가변성을 제한하기 위한 망막 정맥 폐색 마우스 모델의 최적화

요약

여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.

초록

망막 정맥 폐색 (RVO)의 마우스 모델은 종종 신경 망막의 저산소 성 허혈성 손상을 연구하기 위해 안과에서 사용됩니다. 이 보고서에서는 다양한 유전자 변형 마우스 균주에서 일관되게 성공적인 폐색률을 달성하기 위한 최적화 권장 사항과 함께 중요한 단계를 지적하는 자세한 방법이 제공됩니다. RVO 마우스 모델은 주로 감광제 염료를 정맥 투여 한 후 안과 유도 레이저에 부착 된 망막 영상 현미경을 사용한 레이저 광 응고로 구성됩니다. 폐색 일관성의 결정 요인으로 세 가지 변수가 확인되었습니다. 장미 벵갈 투여 후 대기 시간을 조정하고 기준선과 실험 레이저 출력의 균형을 맞추면 실험 전반에 걸친 변동성을 제한하고 교합 성공률을 높일 수 있습니다. 이 방법은 망막 부종 및 저산소 성 허혈성 손상을 특징으로하는 망막 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 모델은 혈관 손상을 유발하므로 신경 혈관계, 신경 세포 사멸 및 염증을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.

서문

망막 정맥 폐색(RVO)은 2015년에 전 세계적으로 약 2,800만 명에게 영향을 미친 일반적인 망막 혈관 질환입니다¹. RVO는 근로 연령 성인과 노인의 시력 저하 및 상실로 이어지며, 이는 가까운 10년 동안 증가할 것으로 추정되는 지속적인 시력 위협 질병을 나타냅니다. RVO의 뚜렷한 병리 중 일부는 저산소 성 허혈성 손상, 망막 부종, 염증 및 신경 손실²을 포함합니다. 현재이 장애에 대한 치료의 첫 번째 라인은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제의 투여를 통한 것입니다. 항 -VEGF 치료가 망막 부종을 개선하는 데 도움이되었지만 많은 환자들이 여전히 시력 저하에 직면 해 있습니다³. 이 질환의 병태생리학을 더 이해하고 잠재적인 새로운 치료 라인을 테스트하기 위해, 상이한 마우스 균주에 대한 기능적이고 상세한 RVO 마우스 모델 프로토콜을 구성할 필요가 있다.

마우스 모델은 인간 환자에게 사용되는 것과 동일한 레이저 장치를 구현하여 개발되었으며, 마우스에 적합한 크기로 조정된 이미징 시스템과 쌍을 이룹니다. RVO의이 마우스 모델은 2007⁴ 년에 처음보고되었으며 Ebneter 및 기타 ^4,5에 의해 추가로 확립되었습니다. 결국, 이 모델은 망막 부종⁶과 같은 RVO의 주요 임상 증상을 복제하기 위해 Fuma et al.에 의해 최적화되었습니다. 이 모델이 처음보고 된 이래로, 많은 연구에서 광감작제 염료를 투여 한 후 레이저로 주요 망막 정맥의 광 응고를 사용하여이를 사용했습니다. 그러나 투여되는 염료의 양과 유형, 레이저 출력 및 노출 시간은이 방법을 사용한 연구에 따라 크게 다릅니다. 이러한 차이로 인해 모형의 변동성이 증가하여 복제가 어려워지는 경우가 많습니다. 현재까지 최적화를위한 잠재적 인 방법에 대한 구체적인 세부 정보가 포함 된 발표 된 연구는 없습니다.

이 보고서는 C57BL/6J 배경과 유전자 변형 마우스의 기준 균주로서 RVO 병리학과 관련이 있는 C57BL/6J 균주 및 타목시펜 유도성 내피 카스파제-9 녹아웃(iEC Casp9KO) 균주에서 RVO 마우스 모델의 자세한 방법론을 제시합니다. 이전 연구에 따르면 내피 카스파제-9의 비세포사멸 활성화는 망막 부종을 유발하고^{신경 세포 사}멸을 촉진합니다8. 이 균주를 사용한 경험은 다른 유전자 변형 균주에 적용할 수 있는 RVO 마우스 모델을 맞춤화하기 위한 잠재적인 수정에 대한 통찰력을 결정하고 제공하는 데 도움이 되었습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.

참고: 모든 실험은 무게가 약 20g인 2개월 된 수컷 마우스를 사용했습니다.

1. 플록스드 유전자의 유도성 유전자 절제를 위한 타목시펜의 제조 및 투여

알림: 망막 혈관 직경은 동물의 무게에 영향을받을 수 있습니다. 실험에 사용 된 모든 동물의 무게가 비슷한지 확인하십시오.

1. 옥수수 기름에 타목시펜을 20mg/mL의 농도로 희석합니다.
   알림: 타목시펜은 독성 물질이며 빛에 민감합니다. 빛으로부터 보호하십시오(예: 알루미늄 호일).
2. 몇 초 동안 솔루션을 소용돌이치십시오.
3. 55°C의 오븐에 15분 동안 그대로 둡니다.
   알림: 타목시펜이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 추가 소용돌이가 필요할 수 있습니다.
4. 용액을 4 ° C에서 최대 1 주일 동안 보관하십시오.
5. 타목시펜 주사에는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 사용하십시오. 70 % 에탄올로 주사 부위를 청소하십시오.  특정 유도성 Cre 라인에 따라 정해진 시간 동안 1일 1회 2mg의 타목시펜(20mg/mL 중 100μL)을 복강내(IP)로 투여합니다.
6. 실험을 시작하기 전에 동물에게 이틀간의 휴식을 허용하십시오.

2. 레이저 광응고용 시약의 제조

1. 로즈 벵골
   참고: 로즈 벵골은 빛에 민감합니다. 사용할 때까지 어두운 곳에 보관하고 최상의 결과를 위해 신선하게 준비하십시오.
   1. 로즈 벵골을 멸균 식염수에 5mg/mL로 희석하여 준비하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
   2. 장미 벵골이 있는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 준비합니다.
2. 케타민/자일라진
   1. 케타민과 자일라진을 멸균 식염수에 따라 다음 농도로 희석하십시오: 케타민(80-100mg/kg) 및 자일라진(5-10mg/kg).
3. 카프로 펜
   1. 멸균 식염수에서 카프로펜을 1mg/mL로 희석합니다.
   2. 카프로펜이 있는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 준비합니다.
4. 멸균 식염수
   1. 멸균 식염수가 있는 5G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 준비합니다.

3. 레이저 설정

1. 광섬유 케이블을 부드럽게 다루고 레이저 컨트롤 박스와 망막 영상 현미경의 레이저 어댑터에 연결합니다.
2. 망막 영상 현미경 램프 상자를 켭니다.
3. 컴퓨터를 켜고 이미징 프로그램을 엽니다.
4. 화이트 페이퍼를 사용하여 마우스 아이피스 앞에 놓고 이미징 프로그램에서 조정을 클릭하여 화이트 밸런스를 조정합니다.
5. 키를 돌리고 레이저 컨트롤 박스 화면의 지시에 따라 레이저 컨트롤 박스를 켭니다.
   알림: 이 실험에 사용된 레이저는 클래스 3B이며 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 레이저를 작동할 때는 보호용 고글을 착용하십시오.
6. 기준 레이저 출력을 확인합니다.
   1. 레이저 파워 미터를 사용하십시오.
   2. 레이저 컨트롤 박스의 화면을 50mW 및 2,000ms 매개 변수로 조정합니다.
   3. 레이저를 켜고 파워 미터를 접안 렌즈 앞에 놓습니다.
      알림: 기준 레이저 출력을 테스트하는 동안 현미경 표시등이 꺼져 있는지 확인하십시오.
   4. 풋스위치 페달을 밟아 레이저를 활성화합니다.
   5. 레이저 출력 판독값을 13-15mW로 목표로 합니다.
      알림: 레이저 파워 판독값은 망막 정맥 폐색의 성공률을 결정합니다. 레이저 출력 판독값이 너무 낮으면 레이저 노출의 출력과 시간을 조정할 수 있습니다. 권장 사항은 표 1 을 참조하십시오.
7. 레이저 컨트롤 박스의 화면을 100mW, 1,000ms 매개변수로 설정하여 실험용 레이저 출력을 조정합니다.
8. 레이저를 끕니다.
   알림: 안전과 과열을 방지하려면 마우스 사이에 레이저를 끄는 것이 가장 좋습니다.

4. 장미 벵골의 마우스 꼬리 정맥 주사

1. 500mL 비커에 물 300mL를 붓습니다.
2. 전자 레인지에서 비커를 1 분 동안 따뜻하게합니다.
3. 비커의 따뜻한 물에 거즈를 넣으십시오.
4. 마우스를 구속기에 넣으십시오.
5. 거즈를 마우스 꼬리에 부드럽게 누르고 확장 된 정맥을 찾으십시오. 따뜻한 물 팽창 후 알코올 닦아를 사용하여 주사 부위를 소독하십시오.
6. 주사 부위에 바늘을 삽입하고 주사기를 당겨 정맥에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 마우스 꼬리 정맥을 주사하여 동물의 무게에 따라 정확한 양 (37.5 mg / kg)을 투여합니다. 혈종이나 출혈을 피하기 위해 주사 부위에 압력을 가하십시오. 사이트를 닦습니다.
7. 구속기에서 마우스를 풀고 케이지로 되돌립니다.
8. 마취제를 주사하기 전에 장미 벵골이 순환할 때까지 8분 동안 기다립니다.
   알림: 이것은 장미 벵골 주사와 레이저 조사 사이에 총 10 분을 제공합니다.

5. 주요 정맥의 폐색

1. 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
2. 각 눈에 페닐에 프린과 트로피 아미드 한 방울을 넣으십시오.
3. 150 μL의 마취제, 케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg) IP를 주사하십시오.
   참고: 이 절차 중에 마우스에 두 번의 IP 주입이 제공되었습니다. 따라서 측면이 번갈아 가며 사용되었습니다. 마취를 위한 IP 주사는 우측 하복부 사분면에 투여하였고, 식염수는 좌측 하복부 사분면에 주입하였다. 주사하기 전에 주사기를 당기는 것이 바늘이 장기가 아닌 복부에 있는지 확인하는 것이 좋습니다.
4. 동물을 발가락으로 꼬집어 마취 깊이를 결정하고 반응이 없을 때까지 기다리십시오.
5. 눈 당 프로 파라카인 염산염 한 방울 (진통제)을 첨가하십시오.
6. 양쪽 눈에 젤 연고를 첨가하십시오.
7. 150 μL의 카프로펜을 귀 사이에 피하 주사합니다.
8. 플랫폼에 마우스를 수용하십시오.
9. 망막 안저의 시야가 명확하고 초점이 맞춰질 때까지 플랫폼을 조정하십시오.
10. 망막 정맥을 세고 안저의 이미지를 찍습니다.
    참고: 망막 정맥은 동맥보다 어둡고 넓습니다. 정맥과 동맥이 번갈아 나타납니다. 그러나 때로는 시신경 가까이에 분지 동맥이있을 수 있으므로 두 개의 인접한 동맥이있을 수 있습니다.
11. 레이저를 켜고 시신경 디스크에서 약 375μm의 망막 정맥을 조준합니다.
12. 풋 스위치를 누르고 레이저 빔을 최대 100μm까지 약간 움직여 용기를 조사하십시오. 이 단계를 세 번 반복하고 각 펄스 후에 레이저 빔을 움직여 조사가 한 지점에 집중되지 않도록합니다.
13. 다른 주요 혈관에 조사를 반복하여 2-3 개의 폐색을 달성합니다.

6. 0 일에 폐색 된 정맥 수 설정

1. 용기를 조사한 후 램프를 끄고 10 분 동안 기다리십시오.
   알림: 빛에 노출되면 망막 손상과 염증이 발생할 수 있습니다. 노출을 최소화하기 위해 대기 시간 동안 램프를 끄십시오⁷.
2. 램프를 다시 켜고 폐색 된 정맥의 수를 세십시오.
3. 안저의 이미지를 찍습니다.

7. 애프터 케어

1. 1mL의 멸균 식염수 IP를 주입합니다.
   노트: 섹션 5, 3단계에서 IP 주입 세부 정보를 참조하십시오.
2. 양쪽 눈에 윤활제 점안액을 첨가하십시오.
3. 양쪽 눈에 젤 연고를 첨가하십시오.
4. 마우스가 마취에서 회복되는 것을 지켜보고 완전히 회복 될 때까지 다른 동물과 함께 새장으로 돌려 보내지 마십시오. 카프로펜(5mg/kg)은 시술 후 최대 2일까지 매일 투여할 수 있습니다. 사람에게 적용하면 통증은 RVO의 증상이 아닙니다.
   알림: 마취에서 완전히 회복 될 때까지 동물을 방치하지 마십시오.

8. 광간섭단층촬영(OCT)에 의한 망막부종 평가

참고: 이 단계는 조사자의 관심 시점에서 수행할 수 있습니다. C57BL/6J 마우스의 망막 부종 피크는 RVO 시술 후 1일입니다. 이 시점은 마우스의 배경에 따라 달라질 수 있습니다.

1. 망막 영상 현미경 라이트 박스, OCT 기계 및 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
2. 폐색 다음 날, 동물을 준비하기 위해 5.2에서 5.7 단계를 따르십시오.
3. 이미징 및 OCT 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
4. OCT 프로그램에서 넛지를 5로 조정합니다.
5. 화상에서 75 μm 원위 또는 4 번의 클릭으로 OCT를 취하십시오.
6. 망막의 4 사분면에서 OCT 이미지를 촬영합니다.
7. 추적 소프트웨어를 사용하여 OCT 이미지를 분석합니다.
8. 사전 조사 된 측정의 망막 두께를 RVO 후 1 일 또는 관심 시점과 비교하십시오.
   알림: 데이터를 분석할 때 망막 부종의 발병에 영향을 줄 수 있으므로 조사된 정맥의 수를 고려하십시오. 이어서, 동물은 마취제를 투여한 후 관류 비생존 수술에 의해 안락사된다.

결과

RVO 마우스 모델은 망막 정맥의 폐색을 성공적으로 달성하여 저산소 허혈성 손상, 혈액 망막 장벽 파괴, 신경 세포 사멸 및 망막 부종⁸을 유발하는 것을 목표로 합니다. 그림 1 은 재현성을 보장하기 위한 단계의 타임라인, 실험 설계의 개략도를 보여주고 실험 질문에 따라 추가로 최적화할 수 있는 단계를 간략하게 설명합니다. 수정할 수있는 세 가지 주요 ?...

토론

마우스 RVO 모델은 RVO 병리를 더 깊이 이해하고 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있는 방법을 제공합니다. 마우스 RVO 모델이 현장에서 널리 사용되는 반면, 가변성을 해결하고 모델의 최적화를 설명하는 모델의 현재 세부 프로토콜이 필요합니다. 여기에서는 실험 동물 코호트에서 가장 일관된 결과를 얻고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하기 위해 변경할 수 있는 사항에 대한 경험의 예가 포함된 가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Fiber Patch Cable	Thor Labs	M14L02
GenTeal	Alcon	00658 06401
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Lasercheck	Coherent	1098293
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules	Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride	Akorn	NDC: 17478-263-12	keep at 4 °C
Refresh	Allergan	94170
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000-5G
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-5G	light-sensitive
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20