaggi critici del protocollo integrativo si basano sulla qualità delle cellule da utilizzare per la trasduzione e sulla qualità delle cellule trasdotte. Alcuni requisiti cellulari che dovrebbero essere controllati per una trasduzione di successo stanno garantendo la salubrità cellulare, la gestione della banca cellulare e le cellule sono in uno stato mitoticamente attivo. Inoltre, anche il monitoraggio della vital...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

SK, WR e QDL sono stati supportati dall'Unità di ricerca sulle cellule staminali veterinarie e la bioingegneria, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP sono stati supportati da Chulalongkorn Academic Advancement nel suo progettodel 2 ° secolo. CS è stato supportato da una sovvenzione di supporto alla ricerca della Facoltà di Scienze Veterinarie, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific Corporation, USA15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture DishCorning®430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific Corporation12800017
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Corporation10270106
GlutaMAX™Thermo Fisher Scientific Corporation35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4Sigma-AldrichP3813-10PAKOne pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific Corporation25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal FilterMerck Millipore, USAUFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmidAddgene12256Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µmMerck MilliporeSLHV033RB
pMD2.G plasmidAddgene12259Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection ReagentMerck MilliporeTR-1003-G
psPAX2 plasmidAddgene12260Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human ProteinMerck MilliporeGF300
Beta-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific Corporation21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)Sigma-AldrichA6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1Sigma-AldrichG3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Invitrogen41400-045
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs)Thermo Fisher Scientific Corporation11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mmEppendorf30701011
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
TaurineSigma-AldrichT0625

Riferimenti

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