Captura de compuestos orgánicos volátiles microbianos producidos activamente a partir de muestras asociadas con humanos con extracción de sorbente asistida por vacío

Resumen

Este protocolo describe la extracción de compuestos orgánicos volátiles de una muestra biológica con el método de extracción de sorbente asistido por vacío, cromatografía de gases junto con espectrometría de masas utilizando el riel de preparación de muestras Entech y análisis de datos. También describe el cultivo de muestras biológicas y el sondeo de isótopos estables.

Resumen

Los compuestos orgánicos volátiles (COV) de muestras biológicas tienen orígenes desconocidos. Los COV pueden originarse en el huésped o en diferentes organismos dentro de la comunidad microbiana del huésped. Para desentrañar el origen de los COV microbianos, se realizó un análisis volátil del espacio de cabeza de mono y cocultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii, y sondeo de isótopos estables en muestras biológicas de heces, saliva, aguas residuales y esputo. Se utilizaron monocultivos y cocultivos para identificar la producción volátil de especies bacterianas individuales o en combinación con sondeos de isótopos estables para identificar el metabolismo activo de los microbios a partir de las muestras biológicas.

Se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) para extraer los COV. VASE es un método de extracción de espacio de cabeza fácil de usar, comercializado y sin disolventes para compuestos semivolátiles y volátiles. La falta de disolventes y las condiciones cercanas al vacío utilizadas durante la extracción hacen que el desarrollo de un método sea relativamente fácil y rápido en comparación con otras opciones de extracción, como la terc-butilación y la microextracción en fase sólida. El flujo de trabajo descrito aquí se utilizó para identificar firmas volátiles específicas de monocultivos y cocultivos. Además, el análisis del sondeo de isótopos estables de muestras biológicas humanas asociadas identificó COV que se produjeron de forma común o única. Este artículo presenta el flujo de trabajo general y las consideraciones experimentales de VASE junto con el sondeo de isótopos estables de cultivos microbianos vivos.

Introducción

Los compuestos orgánicos volátiles (COV) son muy prometedores para la detección e identificación de bacterias porque son emitidos por todos los organismos, y los diferentes microbios tienen firmas únicas de COV. Las moléculas volátiles se han utilizado como una medida no invasiva para detectar diversas infecciones respiratorias, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica¹, la tuberculosis² en la orina³ y la neumonía asociada al ventilador⁴, además de distinguir a los sujetos con fibrosis quística (FQ) de los sujetos de control sanos ^5,6. Las firmas volátiles incluso se han utilizado para distinguir infecciones patógenas específicas en la FQ (Staphylococcus aureus⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 y S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Sin embargo, con la complejidad de tales muestras biológicas, a menudo es difícil identificar la fuente de COV específicos.

Una estrategia para desenredar los perfiles volátiles de múltiples microbios infecciosos es realizar análisis del espacio de cabeza de los microorganismos tanto en monocultivo como en cocultivo¹¹. El análisis del espacio de cabeza examina los analitos emitidos en el "espacio de cabeza" sobre una muestra en lugar de los incrustados en la muestra misma. Los metabolitos microbianos a menudo se han caracterizado en monocultivos debido a la dificultad para determinar el origen de los metabolitos microbianos en muestras clínicas complejas. Al perfilar volátiles a partir de monocultivos bacterianos, los tipos de volátiles que un microbio produce in vitro pueden representar una línea de base de su repertorio volátil. La combinación de cultivos bacterianos, por ejemplo, la creación de cocultivos y el perfil de las moléculas volátiles producidas pueden revelar las interacciones o la alimentación cruzada entre las bacterias¹².

Otra estrategia para identificar el origen microbiano de las moléculas volátiles es proporcionar una fuente de nutrientes que esté etiquetada con un isótopo estable. Los isótopos estables son formas naturales y no radiactivas de átomos con un número diferente de neutrones. En una estrategia que se ha utilizado desde principios de la década de 1930 para rastrear el metabolismo activo en animales¹³, el microorganismo se alimenta de la fuente de nutrientes etiquetada e incorpora el isótopo estable en sus vías metabólicas. Más recientemente, se ha utilizado un isótopo estable en forma de agua pesada (D₂O) para identificar S. aureus metabólicamente activo en una muestra clínica de esputo de FQ¹⁴. En otro ejemplo, se ha utilizado ¹³glucosa marcada con C para demostrar la alimentación cruzada de metabolitos entre aislados clínicos de FQ de P. aeruginosa y Rothia mucilaginosa¹² .

Con el avance de las técnicas de espectrometría de masas, los métodos de detección de señales volátiles han pasado de observaciones cualitativas a mediciones más cuantitativas. Mediante el uso de la espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS), el procesamiento de muestras biológicas se ha vuelto al alcance de la mayoría de los entornos clínicos o de laboratorio. Se han utilizado muchos métodos para estudiar moléculas volátiles para perfilar muestras como alimentos, cultivos bacterianos y otras muestras biológicas, y aire y agua para detectar la contaminación. Sin embargo, varios métodos comunes de muestreo volátil con alto rendimiento requieren disolvente y no se realizan con las ventajas proporcionadas por la extracción al vacío. Además, a menudo se requieren volúmenes o cantidades mayores (superiores a 0,5 ml) de materiales muestreados para^el análisis 15,16,17,18,19, aunque esto es específico del sustrato y requiere optimización para cada tipo de muestra y método.

Aquí, se empleó la extracción de sorbente asistida por vacío (VASE) seguida de la desorción térmica en un GC-MS para estudiar los perfiles volátiles de monocultivos y cocultivos bacterianos e identificar volátiles producidos activamente con sondeo de isótopos estables a partir de heces humanas, saliva, aguas residuales y muestras de esputo (Figura 1). Con cantidades de muestra limitadas, los COV se extrajeron de tan solo 15 μL de esputo. Los experimentos de sondeo de isótopos con muestras humanas requirieron agregar una fuente de isótopos estable, como glucosa ^{de 13}C, y medios para cultivar el crecimiento de la comunidad microbiana. La producción activa de volátiles fue identificada como una molécula más pesada por GC-MS. La extracción de moléculas volátiles bajo vacío estático permitió la detección de moléculas volátiles con mayor sensibilidad 20,21,22.

Protocolo

1. Pluma sorbente de espacio para la cabeza (HSP) y consideraciones de análisis de muestras

NOTA: El HSP que contiene el sorbente Tenax TA fue seleccionado para capturar una amplia gama de volátiles. Tenax tiene una menor afinidad por el agua en comparación con otros sorbentes, lo que le permite atrapar más COV de muestras de mayor humedad. Tenax también tiene un bajo nivel de impurezas y puede ser acondicionado para su reutilización. La selección del sorbente también se hizo en consideración con la columna instalada en el GC-MS (ver la Tabla de Materiales).

1. Generar controles negativos mediante la extracción de medios y/o muestras en blanco con las mismas condiciones utilizadas para la extracción de muestras.
2. Analice un HSP en blanco (previamente confirmado como limpio y libre de antecedentes significativos) en el GC-MS antes de analizar las muestras extraídas. Ejecute espacios en blanco entre tipos de muestra (por ejemplo, tres réplicas de monocultivo de bacterias, en blanco, tres réplicas de cocultivo de bacterias, en blanco, etc.).
3. Limite el uso de artículos fragantes de cuidado personal o el consumo de alimentos malolientes antes de la extracción y el análisis de la muestra. Idealmente, prepare muestras en una campana de bioseguridad que no haya sido limpiada con alcohol u otros limpiadores volátiles durante al menos 30 minutos. Encienda el flujo de aire en la campana de bioseguridad durante 30-60 minutos antes de la preparación de la muestra.
4. Mantenga las muestras en hielo para limitar la liberación de volátiles durante la preparación de la muestra.

2. Preparación monocultivo y cocultivo

1. En la fase de bioseguridad, inocular cultivos de A. baumannii, S. aureus y P. aeruginosa en medios de crecimiento Todd Hewitt. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm.
2. Después de la incubación durante la noche, realice el manejo del cultivo en la campana de bioseguridad. Diluir cada cultivo a una densidad óptica de 0,05 a 500 nm.
3. Mezcle los cocultivos en partes iguales y pipetee 200 μL de medios de control, monocultivo o cocultivo en cada pozo de una placa de 96 pocillos, y colóquelos en una incubadora de 37 °C durante 24 h. Prepare un segundo plato para una incubación de 48 horas.
4. Al final del período de incubación, prepare las muestras para la extracción en la sección 4. Pipetear cultivos líquidos en tubos de microcentrífuga y conservar a -80 °C.
   NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -80 ° C para extraerlas más tarde si es necesario.

3. Sondeo de isótopos estables en la preparación de muestras biológicas

NOTA: Las muestras de heces y saliva fueron donadas por donantes anónimos con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California Irvine (HS # 2017-3867). Las aguas residuales provenían de San Diego, CA. Las muestras de esputo se recolectaron de sujetos con fibrosis quística como parte de un estudio más amplio aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan (HUM00037056).

1. Realizar todas las preparaciones de muestras biológicas en la campana de bioseguridad.
   1. Para preparar muestras fecales, agregue 1 ml de agua desionizada a 100 mg de heces en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice durante 3 min. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
      1. A 15 μL de mezcla fecal y agua, agregue 485 μL de medio de infusión cerebral del corazón (BHI) con 20 mM ¹³C de glucosa, o BHI con 30% de deuterio (D₂O). Asegúrese de que el volumen final de la muestra es de 500 μL. Preparar las muestras por triplicado técnico.
   2. Para preparar muestras de aguas residuales, agregue 500 μL de aguas residuales a 500 μL de BHI con 20 mM ¹³C de glucosa o BHI con 30% D₂O para un volumen total de 1 mL. Preparar muestras por triplicado. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
   3. Para preparar muestras de saliva, agregue 50 μL de saliva a 500 μL de BHI con 20 mM ¹³C de glucosa o BHI con 30% D₂O para un volumen total de 550 μL. Prepare muestras por triplicado. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
   4. Para preparar muestras de esputo para comparar los volátiles presentes en la muestra antes y después del cultivo, realice una primera extracción con 15 μL de esputo. Preparar muestras por triplicado. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso. Continúe con la sección 4 para la extracción de la muestra y extraiga durante 18 h a 37 °C con agitación a 200 rpm.
   5. Después de completar la primera extracción de las muestras de esputo no cultivadas, guarde los viales con esputo. Añadir 500 μL de BHI con 20 mM ¹³C de glucosa a los viales con esputo a partir de 3.5.1. Colocar sobre hielo cuando no esté en uso.
2. Continúe con la sección 4 para la extracción de muestras.

4. Extracción de muestras

1. Coloque viales vacíos de análisis orgánico volátil (VOA) (20 ml) en la placa fría y coloque la placa fría sobre hielo en la campana de bioseguridad.
2. Encienda la unidad de extracción de pluma sorbente 5600 (SPEU) y ajuste a la temperatura deseada según sea necesario para cada método.
   NOTA: Para experimentos de sondeo de isótopos estables a 37 ° C, alcanzar el punto de consigna puede tomar hasta 15 minutos. Para experimentos de monocultivo y cocultivo a 70 °C, alcanzar el punto de consigna puede tardar hasta 60 min.
3. Recolecte HSP limpios que sean iguales al número de muestras preparadas, incluidos los HSP para medios o controles de muestras.
4. Etiquete los viales de VOA de 20 ml de acuerdo con las muestras, réplicas e id. HSP según sea necesario. Use un marcador que resista el agua en caso de que se forme condensación en el exterior del vial mientras está en hielo.
5. Dentro de la campana de bioseguridad, desenrosque la tapa blanca del vial, canalice rápidamente la muestra en el vial y ensamble la tapa negra, el revestimiento de la tapa y el HSP.
   NOTA: Las muestras no deben entrar en contacto con el HSP, y el volumen de la muestra dependerá del tipo de muestra.
6. Coloque el vial que contiene la muestra y la HSP de nuevo en la placa fría.
7. Repita los pasos 4.5 y 4.6 para cada muestra. Realice estos pasos por muestra en lugar de todos a la vez para evitar el calentamiento de la muestra y, por lo tanto, la liberación prematura de volátiles.
8. Una vez que todas las muestras se hayan preparado en los viales de vidrio, realice los siguientes pasos fuera de la campana de bioseguridad en el banco. Encienda la bomba de vacío, coloque los viales bajo vacío a 30 mmHg y retire la fuente de vacío.
   NOTA: No es necesario que los viales estén en la bandeja fría después de que se haya completado la aplicación al vacío.
9. Verifique la presión después de colocar todas las muestras al vacío utilizando el manómetro. Si un vial tiene una fuga, asegúrese de que la tapa esté bien atornillada y que las juntas tóricas blancas del HSP y los revestimientos de la tapa estén correctamente colocados.
   NOTA: Un sello comprometido puede resultar en una disminución de la detección de volátiles en comparación con un vial al vacío.
10. Coloque los viales en el SPEU para el tiempo y la temperatura optimizados con agitación a 200 rpm. Extraer cultivos durante 1 h a 70 °C. Extraiga experimentos de sondeo de isótopos estables con muestras fecales, residuales, saliva y esputo durante 18 h a 37 ° C.
11. Coloque la placa fría a -80 °C para su uso después de que se complete el período de extracción.
12. Cuando se complete la extracción, coloque las muestras en la placa fría durante 15 minutos para extraer el vapor de agua del HSP y el espacio de cabeza del vial.
13. Transfiera los HSP a sus mangas.
    NOTA: El experimento se puede pausar aquí hasta ~ 1 semana a temperatura ambiente antes de perder los compuestos más altamente volátiles de los HSP.

5. Analizar muestras en la cromatografía de gases - espectrómetro de masas (GC-MS)

1. Utilice los siguientes ajustes de GC-MS (consulte la Tabla de materiales): 35 °C con una retención de 5 minutos, rampa de 10 °C/min a 170 °C y una rampa de 15 °C/min a 230 °C con una relación dividida de 20:1 y un tiempo de ejecución total de 38 min.
2. Establezca el método de desorción de la siguiente manera: 2 min, 70 °C de precalentamiento; 2 min 260 °C de desorción; 34 min, 260 °C bakeout; y 2 min, 70 °C post horneado.
3. Configure la secuencia de muestras e inicie la ejecución de acuerdo con la instrumentación.
   1. Para configurar una secuencia en el software Entech, abra el programa. En las opciones a la derecha del menú desplegable del instrumento, seleccione 5800 | Secuencia.
   2. Observe la tabla de secuencias en el software Entech similar a la del software GC-MS. Asigne a la columna ID de ejemplo el nombre del número de date_vial actual. Tenga en cuenta que Name es análogo a Name en la tabla de secuencia GC-MS, y el método 5800 determina la velocidad de la rampa de temperatura, los tiempos de retención, etc. (abre un menú para seleccionar el método generado en el paso 5.2).
   3. Tenga en cuenta que las columnas Bandeja y Posición determinan dónde irá el riel de preparación de muestras (SPR) para recoger los HSP.
      1. Observe las dos bandejas con 30 puntos cada una a la izquierda inmediata, dispuestas como seis columnas con cinco puntos cada una. La posición de la bandeja que queda más a la izquierda y más cerca del usuario (delante) es la posición 1, mientras que la más a la derecha, más alejada, es la posición 30.
      2. Tenga en cuenta que estas bandejas son HSP A o B, donde HSP B es la bandeja más cercana al SPR (bandeja más interna), y directamente detrás de HSP B está HSP Blank. Coloque las muestras extraídas en las bandejas y seleccione el punto en la secuencia en consecuencia.
   4. Guarde la tabla de secuencia, seleccione Ejecutar en el lado izquierdo y, a continuación, Comience con espacio en blanco en el desorbente si el HSP en blanco está en el desorber (denotado por un HSP marcado con una etiqueta amarilla).
4. Tenga en cuenta que los HSP serán manejados por el SPR para cada muestra en la secuencia. Deje que el SPR se caliente, luego aparecerá un mensaje en la parte superior de la pantalla para confirmar si el espacio en blanco está en el desorber. Haga clic en Omitir para confirmar que el lápiz está allí. Permita que el SPR ejecute todas las muestras automáticamente, y la secuencia en el lado GC-MS registrará automáticamente los datos en archivos separados.

6. Análisis de datos

1. Datos de filtro de calidad en el software GC-MS (Tabla de Materiales).
   1. Revise cada pico en el cromatograma y anote los picos que coincidan con la biblioteca del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) (o con otra biblioteca disponible).
   2. Agregue picos de cromatograma anotados al método de procesamiento. Establezca los criterios para seleccionar picos para incluir compuestos con una probabilidad superior al 75%, y asegúrese de que la alineación de cada ion identificativo del compuesto se encuentre dentro del centro del pico.
      1. Para agregar un pico al método de procesamiento, seleccione Calibrar | Editar | compuesto Nombre | inserte el compuesto en Compuesto estándar externo. Agregue el nombre del compuesto, tiempo de retención, Quant Signal Target Ion. Agregue los tres picos más grandes. Para guardar, seleccione aceptar | Método | Guardar.
   3. Una vez configurado el método de proceso, proceda a Cuantificar | Calcular y ver | QEdit Resultado cuantitativo.
   4. Inspeccione cada compuesto para asegurarse de que los picos se alineen con sus tiempos de retención esperados y estén por encima del ruido de fondo.
   5. Una vez que se haya completado QEdit, seleccione Salir | Sí para guardar el QEdits y volver al cromatograma principal. Exporte las integraciones de área abriendo el archivo en el lado izquierdo. Seleccione Cantidadar | Generar informe.
   6. Para exportar archivos para su uso en DExSI, seleccione | Exportar datos a formato AIA | Cree un nuevo directorio y seleccione una ubicación para el archivo o Usar directorio existente.
   7. Observe cómo se abre una nueva ventana para seleccionar los archivos que desea exportar. Mueva los archivos al lado derecho de la ventana y haga clic en Procesar. Espere de unos segundos a unos minutos dependiendo de la cantidad de archivos que se conviertan.
2. Corrija la abundancia de isótopos en DExSI de acuerdo con las instrucciones para el software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) y realice análisis con un software o programa favorito (por ejemplo, R). Los scripts utilizados para generar las figuras se encuentran en https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Resultados

Monocultivos y cocultivos de S. aureus, P. aeruginosa y A. baumannii
Los monocultivos y cocultivos consistieron en las especies bacterianas S. aureus, P. aeruginosa y A. baumannii. Estos son patógenos oportunistas comunes que se encuentran en heridas humanas e infecciones crónicas. Para identificar las moléculas volátiles presentes en los monocultivos y cocultivos, se r...

Discusión

Para identificar la producción volátil en cultivos in vitro y muestras asociadas al ser humano, se realizó un análisis volátil de monocultivos y cocultivos de P. aeruginosa, S. aureus y A. baumanii y sondeo de isótopos estables de diferentes muestras biológicas. En el análisis para los monocultivos y cocultivos, se detectaron volátiles realizando una extracción corta durante 1 h a 70 °C. El análisis volátil de monocultivos y cocultivos permitió el estudio de los compuestos produc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C glucose	Sigma-Aldrich	389374-1G
2-Stg Diaph Pump	Entech Instruments	01-10-20030
20 mL VOA vials	Fisher Scientific	5719110
24 mm Black Caps with hole, no septum	Entech Instruments	01-39-76044B	holds lid liner in place on vial
24 mm vial liner for sorbent pens	Entech Instruments	SP-L024S	allows pens to make a vacuum seal at top of vial
5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)	Entech Instruments	5600-SPES	5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC
96-well assay plates	Genesee	25-224
Brain Heart Infusion (BHI) media	Sigma-Aldrich	53286-500G
ChemStation Stofware	Agilent
DB-624 column	Agilent	122-1364E	60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	151882-1L
Dexsi sofware	Dexsi (open source)
GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)	Agilent		7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector
Headspace Bundle HS-B01, 120VA	Entech Instruments	SP-HS-B01	Items for running headspace extraction included in bundle
Headspace sorbent pen (HSP) - blank	Entech Instruments	SP-HS-0
Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)	Entech Instruments	SP-HS-T3560
Microcentrifuge tubes (2 mL)	VWR	53550-792
O-rings	Entech Instruments	SP-OR-L024
Sample Preparation Rail	Entech Instruments
Sorbent pen thermal conditioner	Entech Instruments	3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) media	Sigma	T1438-500G