优化视网膜静脉遮挡小鼠模型以限制变异性

摘要

在这里，我们描述了使用孟加拉玫瑰和激光引导视网膜成像显微镜系统进行视网膜静脉阻塞的优化方案，并建议最大限度地提高其在转基因菌株中的可重复性。

摘要

视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型通常用于眼科研究神经视网膜中的缺氧缺血损伤。在本报告中，提供了一种详细的方法，指出了关键步骤，并提供了优化建议，以在不同转基因小鼠品系中实现一致的成功闭塞率。RVO小鼠模型主要包括静脉内施用光敏剂染料，然后使用连接到眼科引导激光的视网膜成像显微镜进行激光光凝。三个变量被确定为遮挡一致性的决定因素。通过调整孟加拉玫瑰给药后的等待时间并平衡基线和实验激光输出，可以限制实验之间的变异性，并获得更高的遮挡成功率。该方法可用于研究以视网膜水肿和缺氧缺血性损伤为特征的视网膜疾病。此外，由于该模型诱导血管损伤，它也可以应用于研究神经脉管系统、神经元死亡和炎症。

引言

视网膜静脉阻塞 （RVO） 是一种常见的视网膜血管疾病，2015 年影响了全球约 2800 万人¹。RVO导致工作的老年人和老年人视力下降和丧失，这是一种持续的视力威胁疾病，估计在近十年内会增加。RVO 的一些不同病变包括缺氧缺血性损伤、视网膜水肿、炎症和神经元丢失²。目前，这种疾病的一线治疗是通过给予血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂。虽然抗VEGF治疗有助于改善视网膜水肿，但许多患者仍面临视力下降³。为了进一步了解这种疾病的病理生理学并测试潜在的新治疗线，需要为不同的小鼠品系构建功能性和详细的RVO小鼠模型方案。

已经开发了小鼠模型，实现了与人类患者相同的激光设备，并与缩放到鼠标正确尺寸的成像系统配对。这种RVO小鼠模型于2007年首次报道4^，并由Ebneter^等人4^，5进一步建立。最终，Fuma等人对该模型进行了优化，以复制RVO的关键临床表现，例如视网膜水肿⁶。自该模型首次报道以来，许多研究已经使用它，使用光敏染料，然后用激光对视网膜主要静脉进行光凝。然而，在使用这种方法的研究中，施用染料的数量和类型、激光功率和暴露时间差异很大。这些差异通常会导致模型的可变性增加，使其难以复制。迄今为止，还没有已发表的研究详细说明其优化的潜在途径。

本报告介绍了 C57BL/6J 菌株中的 RVO 小鼠模型的详细方法和他莫昔芬诱导的内皮半胱天冬酶 9 敲除 （iEC Casp9KO） 菌株，具有 C57BL/6J 背景，与 RVO 病理学相关，作为转基因小鼠的参考菌株。先前的一项研究表明，内皮半胱天冬酶-9的非凋亡激活会引起视网膜水肿并促进神经元死亡⁸。使用该菌株的经验有助于确定并提供对潜在修改的见解，以定制RVO小鼠模型，该模型可适用于其他转基因菌株。

研究方案

该协议遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监测。

注意:所有实验都使用重约20g的两个月大的雄性小鼠。

1.他莫昔芬用于絮状基因诱导遗传消融的制备和给药

注意:视网膜血管直径可能受动物体重的影响。确保用于实验的所有动物的体重相似。

1. 将他莫昔芬在玉米油中稀释至20mg / mL的浓度。
   注意:他莫昔芬是一种有毒物质，对光敏感。避光，例如用铝箔。
2. 涡旋溶液几秒钟。
3. 在55°C的烤箱中放置15分钟。
   注意:确保他莫昔芬已完全溶解。可能需要额外的涡旋。
4. 将溶液在4°C下储存长达1周。
5. 使用装有 26 G 针头的 1 mL 注射器进行他莫昔芬注射。用70%乙醇清洁注射区域。 根据特定的诱导性Cre线，每天一次腹膜内（IP）给予2mg他莫昔芬（100μL的20mg / mL），在确定的时间内。
6. 在开始实验之前，让动物休息两天。

2. 激光光凝试剂的制备

1. 孟加拉玫瑰
   注意:孟加拉玫瑰对光敏感。在黑暗中存放直至使用，并准备新鲜以获得最佳效果。
   1. 通过在无菌盐水中将其稀释至5mg / mL来制备孟加拉玫瑰，并通过0.2μm注射器过滤器过滤。
   2. 准备装有26 G针头的1 mL注射器，其中装有孟加拉玫瑰。
2. 氯胺酮/甲苯噻嗪
   1. 在无菌盐水中相应地稀释氯胺酮和甲苯噻嗪，浓度如下:氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg）。
3. 卡洛芬
   1. 在无菌盐水中将卡洛芬稀释至 1 mg/mL。
   2. 准备装有 26 G 卡洛芬针头的 1 mL 注射器。
4. 无菌生理盐水
   1. 准备装有无菌盐水的 26 G 针头的 5 mL 注射器。

3. 激光设置

1. 轻轻处理光纤电缆并将其连接到视网膜成像显微镜的激光控制盒和激光适配器。
2. 打开视网膜成像显微镜灯盒。
3. 打开计算机并打开映像程序。
4. 使用一张白纸将其放在鼠标目镜前，然后单击成像程序中的 "调整"来调整 白平衡。
5. 通过转动钥匙并按照激光控制盒屏幕上的说明打开激光控制盒。
   注意:本实验中使用的激光是3B级，可能会造成眼睛损伤。操作激光器时佩戴护目镜。
6. 验证基线激光功率。
   1. 使用激光功率计。
   2. 将激光控制盒的屏幕调整为以下参数:50 mW 和 2，000 ms。
   3. 打开激光并将功率计放在目镜前面。
      注意:在测试基线激光功率时，请确保显微镜灯关闭。
   4. 踩下脚踏踏板以激活激光。
   5. 目标是激光功率读数为 13-15 mW。
      注意:激光功率读数将决定视网膜静脉阻塞的成功率。如果激光功率读数太低，可以调整激光曝光的功率和时间。有关建议，请参阅 表 1 。
7. 通过为以下参数设置激光 控制盒的屏幕 来调整实验激光功率:100 mW，1，000 ms。
8. 关闭激光。
   注意:为了安全起见并防止过热，最好在鼠标之间关闭激光。

4.鼠尾静脉注射孟加拉玫瑰

1. 将 300 mL 水倒入 500 mL 烧杯中。
2. 在微波炉中加热烧杯1分钟。
3. 将纱布放入烧杯的温水中。
4. 将鼠标放入约束器中。
5. 将纱布轻轻按入鼠标尾巴，寻找扩张的静脉。温水扩张后，使用酒精擦拭对注射部位进行消毒。
6. 将针头插入注射部位并拉动注射器以确保您在静脉中。然后，注射小鼠尾静脉，根据动物的体重（37.5mg / kg）施用正确的量。在注射部位施加压力以避免血肿或出血。擦除站点。
7. 将鼠标从约束器中释放并放回笼子中。
8. 在注射麻醉剂之前，让孟加拉玫瑰循环8分钟。
   注意:这将在孟加拉玫瑰注射和激光照射之间提供总共10分钟。

5.大静脉闭塞

1. 打开加热的鼠标平台。
2. 每只眼睛加入一滴去氧肾上腺素和托吡卡胺。
3. 注射 150 μL 麻醉剂、氯胺酮 （80-100 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （5-10 mg/kg） IP。
   注意:在此过程中，鼠标被给予两次IP注入。因此，双方交替进行。麻醉用腹腔注射至右下腹，生理盐水注射至左下腹。建议在注射前拉动注射器，以确保针头在腹部而不是任何器官。
4. 用脚趾捏住动物以确定麻醉深度，然后等到它没有反应。
5. 每只眼睛加入一滴盐酸丙帕卡因（镇痛药）。
6. 在双眼中添加凝胶软膏。
7. 在耳朵之间皮下注射 150 μL 卡洛芬。
8. 将鼠标放在平台上。
9. 调整平台，直到视网膜眼底的视野清晰且聚焦。
10. 计数视网膜静脉并拍摄眼底图像。
    注意:视网膜静脉比动脉更暗更宽。静脉和动脉交替;然而，有时可能有一个靠近视神经的分支动脉，因此有两个相邻的动脉。
11. 打开激光，对准距离视盘约375μm的视网膜静脉。
12. 通过按下脚踏开关并将激光束稍微移动到 100 μm 来照射容器。重复此步骤三次，并在每个脉冲后移动激光束，以使照射不会聚焦在一个点上。
13. 对其他主要血管重复照射，以达到2-3次闭塞。

6. 确定第 0 天阻塞的静脉数量

1. 照射容器后关闭灯并等待10分钟。
   注意:光照会导致视网膜损伤和炎症;在等待期间关闭灯，以尽量减少暴露⁷.
2. 重新打开灯并计算阻塞的静脉数量。
3. 拍摄眼底图像。

7. 善后

1. 注入 1 mL 无菌盐水 IP。
   注意:请参阅第 5 节步骤 3 中的 IP 注入详细信息。
2. 在双眼中添加润滑性眼药水。
3. 在双眼中添加凝胶软膏。
4. 观察小鼠从麻醉中恢复，并且在完全恢复之前不要将其与其他动物一起放回笼子。卡洛芬（5毫克/千克）可以在手术后2天内每天服用。如果应用于人类，疼痛不是RVO的症状。
   注意:在动物从麻醉中完全恢复之前，不要让它们无人看管。

8. 通过光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜水肿

注意:此步骤可以在调查员感兴趣的时间点完成。C57BL / 6J小鼠的视网膜水肿峰值是RVO手术后1天。此时间点可能因鼠标的背景而异。

1. 打开视网膜成像显微镜灯箱、OCT机和加热鼠标平台。
2. 遮挡后的第二天，按照步骤5.2至5.7准备动物。
3. 打开映像和 OCT 软件程序。
4. 在 OCT 程序中，将微移调整为 5。
5. 在烧伤远端75μm处取OCT或点击4次。
6. 在视网膜的四个象限拍摄OCT图像。
7. 使用跟踪软件分析 OCT 图像。
8. 将预照射测量的视网膜厚度与RVO后1天或感兴趣的时间点进行比较。
   注意:在分析数据时，请考虑照射的静脉数量，因为这会影响视网膜水肿的发展。然后通过施用麻醉剂然后进行灌注非生存手术对动物实施安乐死。

结果

RVO小鼠模型旨在成功实现视网膜静脉闭塞，导致缺氧缺血损伤，血液视网膜屏障破裂，神经元死亡和视网膜水肿⁸。 图1 显示了确保可重复性的步骤时间表，实验设计的示意图，并概述了可以根据实验问题进一步优化的步骤。可以修改的三个主要步骤是孟加拉玫瑰给药后的等待时间、基线激光功率和实验激光输出。在本报告中，C57BL / 6J小鼠以及来自诱导性?...

讨论

小鼠RVO模型为进一步了解RVO病理学和测试潜在治疗方法提供了途径。虽然鼠标RVO模型在该领域被广泛使用，但需要模型的当前详细协议来解决其可变性并描述模型的优化。在这里，我们提供了一个指南，其中包含经验示例，说明可以改变哪些内容，以便在一组实验动物中获得最一致的结果，并提供可靠的数据。

RVO小鼠模型的两个最重要的元素是光敏染料的激光输出和成功静?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Fiber Patch Cable	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Lasercheck	Coherent	1098293
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC: 17478-263-12	keep at 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-5G	light-sensitive
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20