检测植物宿主中叶蝉载体的病毒和唾液蛋白

摘要

该协议演示了如何使用植物宿主来检测叶蝉的唾液蛋白和叶蝉载体释放的植物病毒蛋白。

摘要

昆虫媒介水平传播许多具有农业重要性的植物病毒。超过一半的植物病毒是由具有刺穿吸口器的半翅目昆虫传播的。在病毒传播过程中，昆虫唾液桥接病毒载体宿主，因为唾液载体病毒和昆虫蛋白触发或抑制植物从昆虫到植物宿主的免疫反应。唾液蛋白的鉴定和功能分析正在成为虫媒病毒-宿主相互作用研究领域的新热点。该协议提供了一个使用植物宿主检测叶蝉唾液中蛋白质的系统。感染水稻矮病毒（RDV）的叶蝉载体Nephotettix cincticeps就是一个例子。在以辛克二头肌猪笼草为食的水稻植株中，可以同时检测到由辛克二头肌奈瑟菌唾液载体的RDV的卵黄原蛋白和主要外衣壳蛋白P8。该方法适用于检测昆虫摄食后暂时滞留在植物宿主中的唾液蛋白。相信这种检测系统将有利于半翅目-病毒-植物或半翅目-植物相互作用的研究。

引言

虫媒病毒的媒介-宿主传播方式是一个基本问题，处于生物科学的前沿。许多具有农业重要性的植物病毒通过昆虫媒介横向传播^1。超过一半的植物病毒是由半翅目昆虫传播的，包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马。这些昆虫具有独特的特征，使它们能够有效地传播植物病毒¹。它们拥有刺吸口器，以韧皮部和木质部的汁液为食，分泌唾液¹，²，^3，4。随着技术的发展和改进，唾液成分的鉴定和功能分析正在成为深入研究的新焦点。唾液中已知的唾液蛋白包括许多酶，例如果胶酯酶、纤维素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、多酚氧化酶和蔗糖酶等⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，^12，13.唾液中的蛋白质还包括触发宿主防御反应的诱发子，从而改变昆虫的性能，以及抑制宿主防御的效应子，其增强昆虫适应性和诱导宿主病理反应的成分¹⁴，15，^16，17。因此，唾液蛋白是昆虫与宿主之间交流的重要材料。在病毒传播过程中，刺吸病毒昆虫唾液腺分泌的唾液也含有病毒蛋白。病毒成分利用唾液的流动将它们从昆虫释放到植物宿主。因此，昆虫唾液弥合了病毒-载体-宿主的三营养相互作用。研究含病毒昆虫分泌的唾液蛋白的生物学功能有助于了解病毒-载体-宿主的关系。

对于动物病毒，据报道，蚊子的唾液介导西尼罗河病毒（WNV）和登革热病毒（DENV）的传播和致病性。唾液蛋白AaSG34通过激活自噬促进登革热-2病毒复制和传播，而唾液蛋白AaVA-1通过激活自噬来促进登革热和寨卡病毒（ZIKV）传播^18，19。蚊子的唾液蛋白D7可以通过与DENV病毒粒子和重组DENV包膜蛋白²⁰的直接相互作用，在体外和体内抑制DENV感染。在植物病毒中，白栗病毒番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）诱导粉虱唾液蛋白Bsp9，抑制植物宿主WRKY33介导的免疫力，增加粉虱的偏好和性能，最终增加病毒的传播²¹。由于对昆虫唾液蛋白在植物宿主中的作用的研究落后于动物宿主，因此迫切需要一个稳定可靠的系统来检测植物宿主中的唾液蛋白。

被称为水稻矮病毒（RDV）的植物病毒由叶蝉Nephotettix cincticeps（半翅目:Cicadellidae）高效且持续繁殖^22，23传播。RDV首先被报道通过昆虫媒介传播，并在亚洲引起严重的水稻病^害24，25。病毒粒子为二十面体和双层球形，外层含有P8外衣壳蛋白²²。RDV在蝴蝶奈瑟蝇中的循环传播周期为14天²⁶，²⁷，^28，29，30。当RDV到达唾液腺时，病毒粒子通过胞吐样机制释放到唾液腺中储存唾液的腔中²³。卵黄原蛋白（Vg）是雌性昆虫卵母细胞发育所必需的卵黄蛋白前体³¹，^32，33。大多数昆虫物种至少有一个6-7 kb的Vg转录本，其编码约220 kDa的前体蛋白。Vg的蛋白质前体在进入卵巢之前通常可以裂解成大的（140至190 kDa）和小的（<50 kDa）片段^18，19。先前的蛋白质组学分析显示，叶蝉Recilia dorsalis分泌的唾液中存在来自Vg的肽，尽管它们的功能尚不清楚（未发表的数据）。新报道，飞虱口服分泌的Vg起到效应作用，破坏植物的防御能力³⁴。目前尚不清楚猪笼草的Vg是否也可以随唾液流释放到植物宿主，然后在植物中发挥作用干扰植物防御。为了解决猪笼草是否利用唾液蛋白（如Vg）来抑制或激活植物防御的问题，第一步是识别在摄食过程中释放到植物中的蛋白质。了解鉴定植物中存在的唾液蛋白的方法对于解释唾液蛋白的功能以及半翅目与植物之间的相互作用至关重要。

在这里介绍的协议中，以N . cincticeps 为例，提供一种方法来检查通过昆虫喂养引入的植物宿主中唾液蛋白的存在。该方案主要详细说明了唾液蛋白的收集和检测，有助于对大多数半翅目动物的进一步研究。

研究方案

非病毒性成虫叶蝉在中国福建农林大学媒介传播病毒研究中心繁殖。

1. 非病毒昆虫饲养

1. 将成虫饲养在40厘米x 35厘米x 20厘米（长x宽x高）的立方体笼中。保持笼子的一侧盖上防虫网，以便通风。
   1. 将带有叶蝉的笼子保存在包含内置湿度控制器的培养箱中，在26°C下，相对湿度为60-75%，光周期为16小时光照和8小时黑暗。
2. 使用吸气器轻轻地将所有成虫从笼子中转移到每周装有新鲜水稻幼苗的新笼子中。
   1. 让200多只成虫在水稻中交配产卵。
   2. 保留老稻苗，让若虫出苗。将这些新的非病毒若虫饲养到2龄期。

2. 病毒获取和病毒性昆虫的收集

1. 小心地将2龄非病毒若虫转移到玻璃培养管（直径2.5厘米，高15厘米）中1-2小时，以便使用吸气器饥饿。
   1. 将若虫释放到笼子中，笼子里装有在盆中生长的感染RDV的水稻植物。
   2. 让若虫以受感染的水稻植物为食 2 天。
      注意:小心地给水稻植物浇水，避免冲走若虫。2龄若虫长约1.6-2毫米。
2. 小心地将这些若虫转移到包含新鲜无病毒水稻幼苗的新笼子中，相对湿度为60-75%，光周期为16小时光照和8小时黑暗。让若虫以受感染的水稻植物为食12天，以完成RDV的循环传播期。

3. 使用饲养笼收集唾液蛋白

1. 准备五个小管状喂食笼（直径2.5厘米，高4厘米），其中一端覆盖有防虫网。
2. 在每个喂食笼中限制15-20个叶蝉，然后用薄泡沫垫覆盖笼子的另一端。
   1. 用胶带将一棵稻苗（5-6厘米高）固定在笼子末端和泡沫垫之间。确保饲养笼中的叶蝉可以以暴露在笼内的水稻幼苗为食。
3. 将幼苗根部浸入水中，使水稻植物保持活力。让叶蝉以它们为食 2 天。
4. 从饲养笼中取出叶蝉，收集它们喂养的水稻幼苗。将幼苗的部分切出网箱外，恢复幼苗的摄食区。
   注意:如果不立即用于检测，该样品最多可以在-80°C下储存3个月。

4. 试剂制备

1. 将 15.1 g Tris-碱、94 g 甘氨酸和 5 g SDS 溶解在 1 L 无菌水中，制备 5xTris-甘氨酸缓冲液。用800 mL无菌水稀释200 mL 5xTris-甘氨酸缓冲液，制备1xTris-甘氨酸缓冲液（缓冲液组成参见 表1 ）。
2. 将 80 g NaCl、30 g Tris-碱和 2 g KCl 溶解在 1 L 无菌水中，制备 10xTris 缓冲盐水 （TBS） 缓冲液。将溶液在121°C高压灭菌15分钟。
3. 将 8 g SDS、4 mL 巯基乙醇、0.02 g 溴酚蓝和 40 mL 甘油溶解在 40 mL 的 0.1 M Tris-HCl （pH 6.8） 中，制备 4x 蛋白质样品缓冲液。
4. 将 800 mL Tris-甘氨酸缓冲液与 200 mL 甲醇混合以制备转印缓冲液。
5. 加入 100 mL 10xTBS 溶液和 3 mL 吐温 20 至 900 mL 无菌水，用吐温 20 （TBST） 溶液制备 TBS 缓冲液。

5. 蛋白质印迹检测唾液和病毒蛋白

1. 用液氮研磨0.1克大米样品，直到组织变成粉末。向样品中加入 200 μL 4x 蛋白质样品缓冲液并煮沸 10 分钟。在室温下以12，000× g 离心样品10分钟。
   1. 取出上清液并将其放入新小瓶中。将 10 μL 样品加载到 SDS-PAGE 凝胶中，并在 150 V 的 Tris-甘氨酸缓冲液中运行 45-60 分钟。
      注意:离心后的残留物可以丢弃。
2. 将0.45μm硝酸纤维素膜和其他三明治用品放入转印缓冲液中30分钟。
   注意:此步骤可以在凝胶完成电泳之前完成。
3. 夹住凝胶，并在转印缓冲液中以100V转印90-120分钟。
4. 取膜并将其置于TBST溶液中的7%脱脂奶粉封闭溶液中20分钟。将针对RDV P8或Vg的特异性抗体添加到TBST中7%脱脂奶粉溶液中。与抗体一起孵育以染色膜2小时或过夜。
5. 用TBST溶液洗涤膜三次，每次洗涤5分钟。
6. 将山羊抗兔IgG作为二抗添加到7%脱脂奶粉中。在室温下与抗体孵育60-90分钟。
7. 用TBST溶液洗涤膜三次，每次5分钟。
8. 使用ECL蛋白质免疫试剂盒进行化学发光方法。试剂盒中的混合检测试剂 1 和 2 在试管中的比例为 1:1。将混合试剂放在膜上，孵育印迹5分钟。
9. 排出多余的试剂并拍摄化学发光图像的比色照片。将它们结合起来，可以看到带有蛋白质条带的梯子。

结果

图1说明了该协议中的所有步骤:昆虫饲养，病毒获取，通过水稻喂养收集唾液蛋白以及蛋白质印迹。蛋白质印迹结果显示，在用Vg抗体孵育的膜上的喂养水稻和昆虫唾液腺的样品中观察到约220 kDa的特异性和预期条带。相比之下，在非饲料大米样品中未观察到条带。图2中的结果表明，Vg作为唾液蛋白释放到植物宿主中。在与RDV P8抗体一...

讨论

刺吸昆虫唾液腺直接分泌的唾液起着举足轻重的作用，因为它将宿主组织和载体的跨王国生物因子预先消化和解毒^到宿主1，^3，4中。跨王国的生物因子，包括诱发子、效应子和小RNA，对于昆虫-宿主通讯至关重要¹⁴，^15，16。因此，揭示唾液成分的更多种类和?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10×TBS buffer preparation
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4× protein sample buffer preparation
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4× protein sample buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer	Composition		Comments/Description
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L sterile water		Stock solution
1×Tris-glycine buffer	200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution	100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	For rearing leafhoppers
Electrophoresis	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module	BIO-RAD	1703935	For SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4x protein sample buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	For grinding plant tissues
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10x TBS buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough	BIO-RAD	1703930	For SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
Protein color instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	For detecting proteins
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base	Roche	D609K69032	For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank	BIO-RAD	1658001	For SDS-PAGE
Water bath	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	For boil the protein samples
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4x protein sample buffer preparation