Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für den retinalen Venenverschluss unter Verwendung von Rose Bengal und einem lasergesteuerten retinalen Bildgebungsmikroskopsystem mit Empfehlungen zur Maximierung der Reproduzierbarkeit in gentechnisch veränderten Stämmen.

Zusammenfassung

Mausmodelle des retinalen Venenverschlusses (RVO) werden häufig in der Augenheilkunde verwendet, um hypoxisch-ischämische Verletzungen in der neuralen Netzhaut zu untersuchen. In diesem Bericht wird eine detaillierte Methode, die kritische Schritte aufzeigt, mit Empfehlungen zur Optimierung bereitgestellt, um konsistent erfolgreiche Okklusionsraten über verschiedene genetisch veränderte Mausstämme hinweg zu erreichen. Das RVO-Mausmodell besteht hauptsächlich aus der intravenösen Verabreichung eines Photosensibilisator-Farbstoffs, gefolgt von einer Laser-Photokoagulation unter Verwendung eines Netzhaut-Bildgebungsmikroskops, das an einem ophthalmogesteuerten Laser befestigt ist. Drei Variablen wurden als Determinanten der Okklusionskonsistenz identifiziert. Durch die Anpassung der Wartezeit nach der Verabreichung von Rosenbengalen und das Ausbalancieren der Basislinie und der experimentellen Laserleistung kann die Variabilität zwischen den Experimenten begrenzt und eine höhere Erfolgsrate von Okklusionen erreicht werden. Mit dieser Methode können Netzhauterkrankungen untersucht werden, die durch Netzhautödeme und hypoxisch-ischämische Verletzungen gekennzeichnet sind. Da dieses Modell Gefäßverletzungen induziert, kann es auch zur Untersuchung des Neurovaskulaturs, des neuronalen Todes und der Entzündung angewendet werden.

Einleitung

Der retinale Venenverschluss (RVO) ist eine häufige retinale Gefäßerkrankung, von der im Jahr 2015 weltweit etwa 28 Millionen Menschen betroffen waren¹. RVO führt bei Erwachsenen und älteren Menschen im erwerbsfähigen Alter zu einem Rückgang und Verlust der Sehkraft, was eine anhaltende sehgefährdende Krankheit darstellt, die im nächsten Jahrzehnt voraussichtlich zunehmen wird. Einige der unterschiedlichen Pathologien der RVO umfassen hypoxisch-ischämische Verletzungen, Netzhautödeme, Entzündungen und neuronalen Verlust². Derzeit ist die erste Behandlungslinie für diese Erkrankung die Verabreichung von vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Inhibitoren (VEGF). Während die Anti-VEGF-Behandlung dazu beigetragen hat, Netzhautödeme zu verbessern, sind viele Patienten immer noch mit einem Rückgang des Sehvermögens konfrontiert³. Um die Pathophysiologie dieser Krankheit besser zu verstehen und mögliche neue Behandlungslinien zu testen, ist es notwendig, ein funktionelles und detailliertes RVO-Mausmodellprotokoll für verschiedene Mausstämme zu erstellen.

Es wurden Mausmodelle entwickelt, die das gleiche Lasergerät verwenden, das bei menschlichen Patienten verwendet wird, gepaart mit einem Bildgebungssystem, das auf die richtige Größe für eine Maus skaliert ist. Dieses Mausmodell der RVO wurde erstmals 2007⁴ beschrieben und von Ebneter und anderen weiter etabliert ^4,5. Schließlich wurde das Modell von Fuma et al. optimiert, um wichtige klinische Manifestationen von RVO wie das Netzhautödem⁶ zu replizieren. Seit das Modell zum ersten Mal berichtet wurde, haben viele Studien es mit der Verabreichung eines Photosensibilisator-Farbstoffs verwendet, gefolgt von der Photokoagulation der wichtigsten Netzhautvenen mit einem Laser. Die Menge und Art des verabreichten Farbstoffs, die Laserleistung und die Expositionszeit variieren jedoch signifikant zwischen den Studien, die diese Methode verwendet haben. Diese Unterschiede können oft zu einer erhöhten Variabilität des Modells führen, was die Replikation erschwert. Bis heute gibt es keine veröffentlichten Studien mit spezifischen Details über mögliche Wege zur Optimierung.

Dieser Bericht stellt eine detaillierte Methodik des RVO-Mausmodells im C57BL/6J-Stamm und einem Tamoxifen-induzierbaren endothelialen Caspase-9-Knockout-Stamm (iEC Casp9KO) mit einem C57BL/6J-Hintergrund vor, der für die RVO-Pathologie als Referenzstamm für eine genetisch veränderte Maus relevant ist. Eine frühere Studie hatte gezeigt, dass eine nicht-apoptotische Aktivierung der endothelialen Caspase-9 ein Netzhautödem auslöst und den neuronalen Tod fördert⁸. Die Erfahrung mit diesem Stamm half dabei, mögliche Modifikationen zu ermitteln und Einblicke in das RVO-Mausmodell zu geben, das auf andere genetisch veränderte Stämme anwendbar sein kann.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Nagetierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt und überwacht.

HINWEIS: Alle Experimente verwendeten zwei Monate alte männliche Mäuse, die etwa 20 g wogen.

1. Herstellung und Verabreichung von Tamoxifen zur induzierbaren genetischen Ablation von gefloxten Genen

HINWEIS: Der Durchmesser des Netzhautgefäßes kann durch das Gewicht des Tieres beeinflusst werden. Stellen Sie sicher, dass alle Tiere, die für einen Versuch verwendet werden, ein ähnliches Gewicht haben.

1. Verdünnen Sie Tamoxifen in Maisöl auf eine Konzentration von 20 mg / ml.
   HINWEIS: Tamoxifen ist ein Giftstoff und ist lichtempfindlich. Vor Licht schützen, z.B. mit Alufolie.
2. Wirbeln Sie die Lösung für ein paar Sekunden vor.
3. Im Ofen bei 55 °C 15 min ziehen lassen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich das Tamoxifen vollständig aufgelöst hat. Zusätzliches Wirbeln kann erforderlich sein.
4. Lagern Sie die Lösung bis zu 1 Woche bei 4 °C.
5. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel zur Tamoxifen-Injektion. Reinigen Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol.  Verabreichen Sie 2 mg Tamoxifen (100 μl von 20 mg/ml) intraperitoneal (IP) einmal täglich für die festgelegte Zeit gemäß der spezifischen induzierbaren Cre-Linie.
6. Lassen Sie den Tieren zwei Tage Ruhe, bevor Sie mit den Versuchen beginnen.

2. Herstellung von Reagenzien für die Laser-Photokoagulation

1. Rose Bengal
   HINWEIS: Rose bengal ist lichtempfindlich. Bis zur Verwendung im Dunkeln aufbewahren und frisch zubereiten, um beste Ergebnisse zu erzielen.
   1. Bereiten Sie Rosenbengalen vor, indem Sie es in steriler Kochsalzlösung auf 5 mg/ml verdünnen und durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtrieren.
   2. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit Rosenbengalen versehen ist.
2. Ketamin/Xylazin
   1. Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung entsprechend für folgende Konzentrationen verdünnen: Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg).
3. Carprofen
   1. Verdünnen Sie Carprofen auf 1 mg/ml in steriler Kochsalzlösung.
   2. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit Carprofen ausgestattet ist.
4. Sterile Kochsalzlösung
   1. Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit steriler Kochsalzlösung versehen ist.

3. Laser-Setup

1. Behandeln Sie das Lichtwellenleiterkabel vorsichtig und verbinden Sie es mit der Lasersteuerbox und dem Laseradapter des Netzhautmikroskops.
2. Schalten Sie den Lampenkasten des Netzhautmikroskops ein.
3. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Imaging-Programm.
4. Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie es mit einem weißen Blatt Papier vor das Mausokular halten und im Bildgebungsprogramm auf Anpassen klicken.
5. Schalten Sie die Lasersteuerbox ein, indem Sie den Schlüssel drehen und den Anweisungen auf dem Bildschirm der Lasersteuerbox folgen.
   HINWEIS: Der in diesem Experiment verwendete Laser ist Klasse 3B und kann Augenschäden verursachen. Tragen Sie eine Schutzbrille, wenn Sie den Laser bedienen.
6. Überprüfen Sie die Basislaserleistung.
   1. Verwenden Sie einen Laserleistungsmesser.
   2. Stellen Sie den Bildschirm der Lasersteuerbox auf folgende Parameter ein: 50 mW und 2.000 ms.
   3. Schalten Sie den Laser ein und platzieren Sie den Leistungsmesser vor dem Okular.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Licht des Mikroskops ausgeschaltet ist, während Sie die Basislaserleistung testen.
   4. Drücken Sie das Fußschalterpedal, um den Laser zu aktivieren.
   5. Die Laserleistung soll 13-15 mW betragen.
      HINWEIS: Die Anzeige der Laserleistung bestimmt die Erfolgsrate bei Netzhautvenenverschlüssen. Wenn die Laserleistung zu niedrig ist, können Anpassungen an der Leistung und dem Zeitpunkt der Laserbelichtung vorgenommen werden. Empfehlungen finden Sie in Tabelle 1 .
7. Passen Sie die experimentelle Laserleistung an, indem Sie den Bildschirm der Lasersteuerbox für die folgenden Parameter einrichten: 100 mW, 1.000 ms.
8. Schalten Sie den Laser aus.
   HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen und um eine Überhitzung zu vermeiden, ist es am besten, den Laser zwischen den Mäusen ausgeschaltet zu lassen.

4. Mausschwanzvenen-Injektion von Rose Bengal

1. Gießen Sie 300 ml Wasser in ein 500-ml-Becherglas.
2. Erwärmen Sie das Becherglas in der Mikrowelle für 1 Min.
3. Geben Sie Gaze in das warme Wasser im Becherglas.
4. Setzen Sie die Maus in eine Rückhaltemaschine.
5. Drücken Sie die Gaze vorsichtig in den Mausschwanz und suchen Sie nach den erweiterten Venen. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle nach der Warmwasserdilatation mit einem Alkoholtupfer.
6. Führen Sie die Nadel in die Injektionsstelle ein und ziehen Sie an der Spritze, um sicherzustellen, dass Sie sich in der Vene befinden. Injizieren Sie dann die Mausschwanzvene und verabreichen Sie die richtige Menge entsprechend dem Gewicht des Tieres (37,5 mg/kg). Üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um Hämatome oder Blutungen zu vermeiden. Löschen Sie die Website.
7. Lösen Sie die Maus aus der Rückhalteeinrichtung und legen Sie sie wieder in den Käfig.
8. Lassen Sie die Rose Bengal vor der Injektion von Anästhetika 8 Minuten lang zirkulieren.
   HINWEIS: Dadurch liegen insgesamt 10 Minuten zwischen der Rose Bengal Injektion und der Laserbestrahlung.

5. Verschluss der Hauptvenen

1. Schalten Sie die beheizte Mausplattform ein.
2. Geben Sie einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid in jedes Auge.
3. Injizieren Sie 150 μl der Anästhetika, Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg) IP.
   HINWEIS: Während dieses Vorgangs erhielt die Maus zwei IP-Injektionen. Daher wechselten sich die Seiten ab. Die IP-Injektion für die Anästhesie wurde in den unteren rechten Bauchquadranten gegeben, und die Kochsalzlösung wurde in den unteren linken Bauchquadranten injiziert. Es wird empfohlen, vor der Injektion an der Spritze zu ziehen, um sicherzustellen, dass sich die Nadel im Bauch und nicht in den Organen befindet.
4. Kneifen Sie das Tier in die Zehen, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen, und warten Sie, bis es nicht mehr reagiert.
5. Fügen Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid pro Auge (Analgetikum) hinzu.
6. Fügen Sie Gelsalbe auf beide Augen hinzu.
7. Injizieren Sie 150 μL Carprofen subkutan zwischen die Ohren.
8. Platzieren Sie die Maus auf der Plattform.
9. Passen Sie die Plattform an, bis die Sicht auf den retinalen Fundus klar und fokussiert ist.
10. Zählen Sie die Netzhautvenen und machen Sie ein Bild des Fundus.
    HINWEIS: Netzhautvenen sind dunkler und breiter als Arterien. Venen und Arterien wechseln sich ab; Manchmal kann sich jedoch eine verzweigte Arterie in der Nähe des Sehnervs und damit zwei benachbarte Arterien befinden.
11. Schalten Sie den Laser ein und zielen Sie auf eine Netzhautvene in ca. 375 μm Entfernung von der Sehscheibe.
12. Bestrahlen Sie das Gefäß, indem Sie den Fußschalter drücken und den Laserstrahl leicht bis zu 100 μm bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und bewegen Sie den Laserstrahl nach jedem Puls so, dass die Bestrahlung nicht auf eine Stelle fokussiert wird.
13. Wiederholen Sie die Bestrahlung auf anderen großen Gefäßen, um 2-3 Verschlüsse zu erreichen.

6. Bestimmung der Anzahl der am Tag 0 verschlossenen Venen

1. Schalten Sie die Lampe aus, nachdem Sie die Gefäße bestrahlt haben, und warten Sie 10 Minuten.
   HINWEIS: Lichteinwirkung kann Netzhautschäden und Entzündungen verursachen. Schalten Sie die Lampe während der Wartezeit aus, um die Exposition zu minimieren⁷.
2. Schalten Sie die Lampe wieder ein und zählen Sie die Anzahl der verschlossenen Venen.
3. Machen Sie ein Bild des Fundus.

7. Nachsorge

1. Injizieren Sie 1 ml sterile Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 5, Schritt 3.
2. Fügen Sie Gleitmittel Augentropfen auf beide Augen hinzu.
3. Fügen Sie Gelsalbe auf beide Augen hinzu.
4. Beobachten Sie, wie sich die Maus von der Narkose erholt, und bringen Sie sie nicht mit den anderen Tieren in den Käfig zurück, bis sie sich vollständig erholt hat. Carprofen (5 mg/kg) kann täglich bis zu 2 Tage nach dem Eingriff verabreicht werden. Wenn sie auf Menschen angewendet werden, ist Schmerz kein Symptom von RVO.
   HINWEIS: Lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.

8. Beurteilung des Netzhautödems mittels optischer Kohärenztomographie (OCT)

HINWEIS: Dieser Schritt kann zum Zeitpunkt des Interesses des Prüfers durchgeführt werden. Der Höhepunkt des Netzhautödems für eine C57BL / 6J-Maus ist 1 Tag nach dem RVO-Verfahren. Dieser Zeitpunkt kann je nach Hintergrund der Maus variieren.

1. Schalten Sie den Leuchtkasten des Netzhautbildmikroskops, das OCT-Gerät und die beheizte Mausplattform ein.
2. Befolgen Sie am Tag nach dem Verschluss die Schritte 5.2 bis 5.7, um das Tier vorzubereiten.
3. Öffnen Sie die Softwareprogramme für die Bildbearbeitung und das Office-Anpassungstool.
4. Stellen Sie im OAT-Programm den Nudge auf 5 ein.
5. Nehmen Sie OCT bei 75 μm distal von der Verbrennung oder 4 Klicks.
6. Nehmen Sie OCT-Bilder an vier Quadranten der Netzhaut auf.
7. Analysieren Sie die OAT-Abbilder mithilfe einer Ablaufverfolgungssoftware.
8. Vergleichen Sie die Netzhautdicke von vorbestrahlten Messungen mit 1 Tag nach RVO oder zum interessierenden Zeitpunkt.
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie bei der Analyse der Daten die Anzahl der bestrahlten Venen, da dies die Entwicklung von Netzhautödemen beeinflussen kann. Die Tiere werden dann durch Verabreichung von Anästhetika eingeschläfert, gefolgt von einer Perfusionsoperation, die nicht überlebt.

Ergebnisse

Das RVO-Mausmodell zielt darauf ab, erfolgreich Verschlüsse in den Netzhautvenen zu erreichen, die zu hypoxisch-ischämischen Verletzungen, einem Abbau der Netzhautbarriere im Blut, neuronalem Tod und Netzhautödem führen⁸. Abbildung 1 zeigt eine Zeitleiste der Schritte zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit, eine schematische Darstellung des experimentellen Designs und skizziert Schritte, die je nach experimenteller Fragestellung weiter optimiert werden können....

Diskussion

Das Maus-RVO-Modell bietet eine Möglichkeit, die RVO-Pathologie besser zu verstehen und potenzielle Therapeutika zu testen. Während das Maus-RVO-Modell in der Praxis weit verbreitet ist, besteht ein Bedarf an einem aktuellen detaillierten Protokoll des Modells, das seine Variabilität adressiert und die Optimierung des Modells beschreibt. Hier stellen wir einen Leitfaden mit Beispielen aus der Praxis zur Verfügung, was geändert werden kann, um die konsistentesten Ergebnisse in einer Kohorte von Versuchstieren zu erzi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Fiber Patch Cable	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Lasercheck	Coherent	1098293
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC: 17478-263-12	keep at 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-5G	light-sensitive
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20