测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物:评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型

摘要

从先前冷冻的存档固体组织中制备富含线粒体的样品，使研究人员能够以各种实验方式对线粒体进行功能和分析评估。这项研究展示了如何从冷冻的心脏组织制备富含线粒体的制剂，并对线粒体进行分析评估。

摘要

线粒体电子转移复合物（ETC）谱在运动母猪所生后代的心脏组织中被修改。提出并测试的假设是，在怀孕期间母猪的定期母体运动将增加后代心脏生物能量的线粒体效率。通过使用轻度分离程序分离线粒体来评估线粒体ETC和超复合物谱，以测试该假设。这里描述的程序允许处理先前冷冻的存档心脏组织，并消除了新鲜线粒体制备评估线粒体ETC复合物，超复合物和ETC复合物活性谱的必要性。该协议描述了使用蓝天然凝胶电泳进行基于多重抗体的免疫印迹和超复杂评估中的最佳ETC蛋白复合物测量。

引言

该协议的目标是提供详细的步骤，通过一种低能机械破坏组织的新技术从先前冷冻的心脏组织中获得富含线粒体的制剂，从而改善组织裂解和线粒体的提取。通过这种方法，可以在不产生高剪切应力或高温的情况下提高提取效率，并且均质时间短（10-12秒）^可实现1。

从存档的冷冻组织中获得线粒体是进行功能² 和生化研究3的宝贵资产^， 否则在确切的实验条件下不容易重复。经典的Potter-Elvehjem特氟龙杵玻璃均质机或Dounce均质机已被使用，并且仍在研究实验室中使用，以均质化肝脏，肾脏和大脑等软组织。然而，肌肉和心脏等硬组织均质化需要更多的均质时间，酶处理，高速均质和丰富的用户体验。这对于从肌肉和心脏等硬组织中提取完整的细胞器（如线粒体）是不利的。该方案中描述的方法用于获得高产量的富含线粒体的制剂，以分析线粒体电子传递链（ETC）蛋白质复合物及其在从运动和久坐不动的母猪出生的后代收获的心脏组织中的超复合物形成，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。该方法允许用户从先前冷冻的存档组织中分离出富含线粒体的制剂。

外界纳米材料暴露于妊娠期啮齿动物会对后代的心脏功能、线粒体呼吸和生物能量产生负面影响⁴。然而，有氧运动诱导的妊娠期胎儿肌细胞生物能量的积极变化尚未得到证实。然而，新兴研究提供证据表明，孕产妇在怀孕期间进行有氧运动对胎儿心脏功能有积极影响⁵。为了提供进一步的证据，分析了妊娠期间母体运动对后代心脏线粒体呼吸链复合物（即复合物I至复合物V）的纵向影响。

这项研究具有重要的健康相关性，因为结果可能表明母亲的运动可以提高后代心脏线粒体的能量产生效率。在这项研究中，母猪（母猪）被用作动物模型有两个原因:（i）心脏生理学与人类相似⁶，以及（ii）根据机构IACUC批准，从不同时间点的后代收获心脏组织是可行的。拟议的研究旨在回答许多基本问题，这些问题与母亲的运动及其对后代心脏组织的细胞和生化组成的潜在积极影响有关。这种方法需要温和而有效的线粒体分离技术，这些技术来自先前冷冻的心脏组织，这些研究来自冗长且昂贵的纵向研究，这些研究解决了怀孕期间胎儿心肌细胞内生物能量变化的问题。本研究中描述的方法允许利用大量先前冷冻的存档组织进行富含线粒体的制备，以进行分析和功能研究。该研究还将通过提供初步数据来帮助填补该领域的知识空白，这可能导致未来的研究确定孕产妇运动对子宫内外心脏健康的影响。

研究方案

冷冻的后代心脏组织从Sean Newcomer博士那里收到了机构IACUC的批准函。心脏组织来自长期纵向研究，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。所有关于后代心脏组织处理的协议都遵循堪萨斯城大学IBC和IACUC委员会的指导方针。

1. 缓冲液和试剂的制备

注:按照制造商的指南准备所有样品。在所有配方和实验步骤中使用超纯水或等效水。在此过程中，请佩戴个人防护装备（实验室手套、口罩、手套和护目镜/面罩）。缓冲液体积适用于处理六个组织样品。

1. 通过组合154.035g蔗糖（0.3 M最终），3.904gHEPES（10mM最终），0.111gEDTA（0.2mM最终）来制备1.5L组织洗涤缓冲液。在搅拌板上将配料加入1.0L水中，用稀释的HCl将pH值调节至7.2，并将化妆品至最终体积至1.5L。
   注意:每个样品大约需要200 mL洗涤缓冲液（50-300mg）。一天可以处理六个组织样本。使用剩余的洗涤缓冲液制成隔离缓冲液。
2. 通过在210 mL洗涤缓冲液中加入210mg BSA，从先前在步骤1.1中描述的洗涤缓冲液中制备分离缓冲液。用稀释的NaOH溶液调节pH值至7.4。
   注意:每个组织样品需要约35 mL分离缓冲液;因此，6个样品需要210 mL分离缓冲液。通过在制备当天加入新鲜的BSA溶液（1mg / mL最终）来制备该缓冲液。BSA用于分离线粒体，因为它通过去除天然解偶联物（如游离脂肪酸）来改善线粒体特性。已经发现BSA通过增加脑线粒体中底物（尤其是琥珀酸盐）的氧化速率而具有抗氧化活性⁷。或者，牛血清白蛋白可以被较便宜的无酸类似物如卵清蛋白取代。
3. 通过组合0.011gEDTA（终浓度为0.2mM EDTA或使用150μL200mM储备EDTA溶液用于150mL重悬缓冲液），12.836g蔗糖（0.25M蔗糖终浓度）和0.236gTris（10mM Tris-HCl最终浓度）来制备150mL重悬缓冲液。用0.1 N NaOH调节pH值至7.8。使用前加入60μL蛋白酶抑制剂混合物。
4. 通过将7.5mg胰蛋白酶溶解在3.0mL 1mM HCl（2.5mg胰蛋白酶/ mL最终）中来制备胰蛋白酶溶液。对于一个样品，此量足够了。
   注意:根据计划处理的组织样本数量准备胰蛋白酶溶液。
5. 通过将13.0mg胰蛋白酶抑制剂与含有BSA的20mL分离缓冲液（0.65mg / mL胰蛋白酶抑制剂最终）混合，从大豆制备胰蛋白酶抑制剂溶液。
   注意:准备新鲜的胰蛋白酶抑制剂溶液。
6. 通过将0.1g过硫酸铵加入1mL水中（10%过硫酸铵最终）来制备过硫酸铵试剂。
   注意:过硫酸铵试剂应新鲜制备，或者可以等分大体积并保存在-20°C冰箱中。
7. 通过将0.131g6-氨基己酸在1.0mL超纯水中混合并将其储存在4°C（1M 6-氨基己酸最终）中来制备氨基己酸溶液（ACA）。
8. 通过将1gCoomassie G-250溶解在0.5mL水中和0.5mL 1M氨基己酸（10%染料溶液终浓度）来制备考马斯亮蓝色染料溶液。
9. 为蓝色原生页面（BN-PAGE）准备5%的地铂苷。大致计算样品制备中需要多少洋地黄素以及一些额外的体积来抵消移液误差（高估10mg）。对于15mg:首先，将15mg洋地黄素稀释在30μL100%DMSO中。涡旋帮助洋地黄素进入溶液。接下来，加入剩余的90%的_ddH2O（270μL）。轻轻加热以混合溶液（涡旋），然后在冰上冷却。
10. 准备本机 PAGE 阳极缓冲区。将 50 mL 20x 原生 PAGE 电泳缓冲液加入 950 mL 水中，使最终体积达到 1 L。准备新鲜阳极缓冲液以便立即使用。将其用作 1x 运行缓冲区。
11. 准备深蓝色阴极缓冲液。将0.0160克考马斯亮蓝色G-250溶解在80毫升天然PAGE阳极缓冲液中;混合均匀。
    注意:准备新鲜的阴极缓冲液，以便立即使用。可能只需要 60 mL，但在发生任何泄漏时，请额外加 20 mL。
12. 准备浅蓝色阴极缓冲液。将20 mL深蓝色阴极缓冲液加入180 mL原生PAGE阳极缓冲液中并充分混合。
    注意:此缓冲区只能使用一次。
13. 制备5%考马斯G-250作为样品添加剂。用200μL1 M ACA稀释200μL已经制成的10%考马斯储备液（步骤1.8），并储存在4°C。
14. 将 40% 甘油、0.04% Ponceau S、25 mM Tris-HCl （pH 6.8）、192 mM 甘氨酸与 10 mL 最终体积混合，制备 4x 原生 PAGE 样品缓冲液。将它们等分并储存在-20°C的冰箱中。

2. 从冷冻心脏组织中分离线粒体

注意:在4°C的冷室中执行线粒体分离程序。但是，如果冷藏室不可用，请使用大尺寸的冰浴来执行该过程。

1. 从-80°C冰箱中取出先前冷冻的心脏组织样品。
   注意:在给定的一天内，最多可以舒适地处理四个组织样本以进行线粒体分离。
2. 称量含有心脏组织样本的管子并记录重量。准备三个烧杯（每个50毫升），其中包含40毫升洗涤缓冲液。将每个烧杯放入冰盐浴中，将等量的冰和盐混合3-5分钟，然后继续下一步。将磁力搅拌棒放入每个烧杯中，并将搅拌器设置为中速。
   注意:不要过度冷冻烧杯，并在冰晶云开始出现后立即使用。
3. 将冷冻的心脏组织直接放入第一个烧杯中的冰冷溶液中。等待约5分钟，同时搅拌并使用镊子对组织施加轻微压力，以尽可能多地排出血液。
4. 称量空管并从原始重量中减去（步骤2.2）以获得心脏组织的净重。
5. 用镊子取出纸巾，用干净的滤纸巾挤压心脏以除去血液。然后，将纸巾放入第二个烧杯中。搅拌时等待约5分钟，以除去多余的血液。
6. 在纸巾上轻轻擦干纸巾。去除所有脂肪、凝血、耳廓和筋膜（白色组织）。然后，池化心室组织。
7. 按照步骤2.7.1-2.7.9使用碎纸机粉碎组织样品。
   1. 将心脏组织（〜50-300mg）从冲压侧放入组织粉碎室中。

图1:与碎纸机一起使用的组织碎纸机室（管）。 在碎纸机管中进行组织均质化需要每个组织样品约10-12秒。一旦均质化组织通过穿孔的圆盘进入上腔室，组织均质化就完成了。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 向管的盖子侧加入~0.2-0.8 mL洗涤缓冲液。
   注意:确保在粉碎过程中样品和洗涤缓冲液的总体积不超过0.7-0.8 mL。
3. 使用管状工具将碎纸机室与碎纸机盖紧紧地盖住。
   注:不要过度拧紧碎纸机盖。
4. 将碎纸机室放入碎纸机支架单元中，压锤面朝下。冲压板将啮合碎纸机支架中的配件。
5. 插入碎纸机驱动程序的位;让钻头与碎纸机盖啮合。确保钻头已牢固锁定到位。
   注:始终使用充满电的碎纸机驱动程序。
6. 手动向下对碎纸机驱动器和碎纸机室施加压力，直到碎纸机支架上的压力指示器达到碎纸机支架上约2的设置。
   注意:如果切碎组织纤维性更强，则该设置可以处于较高水平。
7. 按下碎纸机驱动程序的扳机，同时将设置保持在 2，从而运行碎纸机驱动程序约 10-12 秒。
8. 查看管子，通过观察管子来检查组织的全部或大部分固体质量是否通过裂解盘被切碎并进入碎纸机室的上腔室。
   注意:可能需要将组织样本切碎更长时间。只需将管子放回碎纸机支架并继续该过程即可。大多数种类的组织样品只需要10-12秒的切碎。虽然所有切碎都会因摩擦而产生一些热量，但这种较短的处理时间不会显着加热样品。
9. 粉碎样品后，将碎纸机室从支架单元中取出。使用管工具取下碎纸机盖，并将其放在干净的表面上以备后用。
   注意:碎纸机盖应被视为被样品提取物污染，并且根据样品类型，可能被传染性物质污染。不要对任何其他组织样品使用相同的碎纸机盖，以防止交叉污染。

8. 将切碎的心脏组织转移到第三个烧杯中，加入40 mL洗涤缓冲液和搅拌棒，并在搅拌板上以中速搅拌组织5分钟。
9. 通过尼龙网单丝（孔径为74μm）过滤悬浮液并丢弃滤液。用10 mL洗涤缓冲液在过滤器上洗涤切碎的组织3x。
   注意:确保尼龙网单丝已用水预润湿。
10. 将洗涤和切碎的组织转移到装有20 mL洗涤缓冲液的50 mL烧杯中，并将烧杯置于磁力搅拌器上的冰浴中。加入0.5mL胰蛋白酶溶液，同时不断搅拌15分钟。在孵育大约一半（约7.5分钟）时，将组织悬浮液转移到松散安装的手持式玻璃对玻璃均质器中，该均质器将容纳0-15mL的体积。

图1:与碎纸机一起使用的组织碎纸机室（管）。 在碎纸机管中进行组织均质化需要每个组织样品约10-12秒。一旦均质化组织通过穿孔的圆盘进入上腔室，组织均质化就完成了。 请点击此处查看此图的放大版本。

11. 用4-5次行程轻轻均匀化，以分散悬浮液而不会产生泡沫。将匀浆放入50 mL烧杯中，在4°C下在搅拌板上轻轻混合15分钟。
12. 孵育15分钟后，将含有胰蛋白酶抑制剂的10mL分离缓冲液加入含有匀浆的烧杯中，并在4°C下孵育1分钟，同时轻轻搅拌。
13. 通过尼龙过滤器再次过滤悬浮液，并将滤液保存在50 mL锥形管中。
14. 收集留在尼龙过滤器上的颗粒部分，并将其放入玻璃对玻璃均质机中。加入15-20 mL洗涤缓冲液，用手轻轻匀浆25-30秒。
    注意:在此步骤中，滤液流动非常缓慢。为了增加滤液流量，请将漏斗尖端与锥形管的内部接触。
15. 将匀浆与滤液混合，平衡管，并在4°C下以600× g 离心15分钟。
16. 使用尼龙过滤器将所得的上清液过滤到新的锥形管中，以避免颗粒污染。在4°C下以8，500× g 再次运行离心机15分钟。
    注意:使用塑料转印移液管除去上清液，并从蓬松的沉淀顶部处处死0.2mL上清液。
17. 弃去上清液并用1mL分离缓冲液冲洗沉淀2-3次。确保每次都丢弃蓬松的白色外缘层。
    注意:使用带有1 mL吸头的移液器或新的转移移液器加入分离缓冲液来洗涤沉淀。将缓冲液添加到管的侧面，而不是直接在沉淀物上，以防止颗粒破裂并防止上清液的污染。接下来，用移液器吸出缓冲液，并重复该过程两次。
18. 向每管中加入5 mL分离缓冲液，并使用带有1 mL吸头的移液器或新的转移移液器分解沉淀。
19. 用20mL额外的分离缓冲液稀释悬浮液，并在4°C下以8，500× g 再次运行离心机15分钟。
20. 弃去上清液并将沉淀重悬于5mL的重悬缓冲液中。然后，再加入15mL缓冲液，共20mL，并在4°C下以8，500× g 离心15分钟。 丢弃上清液。得到的棕色颗粒含有洗净的完整线粒体。
21. 将富含线粒体的沉淀重悬于250μL重悬缓冲液中，包括蛋白酶抑制剂。等分试样在25μL中，在液氮中快速冷冻，并在-80°C深冰箱中储存数年。
    注意:备用5μL富含线粒体的制剂用于蛋白质分析测定。对于BN-PAGE（蓝色天然页面）研究，将重悬的沉淀等分到每管50μg线粒体蛋白中。在4°C下以8，500× g 离心15分钟。 小心地吸出上清液并将线粒体沉淀（50μg蛋白质/等分试样）储存在-80°C深冰箱中数年。

3. 线粒体电子转移复合物（ETC）评估

注意:单个线粒体 ETC 蛋白（即复合物-I、II、III、IV、V）可通过标准免疫印迹测定进行评估。由于样品种类繁多（4个时间点:48小时，3个月，6个月，9个月），两种实验条件（运动和久坐）和许多免疫探测抗体（五种抗体），建议进行多重免疫印迹。执行多重免疫印迹，如下所示。

1. 在4%-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（100 V，90分钟）中解析50μg线粒体富集蛋白质样品/孔。
2. 将蛋白质转移到PVDF膜上（75 V;60分钟）
3. 在4°C下将膜阻断在封闭缓冲溶液中至少1小时。
   注意:在4°C下，阻断时间可以延长至最过夜。 封闭缓冲液（材料表）含有非哺乳动物成分（即鱼类蛋白），这些成分不太可能与抗体以及典型方法中存在的其他哺乳动物蛋白具有特异性结合相互作用。
4. 用抗体混合物（包括抗复合物-I，II，III，IV，V抗体）探测膜，并在4°C的轨道振荡器上孵育过夜。
5. 第二天，在室温（室温）下在轨道振荡器上用IR标记的二抗洗涤膜和探针2小时。
6. 用1x TBS-T（含有吐温20的TBS）洗涤五次，用1x TBS（Tris缓冲盐水）洗涤一次。
   注意:对于最后一次洗涤，请勿在TBS缓冲液中加入洗涤剂。
7. 在图像分析器中对印迹进行成像。

4. 蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）的线粒体超复合物评估

注意:ETC的超复杂轮廓也可以通过使用BN-PAGE技术进行评估。

1. 准备样品缓冲液混合物，用于每50μg线粒体富集蛋白（7μL水+ 5μL4x天然聚丙烯酰胺凝胶电泳样品上样缓冲液+ 8μL5%Digitonin + 2μL考马斯G-250）。制备20μL样品缓冲液。
   注意:根据可用样品的数量（50μg蛋白质/样品）制作储备样品缓冲液鸡尾酒。根据富含线粒体的沉淀物的蛋白质浓度选择适当的洋地黄素量（表1）⁸。
2. 将洋地黄素储备在95°C下加热3分钟，混合，并在冰上冷却，然后制成预混液。
3. 在将样品上样到凝胶中之前加入考马斯G-250样品添加剂。
4. 在含有50μg线粒体蛋白沉淀的管中加入20μL样品缓冲液混合物。通过用移液器轻轻混合沉淀来溶解/重悬沉淀，而不会产生泡沫。
5. 将混合物在冰上孵育20分钟，以实现富含线粒体的沉淀的最大增溶。不时地轻轻拂管以增强溶解。
6. 在等待孵育时，准备原生PAGE阳极缓冲液/ 1x运行缓冲液和深蓝色阴极缓冲液。
7. 在4°C下以20，000× g 离心增溶的富含线粒体的沉淀10分钟。
8. 离心后，将15μL上清液收集到放置在冰上的新管中。
9. 将适量的5%考马斯G-250试剂加入到步骤4.8中获得的上清液中（参见 表1）。
   注意:5%的考马斯G-250体积应使染料的最终浓度为洗涤剂浓度的1/4。在将样品上样到凝胶中之前执行此步骤。

蛋白	洋地黄素/蛋白质	4x 样品缓冲液	5%地黄素	水	最终卷	5%考马斯G-250
	比率（克/克）					样品添加剂
50微克	8	5	8	7	20	2
50微克	4	5	4	11	20	1

表1:使用两种不同的洗涤剂/蛋白质比例制备样品缓冲液混合物。 为了从线粒体悬浮液中实现膜蛋白的最大溶解，应将洋地黄素/线粒体悬浮液蛋白浓度调节至4-8g洋地黄素/g蛋白之间。在心脏组织中，使用400μg洋地黄素用于50μg线粒体悬浮蛋白（即8g洋地黄素/ g线粒体蛋白）以最大化线粒体悬浮液的超复合物的溶解度。

10. 倒入3%-8%梯度凝胶，取出梳子，并用1x电泳缓冲液洗涤凝胶孔3次。
    注意:如果前一天浇注，凝胶的聚合效果最好。
11. 设置电泳系统并将凝胶置于设备中。
12. 用深蓝色阴极缓冲液填充样品孔。
13. 在凝胶的第一个和最后一个孔上加载10μL未染色的蛋白质标准品作为天然分子量标记物。
14. 使用平头凝胶上样尖端将上述步骤4.9中制备的样品上清液+考马斯样品添加剂的全部量加载到孔中。
15. 小心地用约60 mL深蓝色阴极缓冲液填充迷你细胞缓冲液，而不会干扰孔中的样品，然后用天然PAGE 1x电泳缓冲液填充缓冲液。
16. 打开电源，在150 V下电泳样品约30分钟。
17. 使用转移移液管从缓冲坝（内腔）中取出深蓝色阴极缓冲液或吸出样品孔。用150-200 mL浅蓝色阴极缓冲液填充内腔，并在250 V下电泳60分钟。
    注:电泳时间可通过检查染料前部何时在凝胶盒底部上方0.5 cm处迁移来确定。
18. 从凝胶盒中取出凝胶，并将其放在干净的塑料容器中。用优质蒸馏水在摇臂/轨道摇摇杯上洗涤凝胶15分钟。
    注:要从暗盒中取出梯度凝胶，请从底部处理暗盒，该凝胶更强，以最大程度地减少破损的机会。
19. 倒出水，将凝胶浸入足够量的Coomassie GelCode Blue染色试剂中，并在室温下在轨道/摇臂上孵育1小时。
    注意:使用前，通过轻轻旋转瓶子几次，混合蓝色污渍试剂（材料表）溶液。
20. 滗水染料溶液，加入蒸馏水，用水冲洗几次，然后放在轨道/摇臂上进行脱色。
    注意:将一块海绵（~3 cm x 0.5 cm）插入凝胶脱色容器中，然后离开凝胶过夜去污。海绵吸附染料颗粒，无需多次换水。
21. 在图像分析仪中分析凝胶。

5. 通过免疫印迹分析评估线粒体超共混物

1. 在电泳结束时进行一组新的BN-PAGE而不染色凝胶。
2. 按照与第3部分相同的程序（线粒体电子转移复合物（ETC）评估）完成免疫印迹。

结果

按照方案，从心脏组织制备了富含线粒体的蛋白质混合物的良好产量。从母猪后代收获的平均1.2g冷冻心脏组织中获得约15mg / mL富含线粒体的蛋白质混合物。观察表明，少于0.5g的冷冻心脏组织没有产生足够量的富含线粒体的蛋白质混合物以进行BN-PAGE测定。线粒体制剂的量足以进行（i）用于评估单个电子转移复合物（ETC）（即复合物-I，II，III，IV和复合物-V）的标准免疫印迹分析，（ii）通过BN-PAGE?...

讨论

此处指明了此协议的关键步骤。首先，应仔细处理组织均质化，以便在组织均质过程中不会施加过多的纯粹效应。应使用组织粉碎机，这是用于初始组织均质的压力循环技术（PCT）的一部分⁹。该步骤将减少玻璃对玻璃均质机的过度中风周期（图1B），由于冷冻组织条件，可能会进一步破坏已经脆弱的线粒体。其次，冷冻组织重量对于获得足够量的富含线粒?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino caproic acid	Sigma/Aldrich	A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit	Invitrogen	458199
anti-VDAC antibody	abcam	ab15895	use 1 µg/mL
Coomassie G-250	ThermoSientific	20279
Coomassie GelCode Blue	ThermoScientific	24592
Digitonin	Cabiochem	300410
Glass-Glass pestle homogenizer	VWR	KT885451-0020
Image Studio	LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab	LICOR	LC0725
Multiwell plate reader	BioTek	Synergy HT
Native molecular weight marker	ThermoFisher	BN2001
Nylon mesh monofilament	Small Part Inc	CMN-74
Orbital shaker	ThermoScientfic
PCT Shredder	Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer	ThermoScienctific	37527
Shredder PULSE Tube	Pressure Bioscience Inc	FT500-PS
Table top centrifuge	Eppendorf	5418
Trypsin	Amresco	M150-1G
Trypsin inhibitor	Amresco	M191-1G	Requires fresh preparation