Nachweis von Virus- und Speichelproteinen eines Zikadenvektors im pflanzlichen Wirt

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert, wie der pflanzliche Wirt verwendet werden kann, um Speichelproteine von Zikaden und pflanzliche virale Proteine zu detektieren, die von Zikadenvektoren freigesetzt werden.

Zusammenfassung

Insektenvektoren übertragen horizontal viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von hemipterischen Insekten übertragen, die stechend-saugende Mundwerkzeuge haben. Während der Virusübertragung überbrückt der Insektenspeichel den Virus-Vektor-Wirt, da der Speichel Viren vektoriert und die Insektenproteine die Immunantwort von Pflanzen von Insekten in pflanzliche Wirte auslösen oder unterdrücken. Die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelproteinen wird zu einem neuen Schwerpunkt im Forschungsfeld der Arbovirus-Wirt-Interaktionen. Dieses Protokoll bietet ein System zum Nachweis von Proteinen im Speichel von Zikaden mit Hilfe des pflanzlichen Wirts. Als Beispiel dient der mit dem Reiszwergvirus (RDV) infizierte Zikadenvektor Nephotettix cincticeps. Das Vitellogenin und das Hauptprotein P8 des äußeren Kapsids P8 von RDV, das durch den Speichel von N. cincticeps vektorisiert wird, können gleichzeitig in der Reispflanze nachgewiesen werden, von der sich N. cincticeps ernährt. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung der Speichelproteine, die nach dem Fressen von Insekten vorübergehend im pflanzlichen Wirt zurückgehalten werden. Es wird angenommen, dass dieses Nachweissystem der Untersuchung von Interaktionen zwischen Hemipteran-Virus-Pflanze oder Hemipteran-Pflanze zugute kommen wird.

Einleitung

Der Vektor-Wirt-Übertragungsmodus von Arboviren, ein grundlegendes Problem, steht an der Grenze der biologischen Wissenschaft. Viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung werden horizontal durch Insektenvektoren übertragen¹. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von Hemiptera-Insekten übertragen, darunter Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse. Diese Insekten verfügen über besondere Merkmale, die es ihnen ermöglichen, Pflanzenviren effizient zu übertragen¹. Sie besitzen stechend-saugende Mundwerkzeuge und ernähren sich vom Saft von Phloem und Xylem und scheiden ihren Speichel^aus 1,2,3,4. Mit der Entwicklung und Verbesserung von Techniken wird die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelkomponenten zu einem neuen Schwerpunkt intensiver Forschung. Zu den bekannten Speichelproteinen im Speichel gehören zahlreiche Enzyme, wie Pektinesterase, Cellulase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Polyphenoloxidase und Saccharase, unter anderem 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den Proteinen im Speichel gehören auch Auslöser, die die Abwehrreaktion des Wirts auslösen und dadurch die Leistung von Insekten verändern, sowie Effektoren, die die Abwehr des Wirts unterdrücken, was die Fitness der Insekten verbessert, und Komponenten, die pathologische Reaktionen des Wirts hervorrufen^14,15,16,17. Daher sind Speichelproteine wichtige Materialien für die Kommunikation zwischen Insekten und Wirten. Bei der Übertragung von Viren enthält der Speichel, der von den Speicheldrüsen stechend-saugender viruliferer Insekten abgesondert wird, auch virale Proteine. Virale Bestandteile nutzen den Speichelfluss, um sie vom Insekt an den Pflanzenwirt freizusetzen. Daher überbrückt der Speichel der Insekten die tritrophe Virus-Vektor-Wirt-Interaktion. Die Untersuchung der biologischen Funktion von Speichelproteinen, die von viruliferen Insekten sezerniert werden, hilft, die Beziehung zwischen Virus, Vektor und Wirt zu verstehen.

Für tierische Viren wird berichtet, dass der Speichel von Stechmücken die Übertragung und Pathogenität des West-Nil-Virus (WNV) und des Dengue-Virus (DENV) vermittelt. Das Speichelprotein AaSG34 fördert die Replikation und Übertragung des Dengue-2-Virus, während das Speichelprotein AaVA-1 die Übertragung von DENV und dem Zika-Virus (ZIKV) fördert, indem es die Autophagie aktiviert^18,19. Das Speichelprotein D7 von Stechmücken kann die DENV-Infektion in vitro und in vivo durch direkte Interaktion mit den DENV-Virionen und dem rekombinanten DENV-Hüllprotein²⁰ hemmen. In Pflanzenviren induziert das Begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) das Speichelprotein Bsp9 der Weißen Fliege, das die WRKY33-vermittelte Immunität des pflanzlichen Wirts unterdrückt, um die Präferenz und Leistung der Weißen Fliege zu erhöhen und schließlich die Übertragung von Viren zu erhöhen²¹. Da die Studien zur Rolle von Speichelproteinen von Insekten in pflanzlichen Wirten hinter denen tierischer Wirte zurückgeblieben sind, ist ein stabiles und zuverlässiges System zum Nachweis der Speichelproteine in pflanzlichen Wirten dringend erforderlich.

Das als Reiszwergvirus (RDV) bekannte Pflanzenvirus wird von der Zikade Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) mit hoher Effizienz und persistent vermehrend übertragen^22,23. Zuerst wurde berichtet, dass RDV durch einen Insektenvektor übertragen wird und in Asien eine schwere Erkrankung von Reis verursacht^24,25. Das Virion ist ikosaedrisch und doppellagig kugelförmig, und die äußere Schicht enthält das äußere Kapsidprotein^{P8 22}. Die zirkulative Übertragungszeit von RDV in N. cincticeps beträgt 14 Tage 26,27,28,29,30. Wenn das RDV in den Speicheldrüsen ankommt, werden Virionen über einen Exozytose-ähnlichen Mechanismus in die im Speichel gespeicherten Hohlräume in den Speicheldrüsen freigesetzt²³. Das Vitellogenin (Vg) ist die Vorstufe des Dotterproteins, die für die Entwicklung der Eizellen bei weiblichen Insekten unerlässlich^{ist 31,32,33}. Die meisten Insektenarten haben mindestens ein Vg-Transkript von 6-7 kb, das für ein Vorläuferprotein von etwa 220 kDa kodiert. Die Proteinvorstufen von Vg können in der Regel in große (140 bis 190 kDa) und kleine (<50 kDa) Fragmente gespalten werden, bevor sie in den Eierstock gelangen^18,19. Frühere proteomische Analysen zeigten das Vorhandensein der von Vg abgeleiteten Peptide im sezernierten Speichel der Zikade Recilia dorsalis, obwohl ihre Funktion unbekannt ist (unveröffentlichte Daten). Es wird neu berichtet, dass Vg, das oral von Zikaden abgesondert wird, als Effektor fungiert, um die Abwehrkräfte von Pflanzen zu schädigen³⁴. Es ist nicht bekannt, ob das Vg von N. cincticeps auch mit Speichelfluss an den Pflanzenwirt abgegeben werden kann und dann in der Pflanze eine Rolle spielen könnte, um die pflanzliche Abwehr zu stören. Um herauszufinden, ob N. cincticeps Speichelproteine wie Vg nutzt, um die pflanzliche Abwehr zu hemmen oder zu aktivieren, besteht der erste Schritt darin, Proteine zu identifizieren, die während der Fütterung an die Pflanze abgegeben werden. Das Verständnis der Methode zur Identifizierung der in der Pflanze vorhandenen Speichelproteine ist möglicherweise unerlässlich, um die Funktion von Speichelproteinen und die Wechselwirkungen zwischen Hemiptera und Pflanzen zu erklären.

In dem hier vorgestellten Protokoll wird N. cincticeps als Beispiel verwendet, um eine Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins von Speichelproteinen im pflanzlichen Wirt bereitzustellen, die durch Insektenfraß eingeführt werden. Das Protokoll beschreibt in erster Linie die Sammlung und den Nachweis von Speichelproteinen und ist hilfreich für weitere Untersuchungen an den meisten Hemipteren.

Protokoll

Die nicht-viruliferen adulten Zikaden wurden im Vector-borne Virus Research Center der Fujian Agriculture and Forestry University, China, vermehrt.

1. Aufzucht nichtviruliferer Insekten

1. Ziehen Sie die erwachsenen Tiere auf Reissetzlingen in einem Würfelkäfig auf, der 40 cm x 35 cm x 20 cm (Länge x Breite x Höhe) groß ist. Halten Sie eine Seite des Käfigs zur Belüftung mit einem insektensicheren Netz bedeckt.
   1. Halten Sie die Käfige mit Zikaden in einem Inkubator mit eingebautem Feuchtigkeitsregler bei 26 °C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-75 % unter einer Photoperiode von 16 h hell und 8 h dunkel.
2. Verwenden Sie einen Sauger, um alle erwachsenen Tiere vorsichtig aus ihrem Käfig in einen neuen Käfig zu bringen, der jede Woche frische Reissetzlinge enthält.
   1. Lassen Sie mehr als 200 Erwachsene sich paaren und Eier in den Reis legen.
   2. Bewahren Sie die alten Reissetzlinge auf, damit die Nymphen schlüpfen können. Diese neuen nichtviruliferen Nymphen werden in das 2-Instar-Stadium gebracht.

2. Viruserwerb und Sammlung viruliferer Insekten

1. Übertragen Sie die nichtviruliferen Nymphen im 2-Instar vorsichtig für 1-2 h in ein Glaskulturröhrchen (2,5 cm Durchmesser und 15 cm Höhe), um sie mit dem Absauger zu verhungern.
   1. Lassen Sie die Nymphen in einem Käfig frei, in dem sich eine RDV-infizierte Reispflanze befindet, die in einem Topf gewachsen ist.
   2. Lassen Sie die Nymphen 2 Tage lang von der infizierten Reispflanze fressen.
      Anmerkungen: Gießen Sie die Reispflanze vorsichtig und vermeiden Sie es, die Nymphen wegzuwaschen. Die Nymphen im 2-Instadium sind etwa 1,6-2 mm lang.
2. Setzen Sie diese Nymphen vorsichtig in einen neuen Käfig um, der frische virenfreie Reissämlinge mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-75% unter einer Photoperiode von 16 h hell und 8 h dunkel enthält. Lassen Sie die Nymphen 12 Tage lang von der infizierten Reispflanze ernähren, um die zirkulative Übertragungszeit von RDV abzuschließen.

3. Entnahme von Speichelproteinen mit Hilfe eines Futterkäfigs

1. Bereiten Sie fünf kleine rohrartige Futterkäfige (2,5 cm Durchmesser und 4 cm Höhe) vor, in denen ein Ende mit insektensicheren Netzen bedeckt ist.
2. Sperren Sie 15-20 Zikaden in jeden Futterkäfig und decken Sie dann das andere Ende des Käfigs mit einer dünnen Schaumstoffmatte ab.
   1. Befestigen Sie einen Reiskeimling (5-6 cm hoch) mit Klebebändern zwischen dem Ende des Käfigs und einer Schaumstoffmatte. Stellen Sie sicher, dass sich die Zikaden im Futterkäfig von den Reissetzlingen ernähren können, die dem Inneren des Käfigs ausgesetzt sind.
3. Tauchen Sie die Wurzeln des Sämlings in Wasser, damit die Reispflanze am Leben bleibt. Lassen Sie die Zikaden 2 Tage lang davon ernähren.
4. Nehmen Sie die Zikaden aus ihren Futterkäfigen und sammeln Sie die Reissetzlinge, von denen sie sich ernährt haben. Schneiden Sie die Teile der Sämlinge außerhalb des Käfigs ab und stellen Sie die Fraßregionen der Sämlinge wieder her.
   HINWEIS: Diese Probe kann maximal 3 Monate bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort zum Nachweis verwendet wird.

4. Vorbereitung der Reagenzien

1. Lösen Sie 15,1 g Tris-Base, 94 g Glycin und 5 g SDS in 1 l sterilem Wasser auf, um 5xTris-Glycin-Puffer herzustellen. Verdünnen Sie 200 ml 5xTris-Glycin-Puffer mit 800 ml sterilem Wasser, um 1xTris-Glycin-Puffer herzustellen (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung).
2. Lösen Sie 80 g NaCl, 30 g Tris-Base und 2 g KCl in 1 l sterilem Wasser auf, um 10xTris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) herzustellen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C für 15 min.
3. Lösen Sie 8 g SDS, 4 ml ß-Mercaptoethanol, 0,02 g Bromphenolblau und 40 ml Glycerin in 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) auf, um 4x Proteinprobenpuffer herzustellen.
4. Mischen Sie 800 ml Tris-Glycin-Puffer mit 200 ml Methanol, um den Transferpuffer herzustellen.
5. Fügen Sie 100 ml 10xTBS-Lösung und 3 ml Tween 20 bis 900 ml steriles Wasser hinzu, um den TBS-Puffer mit Tween 20 (TBST)-Lösung herzustellen.

5. Western Blot zum Nachweis des Speichels und der viralen Proteine

1. Mahlen Sie 0,1 g der Reisproben mit flüssigem Stickstoff, bis das Gewebe zu einem Pulver wird. Geben Sie 200 μL 4x Proteinprobenpuffer in die Probe und kochen Sie sie 10 Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
   1. Entfernen Sie den Überstand und legen Sie ihn in eine neue Durchstechflasche. Laden Sie 10 μl der Probe in ein SDS-PAGE-Gel und lassen Sie es 45-60 Minuten lang in Tris-Glycin-Puffer bei 150 V laufen.
      Anmerkungen: Die Rückstände nach der Zentrifugation können verworfen werden.
2. Eine 0,45 μm Nitrozellulosemembran und andere Sandwichmaterialien für 30 min in den Transferpuffer geben.
   Anmerkungen: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, bevor das Gel seinen Lauf beendet hat.
3. Legen Sie das Gel ein und übertragen Sie es 90-120 Minuten lang bei 100 V in den Transferpuffer.
4. Nehmen Sie die Membran und legen Sie sie 20 Minuten lang in eine 7%ige fettfreie Trockenmilchblockierlösung in TBST-Lösung. Den spezifischen Antikörper gegen RDV P8 oder Vg in eine 7%ige Lösung fettfreier Trockenmilch in TBST geben. Inkubieren Sie mit dem Antikörper zur Färbung der Membran für 2 h oder über Nacht.
5. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Lösung, wobei Sie jedes Mal 5 Minuten waschen müssen.
6. Fügen Sie das Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper zu 7% fettfreier Trockenmilch mit TBST hinzu. Mit dem Antikörper 60-90 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST-Lösung.
8. Verwenden Sie das ECL-Western-Kit für die Chemilumineszenzmethode. Mischen Sie die Detektionsreagenzien 1 und 2 im Kit im Verhältnis 1:1 in einem Röhrchen. Geben Sie das gemischte Reagenz auf die Membran und inkubieren Sie den Blot 5 Minuten lang.
9. Lassen Sie das überschüssige Reagenz ab und machen Sie ein kolorimetrisches Bild des Chemilumineszenzbildes. Kombinieren Sie sie, um die Leiter mit den Proteinbändern zu sehen.

Ergebnisse

Abbildung 1 veranschaulicht alle Schritte dieses Protokolls: die Aufzucht von Insekten, den Viruserwerb, die Sammlung von Speichelproteinen über die Reisfütterung und den Western-Blot. Die Ergebnisse der Western Blots zeigten, dass in den Proben von Futterreis und Speicheldrüsen von Insekten auf der Membran, die mit Antikörpern gegen Vg inkubiert wurden, spezifische und erwartete Banden von etwa 220 kDa beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wurde in der nicht fütternden Reisprob...

Diskussion

Der Speichel, der direkt von den Speicheldrüsen der stechend-saugenden Insekten abgesondert wird, spielt eine entscheidende Rolle, da er das Wirtsgewebe vorverdaut und entgiftet und die lebensreichsübergreifenden biologischen Faktoren der Vektoren in den Wirt einbringt ^1,3,4. Die weltverbandsübergreifenden biologischen Faktoren, einschließlich Elicitoren, Effektoren und kleiner RNA, sind entscheidend für die Kommunikation z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10×TBS buffer preparation
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4× protein sample buffer preparation
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4× protein sample buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer	Composition		Comments/Description
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L sterile water		Stock solution
1×Tris-glycine buffer	200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution	100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	For rearing leafhoppers
Electrophoresis	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module	BIO-RAD	1703935	For SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4x protein sample buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	For grinding plant tissues
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10x TBS buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough	BIO-RAD	1703930	For SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
Protein color instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	For detecting proteins
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base	Roche	D609K69032	For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank	BIO-RAD	1658001	For SDS-PAGE
Water bath	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	For boil the protein samples
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4x protein sample buffer preparation