通过真空辅助吸附剂提取从人类相关样品中捕获活性产生的微生物挥发性有机化合物

摘要

该协议描述了使用真空辅助吸附剂提取方法从生物样品中提取挥发性有机化合物，使用Entech样品制备导轨进行气相色谱结合质谱分析以及数据分析。它还描述了生物样品的培养和稳定同位素探测。

摘要

来自生物样品的挥发性有机化合物（VOC）来源不明。挥发性有机化合物可能来自宿主或宿主微生物群落内的不同生物体。为了解开微生物VOC的起源，对 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 和 鲍曼不动杆菌的细菌单培养物和共培养物进行了挥发性顶空分析，并在粪便、唾液、污水和痰液的生物样品中进行了稳定同位素探测。单培养和共培养用于鉴定单个细菌物种的挥发性产生，或与稳定同位素探测结合使用，以鉴定生物样品中微生物的活性代谢。

采用真空辅助吸附剂萃取（VASE）提取VOCs。VASE是一种易于使用，商业化，无溶剂的顶空提取方法，用于半挥发性和挥发性化合物。与其他提取选项（如 叔丁基化和固相微萃取）相比，提取过程中使用的溶剂和近真空条件使得开发方法相对容易和快速。此处描述的工作流程用于识别来自单一培养和共培养物的特定易失性特征。此外，对人类相关生物样品的稳定同位素探测的分析确定了通常或独特生产的VOC。本文结合活性微生物培养物的稳定同位素探测，提出了VASTE的一般工作流程和实验注意事项。

引言

挥发性有机化合物（VOCs）在细菌检测和鉴定方面具有很大的前景，因为它们是从所有生物体中排放的，并且不同的微生物具有独特的VOC特征。挥发性分子已被用作检测各种呼吸道感染的非侵入性测量，包括慢性阻塞性肺病¹，尿^中的结核病²和呼吸机相关肺炎⁴，此外还区分囊性纤维化（CF）受试者和健康对照受试者^5，6。挥发性特征甚至已被用于区分CF中的特定病原体感染（金黄色葡萄球菌⁷，铜绿假单胞菌^8，9和金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌¹⁰）。然而，由于这种生物样品的复杂性，通常很难确定特定挥发性有机化合物的来源。

从多种感染微生物中分离挥发性特征的一种策略是对单培养和共培养¹¹中的微生物进行顶空分析。顶空分析检查排放到样品上方"顶空"中的分析物，而不是嵌入样品本身的分析物。微生物代谢物通常在单一培养物中表征，因为在复杂的临床样品中难以确定微生物代谢物的来源。通过分析来自细菌单培养物的挥发物，微生物 在体外 产生的挥发物类型可能代表其挥发性库的基线。结合细菌培养物， 例如，创建共培养物，并分析产生的挥发性分子可以揭示细菌¹²之间的相互作用或交叉喂养。

鉴定挥发性分子微生物来源的另一种策略是提供用稳定同位素标记的营养来源。稳定同位素是天然存在的，具有不同数量中子的原子的非放射性形式。自20世纪30年代初以来，一种用于追踪动物活性代谢的策略¹³中，微生物以标记的营养来源为食，并将稳定同位素纳入其代谢途径。最近，重水（D₂O）形式的稳定同位素已被用于鉴定临床CF痰液样本¹⁴中代谢活性的金黄色葡萄球菌。在另一个例子中，¹³个C标记的葡萄糖已被用于证明铜绿假单胞菌和Rothia mucilaginosa¹²的CF临床分离物之间代谢物的交叉喂养。

随着质谱技术的进步，检测挥发性线索的方法已经从定性观察转向更定量的测量。通过使用气相色谱质谱（GC-MS），大多数实验室或临床环境都能够处理生物样品。许多调查挥发性分子的方法已被用于分析样品，例如食品，细菌培养物和其他生物样品，以及空气和水以检测污染。然而，具有高通量的几种常见挥发性取样方法需要溶剂，并且不能以真空萃取提供的优点进行。此外，分析通常需要更大体积或数量（大于0.5 mL）的样品材料^{15，16，17，18，19}，尽管这是底物特异性的，需要针对每种样品类型和方法进行优化。

在这里，采用真空辅助吸附剂提取（VASE）然后在GC-MS上进行热解吸，以调查细菌单培养物和共培养物的挥发性分布，并鉴定来自人类粪便，唾液，污水和痰液样品的稳定同位素探测的活性挥发物（图1）。在样品量有限的情况下，从低至15μL的痰中提取VOCs。对人类样品的同位素探测实验需要添加稳定的同位素源，如 ¹³°C葡萄糖和培养基来培养微生物群落的生长。挥发物的活性生产被GC-MS确定为更重的分子。在静态真空下提取挥发性分子能够以更高的灵敏度检测挥发性分子^20，21，22。

研究方案

1. 顶空吸附笔（HSP）和样品分析注意事项

注意:选择含有吸附剂Tenax TA的HSP是为了捕获各种挥发物。与其他吸附剂相比，Tenax对水的亲和力较低，这使其能够从高湿度样品中捕获更多的VOC。Tenax还具有低水平的杂质，可以调节以重复使用。在GC-MS中安装色谱柱时，还考虑了吸附剂的选择（参见 材料表）。

1. 通过提取具有与样品提取相同的条件提取培养基和/或样品空白来生成阴性对照。
2. 在分析提取的样品之前，在GC-MS上分析空白的HSP（先前确认为干净且没有显着的背景）。在样品类型之间运行空白（例如，细菌单次培养的三次重复，空白的细菌，细菌共培养的三次重复，空白等）。
3. 在样品提取和分析之前，限制使用芳香的个人护理用品或食用有气味的食物。理想情况下，在生物安全罩中制备样品，该罩子至少30分钟未被酒精或其他挥发性清洁剂清洁。在样品制备前，打开生物安全罩中的气流30-60分钟。
4. 将样品保存在冰上，以限制样品制备过程中的挥发性释放。

2. 单培养和共培养制备

1. 在生物安全罩中，在Todd Hewitt生长培养基中接种 鲍曼氏菌，金黄色葡萄球菌 和 铜绿假单胞菌 的培养物。在37°C下以200rpm搅拌孵育过夜。
2. 过夜孵育后，在生物安全罩中进行培养处理。在500nm处将每个培养物稀释至光密度0.05。
3. 将等份共培养物混合，并将200μL对照培养基，单孔或共培养物移液到96孔板的每个孔中，并置于37°C培养箱中24小时。准备第二个板进行48小时的孵育。
4. 在孵育期结束时，准备样品以进行第4节的提取。将液体培养物移液到微量离心管中并储存在-80°C。
   注意:此时，样品可以储存在-80°C，以便以后在需要时提取。

3. 生物样品制备中的稳定同位素探测

注意:粪便和唾液样本是由匿名捐赠者捐赠的，并得到加州大学欧文分校机构审查委员会（HS# 2017-3867）的批准。污水来自加利福尼亚州圣地亚哥。痰液样本是从囊性纤维化的受试者中收集的，作为密歇根大学医学院机构审查委员会（HUM00037056）批准的一项大型研究的一部分。

1. 在生物安全罩中执行所有生物样品制备。
   1. 为了制备粪便样品，在1.5 mL微量离心管中向100mg粪便中加入1mL去离子水并涡旋3分钟。不使用时放在冰上。
      1. 在15μL粪便和水混合物中，加入485μL脑心输注（BHI）培养基与20mM ¹³C葡萄糖，或BHI与30%氘（D₂O）。确保样品的最终体积为500μL，以技术三份制备样品。
   2. 为了制备污水样品，将500μL污水加入500μL BHI中，其中20mM ¹³C葡萄糖或BHI与30%D₂O，总体积为1mL。准备一式三份的样品。不使用时放在冰上。
   3. 为了制备唾液样品，将50μL唾液加入500μL BHI中，其中20mM ¹³C葡萄糖或BHI与30%D₂O，总体积为550μL。不使用时放在冰上。
   4. 为了制备痰液样品以比较培养前后样品中存在的挥发物，请用15μL痰进行第一次提取。准备一式三份的样品。不使用时放在冰上。进入第4部分进行样品提取，并在37°C下以200rpm搅拌提取18小时。
   5. 完成第一次提取未培养的痰液样本后，用痰保存小瓶。将500μL含有20mM ¹³C葡萄糖的BHI加入到痰液从3.5.1的小瓶中。不使用时放在冰上。
2. 继续第 4 部分进行样品提取。

4. 样品提取

1. 将空的挥发性有机分析（VOA）小瓶（20毫升）放在冷板上，并将冷板放在生物安全罩中的冰上。
2. 打开 5600 吸附笔提取装置 （SPEU），并根据每种方法的要求调整到所需的温度。
   注意:对于在37°C下的稳定同位素探测实验，达到设定点可能需要长达15分钟。对于70°C下的单培养和共培养实验，达到设定点可能需要长达60分钟。
3. 收集与制备的样品数量相等的干净 HSP，包括用于培养基或样品质控品的 HSP。
4. 根据需要根据样品、重复和 HSP ID 标记 20 mL VOA 样品瓶。使用抗水的标记，以防在冰上时小瓶外部形成冷凝。
5. 在生物安全罩内，拧下小瓶上的白色盖子，快速将样品移液到小瓶中，然后组装黑色盖子，盖子衬垫和HSP。
   注意:样品不应与HSP接触，样品量将取决于样品类型。
6. 将含有样品和HSP的小瓶放回冷板上。
7. 对每个样本重复步骤 4.5 和 4.6。对每个样品执行这些步骤，而不是一次全部执行，以防止样品升温，从而防止过早释放挥发性。
8. 一旦所有样品都在玻璃瓶中制备完毕，请在工作台上的生物安全罩外执行以下步骤。打开真空泵，将小瓶置于真空至30 mmHg的条件下，然后取出真空源。
   注意:真空应用完成后，小瓶不需要放在冷托盘上。
9. 使用压力表将所有样品置于真空下后，请仔细检查压力。如果小瓶有泄漏，请确保盖紧紧拧紧，并且HSP和盖子衬垫的白色O形圈正确到位。
   注意:与真空下的小瓶相比，密封受损会导致挥发性检测减少。
10. 将小瓶放入SPEU中以优化的时间和温度，并以200 rpm的速度搅拌。在70°C下提取培养1小时。 在37°C下用粪便，污水，唾液和痰液样品提取稳定同位素探测实验18小时。
11. 将冷板置于-80°C，以便在提取期完成后使用。
12. 提取完成后，将样品放在冷板上15分钟，以从HSP和小瓶顶部空间抽出水蒸气。
13. 将 HSP 转移到袖子上。
    注意:在室温下，实验可以在这里暂停长达约1周，然后从HSP中失去更高挥发性的化合物。

5. 在气相色谱-质谱仪（GC-MS）上分析样品

1. 使用以下 GC-MS（参见 材料表）设置:35 °C，保持 5 分钟，10 °C/min 斜坡至 170 °C，15 °C/min 斜坡至 230 °C，分流比为 20:1，总运行时间为 38 分钟。
2. 将解吸方法设定如下:2分钟，70°C预热;2分钟260°C解吸;34分钟，260°C烘烤;和2分钟，70°C后烘烤。
3. 设置样本序列，并根据检测开始运行。
   1. 要在Entech软件上设置序列，请打开该程序。在仪器下拉菜单右侧的选项中，选择 5800 |序列。
   2. 观察 Entech 软件中的序列表，类似于 GC-MS 软件中的序列表。根据"当前date_vial编号"命名"示例 ID"列。请记住，Name 类似于 GC-MS 序列表中的 Name，5800 Method 确定温度斜坡的速率、保持时间等（打开一个菜单以选择步骤 5.2 中生成的方法）。
   3. 请记住， 托盘 和 位置 列决定了样品制备导轨（SPR）将去哪里拾取HSP。
      1. 观察紧挨左侧各有30个斑点的两个托盘，布置为六列，每列有五个斑点。最左边和最靠近用户（前面）的托盘位置是位置 1，而最右边、最远的位置是位置 30。
      2. 请注意，这些托盘是 HSP A 或 B，其中 HSP B 是靠近 SPR（最内层托盘）的托盘，而 HSP B 后面的是 HSP 空白。将提取的样品放入托盘中，并相应地选择序列上的点。
   4. 保存序列表，选择左侧的" 运行 "，如果空白 HSP 位于解吸器中 （由黄色标签标记的 HSP 表示），则在解吸器中以空白开头。
4. 请注意，HSP将由SPR处理序列中的每个样品。让SPR预热，然后屏幕顶部会出现一条消息，以确认空白是否在解吸器中。单击" 跳过 "以确认触控笔已存在。允许SPR自动运行所有样品，GC-MS端的序列将自动将数据记录在单独的文件中。

6. 数据分析

1. GC-MS软件上的质量过滤器数据（材料表）。
   1. 查看色谱图上的每个峰，并注释与美国国家标准与技术研究院（NIST）库（或另一个可用库）匹配的峰。
   2. 将带注释的色谱图峰添加到处理方法中。设置选择峰的标准以包括概率大于75%的化合物，并确保化合物的每个识别离子的对齐位于峰的中心。
      1. 要向处理方法添加峰值，请选择校准|编辑复合|名称|在外部标准化合物下插入化合物。加上化合物的名称、保留时间、定量信号目标离子。添加三个最大的峰。要保存，请选择确定|方法|保存。
   3. 设置过程方法后，请继续定量 |计算和 查看|Q编辑定量结果。
   4. 检查每种化合物，以确保峰与其预期的保留时间一致，并且高于背景噪声。
   5. QEdit 完成后，选择" 退出|是的 ，保存 QEdits 并返回到主色谱图。通过打开左侧的文件导出区域集成。选择 定量|生成报告。
   6. 要导出文件以在 DExSI 中使用，请选择" 文件|将数据导出 为 AIA 格式|创建新目录，然后选择文件的位置或 "使用现有目录"。
   7. 观察打开的新窗口以选择要导出的文件。将文件移动到窗口的右侧，然后单击" 处理"。等待几秒钟到几分钟，具体取决于要转换的文件数。
2. 根据DExSI软件（https://github.com/DExSI/DExSI）的说明校正DExSI中的同位素丰度，并使用喜欢的软件或程序（例如R）进行分析。用于生成数字的脚本位于 https://github.com/joannlp/ VOC_SIP。

结果

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼氏菌的单一和共培养
单一培养和共培养物由细菌种类 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 和 鲍曼氏菌组成。这些是在人类伤口和慢性感染中发现的常见机会性病原体。为了鉴定单培养物和共培养物中存在的挥发性分子，在70°C下以200rpm搅拌进行短的...

讨论

为了鉴定 体外 培养物和人相关样品中的挥发性产生，对 铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌 和 鲍曼氏 菌的单培养物和共培养物进行挥发性分析，并对不同生物样品进行稳定同位素探测。在单培养和共培养物的分析中，通过在70°C下进行短萃取1小时来检测挥发物。 对单一培养和共培养物的挥发性分析允许对单个物种及其与其他物种相互作用期间产生的化合物进行调查。不同文化...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C glucose	Sigma-Aldrich	389374-1G
2-Stg Diaph Pump	Entech Instruments	01-10-20030
20 mL VOA vials	Fisher Scientific	5719110
24 mm Black Caps with hole, no septum	Entech Instruments	01-39-76044B	holds lid liner in place on vial
24 mm vial liner for sorbent pens	Entech Instruments	SP-L024S	allows pens to make a vacuum seal at top of vial
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)	Entech Instruments	5600-SPES	5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-well assay plates	Genesee	25-224
Brain Heart Infusion (BHI) media	Sigma-Aldrich	53286-500G
ChemStation Stofware	Agilent
DB-624 column	Agilent	122-1364E	60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-1L
Dexsi sofware	Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)	Agilent		7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector
Headspace Bundle HS-B01, 120VA	Entech Instruments	SP-HS-B01	Items for running headspace extraction included in bundle
Headspace sorbent pen (HSP) - blank	Entech Instruments	SP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)	Entech Instruments	SP-HS-T3560
Microcentrifuge tubes (2 mL)	VWR	53550-792
O-rings	Entech Instruments	SP-OR-L024
Sample Preparation Rail	Entech Instruments
Sorbent pen thermal conditioner	Entech Instruments	3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media	Sigma	T1438-500G