跟踪开放全球伤害和治疗性能的前段器官文化平台

摘要

在农村或与军事相关的情景中，开放全球眼损伤可能连续多日得不到治疗，导致失明。需要治疗，以尽量减少视力损失。在这里，我们详细介绍了器官文化开放地球伤害模型。通过这个模型，可以正确评估稳定这些伤害的潜在治疗方法。

摘要

开放地球损伤的视觉效果不佳，往往导致永久性视力丧失。部分原因是在农村环境的伤害和医疗干预与无法随时获得眼科护理的军事医学应用之间拖延了一段时间。未经治疗的损伤在眼睛失去防水密封后容易受到感染，以及因血管内低血压而丧失组织生存能力。治疗暂时密封开放球损伤，如果适当开发，也许能够恢复眼内压力和防止感染，直到适当的眼科护理是可能的。为了促进产品开发，这里详细介绍了使用前段器官培养开放地球损伤平台，用于跟踪至少 72 小时受伤后的治疗性能。猪前段组织可在定制设计的器官培养皿中保持，并按生理内压举行。穿刺伤害可以使用气动供电系统创建，该系统能够产生直径高达 4.5 mm 的伤害大小，类似于与军事相关的伤害大小。受伤后72小时可观察到眼内压力损失，确认适当的损伤感应和眼睛防水密封的损失。治疗效果可以通过在损伤感应后应用于眼睛，然后跟踪眼内压力多日来跟踪。此外，前段损伤模型适用于广泛使用的功能和生物学跟踪前段生理学的方法，如评估透明度、眼部力学、角膜上皮健康和组织生存能力。总的来说，这里描述的方法是开发生物材料疗法的必要下一步，用于在眼科护理不易获得时暂时密封开放性地球损伤。

引言

开放球 （OG） 受伤可能导致永久性视力丧失时，不治疗或至少稳定后受伤¹。然而，在偏远地区，如农村地区或军事场景中的战场上，眼科干预的渠道不易获得，因此出现延误的情况十分普遍。当治疗不是现成的时，目前的护理标准是用硬盾保护眼睛，直到医疗干预是可能的。在军事医学方面，这种延迟目前高达24小时，但预计在未来的作战行动中，在无法进行空中疏散的城市环境中，这一延迟将增加到^72小时。这些延迟可以更长的时间在农村，偏远的民用应用，在那里获得眼科干预是有限的^5，6。未经治疗的OG损伤极易感染和失去眼内压力（IOP），由于眼睛的防水密封被损害^7，8。IOP的丧失会影响组织的生存能力，如果损伤和治疗之间的^{延迟时间过}长，任何医疗干预都不太可能恢复视力。

为了在眼科专家到达之前开发易于应用的密封OG损伤治疗方法，以前开发了^10，11台式OG损伤模型。有了这个模型，高速伤害在全猪的眼睛，而IOP被压力传感器捕获。然后，可以应用治疗方法来评估他们密封OG损伤现场¹²的能力。然而，由于该模型使用整个猪眼，它只能评估即时治疗性能，无法跟踪长期性能跨越可能的72小时窗口，其中治疗必须稳定损伤部位，直到患者达到特殊护理。因此，一个前段器官培养（ASOC）OG损伤模型被开发并详细在本协议作为一个平台，跟踪长期治疗性能^13。

ASOC是一种广泛使用的技术，用于维持前段的血管组织，如角膜，在核化后多星期14，15，16，17。前段在生理IOP下维持，通过按生理流动速率给液体灌注，并在ASOC设置^18、19期间保留负责调节IOP的组织——气管网状外流区域。ASOC平台可以保持组织生理，诱导OG损伤使用气动驱动的设备，应用治疗，并跟踪损伤稳定至少72小时后受伤^13。

在此，该协议提供了使用 ASOC 平台的分步方法。首先，它详细说明了如何建立和构建ASOC平台。接下来，协议详细说明了如何无能地解剖前段并维护导管网格，然后在定制的器官培养皿中设置前段组织。然后，它详细说明了如何创建开放式地球伤害，并在受伤后立即应用治疗。最后，协议提供了一个概述的特征参数，可用于此方法，评估眼睛的功能，机械和生物特性，以及伤害稳定程度。总体而言，该模型为加快产品开发、稳定和治疗开放式地球损伤以及改善损伤后视力不良预后提供了急需的平台。

研究方案

在执行此协议之前，请注意，在研究和培训中使用动物有法律和道德要求。如果活体动物被用作眼组织来源，请在开始前获得当地道德或法律权威机构（IACUC 或道德委员会等）的批准。如果在获得动物使用批准方面有任何问题，请不要继续。我们之前确定并报告说，新鲜的猪眼获得和使用在24小时验尸相比，最接近体内生理学和表现良好，这些研究（动物技术，泰勒，德克萨斯州，美国^{）10，13。}在整个协议中，没有使用活的动物，使用组织供应商在24小时内获得组织。

注:在组织到达之前，制作器官培养皿（补充议定书1）、夹紧环（补充议定书1）、餐具支架（补充议定书1）、压力传感器数据收集设置（补充议定书2）和气动穿刺平台（补充议定书3）。消毒盘子、工具和用品，并准备工作区域。有一个非无菌区域对眼睛进行大解剖是有用的，因为它们通常附带结缔的额外轨道组织。在开放、干净的工作表面上执行这些第一步，然后无所事事地将眼睛转移到 BSC II 柜中进行微剖（柜子 #1）。最佳地，用于微解剖的 BSC II 机柜与餐盘装配件 BSC II 柜（柜式 #2）分离，以最大限度地减少气流并最大化工作空间。设置显微解剖柜，配有解剖显微镜和可视化工作表面（从柜子中伸出的相机或目镜）。

1. 消毒步骤、耗材（详情请参阅材料表）和设置

1. 准备和气体消毒以下项目（每只眼睛1套）:ASOC盘，夹环，两个流体连接器与O环，两个18G针头，四个螺丝，两个长度PE-100管（长度的距离应足够长，从孵化器内的盘延伸到注射器泵和压力传感器数据收集设置）， 两个 18 G 90° 弯曲针头，两个三向阀门。
2. 准备并自动保存以下套件。
   1. 准备和自动解剖微解剖仪器套件，包含一对细钳，一对Vannas剪刀，一对中齿钳，一对大剪刀，棉签，以及剃刀刀片或手术刀。
   2. 准备和自动化的组装仪器套件，包含一对中齿钳，一对手术剪刀和一把L键。
   3. 准备和自动化每日套件（数量:每天一个文化），包含一个L键，以收紧夹环，每天根据需要的菜肴。
   4. 自动切割四个 100 mL 烧饼，用于消毒和存储眼睛和前段。
   5. 自动将穿刺对象解密。
3. 收集以下无菌物品:培养皿（1盘/眼）、纱布（1-2/眼）、菜架、20 mL注射器（1/眼）、10 mL注射器（1/眼）、尼龙注射器过滤器（1/眼睛）。
4. 准备无菌介质: DMEM 与 4% FBS， 1x 古塔马克斯， 1x 根塔米辛， 1x 抗生素抗肌菌 （AA; 约 30-40 mL 完整媒体/眼睛）.
5. 准备 AA-PBS: PBS 与 1x AA （+500 mL）.。
6. 准备总解剖工具包:干净干燥的大手术剪刀和钳子。
7. 设置非无菌解剖工作空间:从总解剖工具包收集用品，将发能的猪眼浸入PBS和冰上，手术窗帘，100 mL烧嘴与PBS。铺好手术窗帘和大解剖所需的物品。
8. 设置无菌解剖工作空间:从微解剖仪器套件、无菌纱布、解剖显微镜、贝塔丁溶液、无菌PBS、无菌介质、四个消毒的100mL烧饼、无菌培养皿中收集耗材。无能地转移到 BSC II 机柜 #1。设置柜子，可视化解剖显微镜上的眼睛。
9. 设置 ASOC 组装工作空间:收集气体消毒套件（菜包和盖套件）、装配仪表套件、无菌介质、餐具支架、无菌培养皿、无菌注射器和注射器过滤器。无能地转移到 BSC II 机柜 #2。设置餐柜进行菜装。
10. 当眼睛稳定并准备穿刺（72小时后设置），无能地将其转移到BSC II柜。设置OG损伤感应工作空间:气动动力损伤感应装置（装配详细 附在补充3）和实验室杰克和交叉跟踪小维斯举行ASOC盘。

2. 组织解剖

1. 使用非无菌解剖工作空间准备猪组织。
   1. 从当地的屠宰场、动物研究或供应商采购被传染的猪眼。在交货期间保持对浸在 PBS 中的冰的眼睛，并在收到时立即使用。
   2. 切掉外层组织，修剪结膜，只留下角膜壳和视神经。在非无菌条件下用大手术剪刀和钳子在毛解剖工具包中执行解剖。
   3. 将眼睛放回冰上新鲜的 PBS 中，直到对实验设置所需的所有眼睛进行初步/粗切解剖。
   4. 将眼睛浸入 10% 贝塔丁溶液中，在封闭容器中浸入 2 分钟，并无所作为地转移到 BSC II 柜 #1。在无菌条件下执行所有后续工作，以最大限度地减少设置过程中的污染。
2. 无菌解剖前段。
   1. 在β丁溶液中2分钟后，将眼睛转移到无菌AA-PBS的三次连续洗涤中，以去除眼部表面多余的β丁溶液，同时保持眼部组织的不育性。洗三次后，将组织保持在AA-PBS中，直到进一步使用。
   2. 用剃刀刀片/刀片和弯曲的剪刀将眼睛切开。将眼睛放在AA-PBS浸泡的纱布上，在眼睛赤道附近用无菌剃须刀刀片或手术刀创建切口（前侧为60/40，前侧为40）。使用弯曲的手术剪刀，将眼睛分隔，以隔离前眼（角膜的一半）。
      注:前段周围的切口需要连续，以防止在器官培养中设置后产生流体泄漏的硬囊中锯齿状粗糙的边缘。
   3. 使用微丝作为铲子，从前部分挖掘活泼的幽默。使用显微镜从前段取出镜头。将前段留在 AA-PBS 中，直到进一步解剖步骤。
      注:所有将被解剖的眼睛都可以在此步骤中保持，并在解剖过程的其余部分逐一进行。
   4. 通过解剖显微镜，逐渐将虹膜切回虹膜根部，直至可见透镜网状（TM）。TM 是一种色素组织，由围绕角膜壳的纤维组成。小心地切入虹膜根部，将暴露组织下的 TM 深度。
   5. 在虹膜周围切开 360°，其深度与初始切入组织时相同，以暴露整个 TM 区域。根据需要清理覆盖 TM 的任何剩余虹膜。
   6. 修剪TM后部的辅助身体残留物，只留下一条薄薄的组织带到TM区域（约1毫米）。
   7. 将解剖前段 （AS） 放在媒体中，直到在 BSC II 柜 #2 中进一步设置 ASOC。
      注:如果单个用户正在执行解剖和器官培养菜组装，则所有眼睛都可以在 ASOC 设置之前保持此时。

3. 在器官培养皿中设置前段

1. 将单个 AS 放到带有 AS 倒置（杯具）的培养皿中。使用棉签，湿在介质和轻轻地在角膜中心涂抹，以去除任何色素。用钳子握住眼睛和同样的拭子，擦拭硬囊周围的棉签，以去除额外的色素。
2. 倒置 AS，将菜底部分放在高架区域的顶部，将角膜与盘中的高架区域围绕。将夹紧环放在新放置的 AS 的顶部。
3. 将四个螺丝放入相应的孔中，将环与环下的 AS 保持到位。用 L 键轻轻拧紧螺丝。
   注:在整个实验过程中，紧固步骤每天都会发生，因此此处初始收紧的目标是确保媒体不会泄漏，同时避免打破夹紧环。
4. 配上无菌的培养皿套装，将顶部放在菜上，并倒置设置。连接菜架。将带有 O 环的流体连接器连接到盘底的螺纹端口。
5. 在一个流体连接器上，连接一个 18 G 90° 弯曲针头、一个管子长度、一个 18 G 针头轮毂、一个尼龙注射器过滤器、一个三向阀和一个充满介质的 20 mL 注射器。
6. 在第二个流体连接器上，连接一个 18 G 90° 度弯曲针头、管子长度、18 G 针头轮毂、三向阀门以及无菌 10 mL 注射器的桶部分（这将充当从 ASOC 捕获液体和气泡的储液库）。
7. 通过向注射器适当打开三向阀门，使用第 3.5 步确定的流体连接器端口轻轻推动介质穿过系统，以充气 AS，填充管中的介质，并最终将储液池填充。
   注:如果介质泄漏到 ASOC 盘中，则 AS 的夹紧环无法足够紧密地固定。
8. 通过轻轻地将介质推入盘中并倒置盘以推出气泡并推入储层，去除气泡。
9. 放菜，直立。将培养皿的底部放在支架脚下，小心不要缠住管子。

4. 启动前段器官文化

1. ASOC现已做好孵化准备。将ASOC菜放入细胞培养孵化器（37 °C，5% CO_2）。确保压力传感器上方孵化器中的ASOC盘的高度为已知，并考虑准确计算IOP（补充协议4）。
2. 将管线引导到 37 °C、5% CO₂ 孵化器门的底部，以免干扰门的打开和关闭。将 20 mL 注射器连接到以 2.5 μL/min 为设置的注射器泵上。
3. 将管线与储层一起放置在压力传感器仪上。将侧三向阀连接到压力传感器设置，同时将 PBS 流过管道，以避免气泡进入管线。
   注:系统建立后，从储层中清空PBS，以减少器官培养期间微生物生长导致水库污染的可能性。
4. 首先确保存在用于保存数据文件的 microSD 卡，从而启动 IOP 数据收集。然后，打开压力传感器设置开始数据收集。
   注 :《补充议定书》第2条提供了设置压力传感器数据收集装置的详细信息。

5. ASOC的日常维护

1. 在 ASOC 有 24 小时的平衡后，从 37 °C、5% CO₂ 孵化器中取出盘子，并将其放入 BSC II 柜中。
   注:在压力数据采集方面，当 ASOCs 从孵化器中取出（高度变化）并在机柜中调整时，这些时间段看起来像是峰值。
2. 检查佩特里盘子上每道菜下是否有泄漏。如果存在，请检查盘下是否有紧密的流体连接，如有必要，请重新收紧。使用无菌 L 键检查盘顶部是否有泄漏，以拧紧夹紧环中的螺丝。
   注:AS硬化组织将压缩和减少厚度24小时，夹紧环将需要拧紧。
3. 把媒体从盘子里吸好。
   注:气管网状体正在过滤被泵入ASOC的介质中的流体。因此，媒体将出现在ASOC菜沿边缘。
4. 重复步骤 3.7 和 3.8 以消除任何捕获的气泡。
5. 在注射器泵上重新填充注射器，确保注射器泵运行，并确认灌注阀与 ASOC 的对齐。将 ASOC 菜肴返回到 37 °C、5% CO₂ 孵化器。
   注:最好每天执行这些步骤。但是，使用 20 mL 的介质启动体积、ASOC 盘井体积和 2.5 μL/分钟的泵速率应该足以让系统运行数天不受干扰。

6. 使用气动动力穿刺装置的OG损伤感应

注:气动穿刺装置的建造详见 补充议定书3。OG 损伤在 IOP 稳定后诱发，通常在培养 3 天后发生。可接受的 IOP 值基于生理 IOP 的 5-20 mmHg，可以通过评估 IOP 数据文件或在压力测量系统中设置 LED 指标来确定，如 补充协议 2所述。

1. 准备 BSC II 柜，以备 OG 损伤感应，详见第 1.10 步。将穿刺平台连接到压缩的空气线路。将无菌穿刺对象连接到夹头。
   注:空气压缩机可用于为设备供电，但如果压力大于 50 psi，储罐压缩空气或内置实验室线路就足够了。
2. 将穿刺平台上的压力调节器设置为 50 psi，以便对直径达 4.5 mm 的物体施加足够的穿刺力。将交叉跟踪的 vise 放置在穿刺平台前的实验室插孔上，以便在受伤感应期间保持 ASOC 盘。
3. 从 37 °C、5% CO₂ 孵化器中取出 ASOC 设置，并在取下盖子并将其放在与穿刺平台垂直的交叉跟踪边缘（图 2）中。保持前段的香水，但关闭三向阀端口到压力传感器，以防止过度加压损坏传感器。
4. 将活塞臂扩展到最大距离，并将角膜顶点放置在穿刺物体的 1 毫米以内。收回活塞臂，使前段离穿刺物体近1厘米。
   注:此距离已优化为高效伤害感应，而不会击中 ASOC 盘。
5. 打开穿刺装置并打开电磁阀，并在设备上打开第二个开关，从而点燃该穿刺装置。要收回设备，请再次按下第二个开关，从眼睛中取出穿刺装置。通过目视检查和从伤害现场泄漏的介质验证适当的伤害感应。
6. 从小盘中取出 ASOC 盘;将盖子放回盘面组装上，将流体线打开到压力传感器上。将 ASOC 放回 37 °C、5% CO₂ 孵化器中。
   注:此时，治疗可以应用于 AS，以评估其密封 OG 损伤的疗效。

7. 将 ASOC 从文化中删除

注:根据端点分析（参见 代表结果 ，了解可能的端点方法），AS 需要保持在 ASOC 盘中充气，而其他方法则要求 AS 组织与培养室隔离。下面的方法描述了如何从器官培养皿中取出 AS 并删除其余设置。

1. 从 37 °C、5% CO₂ 孵化器中取出 ASOC 菜肴。将三向阀关闭至注射器和储层，并断开管子与系统连接。丢弃注射器、储层和过滤器。将三向阀门、管子和针头轮毂放在一个单独的容器中进行清洗和消毒。
2. 断开针头与盘底的流体连接。解开流体连接器和 O 环。将所有物品放放在容器中进行清洗和消毒。
3. 使用 L 键从夹紧环中取出四个螺丝。小心地取下夹紧环。
4. 使用钳子，从盘子中取出 AS，并根据端点分析和图像，放置固定或适当的生物危害废物。

8. IOP 数据分析

1. 将 microSD 卡连接到计算机，以删除包含最新实验运行中数据 的.txt 文件。
   注:该文件在控制微控制器的代码中被命名，并且应针对每个实验进行更新（参见补充协议 2）。
2. 将数据导入电子表格。
3. 将数据组织成 12 列:11 个压力传感器通道中每个通道的时间（最小）和 mV 信号。前十个通道对应于十个ASOC实验设置。最终的传感器信号是用于传感器作为控制通道向空气开放，以确认 mV 信号不会因输入信号的变化而改变。情节控制通道与确认 mV 信号的时间始终一致。
4. 使用每个传感器初始校准产生的斜坡拦截方程将十个通道的 mV 信号转换为 mmHg（参见补充协议 4）。
5. 绘图时间（转换为天数以简化数据解释）与确定 IOP 在实验时间过程中如何波动的十个通道中的每一个。
6. 确定数据中关键点的平均 IOP 值，以便更轻松地比较每个值之间的值，以及它们在 OG 损伤诱导前后的更改方式。平均 2-3 小时的数据，每 24 小时间隔确定 IOP 在 ASOC 的每一天。
   注:代表 IOP 结果见图 4。

结果

通过光学相干断层扫描 （OCT） 拍摄的图像显示为 OG 受伤的眼睛，以说明成功的损伤感应外观。图3显示图像控制和OG受伤的AS组织受伤后立即受伤和72小时后。显示两种视图:通过伤害部位的横截面图像和自上而下的最大强度投影 （MIP），以可视化图像的表面积。控制眼睛显示角膜没有明显的损伤，而明显的损伤可以位于OG受伤后穿过整个角膜。从 MIP 中，很明显，损伤在形状...

讨论

ASOC OG 伤害平台有关键步骤，应予以强调，以提高使用该方法时成功的可能性。首先，在前段解剖过程中，保持导管网格是必不可少的，但要正确处理是具有挑战性的。如果 TM 中断，眼睛将无法维持生理压力，也不符合实验使用的资格标准。建议首先在正常条件下进行解剖过程，而不是引入额外的无菌技术挑战，直到获得适当的解剖。其次，在设置 ASOC 菜肴时，必须足够紧，以防止液体泄漏，但?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector	McMaster-Carr	51525K431
10-32 Socket cap screw, ½"	McMaster-Carr	92196A269
10 mL syringe	BD	302995
20 mL syringe	BD	302830
Anti-Anti	Gibco	15240-096
Ball-End L key	McMaster-Carr	5020A25
Betadine	Fisher Scientific	NC1696484
BD Intramedic PE 160 Tubing	Fisher Scientific	14-170-12E
Cotton swabs	Puritan	25-8061WC
DMEM media	ATCC	30-2002
FBS	ATCC	30-2020
Fine forceps	World Precision Instruments	15914
Gauze	Covidien	8044
Gentamicin	Gibco	15710-064
Glutamax	Gibco	35050-061
High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID	McMaster-Carr	5233T47
Large forceps	World Precision Instruments	500365
Large surgical scissors	World Precision Instruments	503261
Medium toothed forceps	World Precision Instruments	501217
Nail (puncture object)	McMaster-Carr	97808A503
Nylon syringe filters	Fisher	09-719C
PBS	Gibco	10010-023
Petri dish (100 mm)	Fisher	FB0875713
Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock	Fisher	NC9593742
Razor blade	Fisher	12-640
Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle	McMaster-Carr	75165A81
Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle	McMaster-Carr	75165A675
Sterile 100 mL beakers with lids	VWR	15704-092
Vannas scissors	World Precision Instruments	WP5070