Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal

Resumen

Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.

Resumen

Los insectos vectores transmiten horizontalmente muchos virus vegetales de importancia agrícola. Más de la mitad de los virus de las plantas son transmitidos por insectos hemípteros que tienen piezas bucales perforadoras y chupadoras. Durante la transmisión viral, la saliva del insecto une el virus-vector-huésped porque los vectores de saliva los virus, y las proteínas del insecto, desencadenan o suprimen la respuesta inmune de las plantas de los insectos a los huéspedes de las plantas. La identificación y el análisis funcional de las proteínas salivales se están convirtiendo en una nueva área de enfoque en el campo de investigación de las interacciones arbovirus-huésped. Este protocolo proporciona un sistema para detectar proteínas en la saliva de los saltahojas utilizando la planta huésped. El vector saltahojas Nephotettix cincticeps infectado con el virus enano del arroz (RDV) sirve como ejemplo. La vitelogenina y la principal proteína P8 de la cápside externa del RDV vectorizada por la saliva de N. cincticeps se pueden detectar simultáneamente en la planta de arroz de la que se alimenta N. cincticeps. Este método es aplicable para probar las proteínas salivales que se retienen transitoriamente en el huésped de la planta después de la alimentación de insectos. Se cree que este sistema de detección beneficiará el estudio de las interacciones hemíptero-virus-planta o hemíptero-planta.

Introducción

El modo de transmisión vector-huésped de los arbovirus, un problema fundamental, está en la frontera de la ciencia biológica. Muchos virus vegetales de importancia agrícola son transmitidos horizontalmente por insectos vectores¹. Más de la mitad de los virus de las plantas son vectorizados por insectos hemípteros, incluidos pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips. Estos insectos tienen características distintivas que les permiten transmitir eficientemente los virus de las plantas¹. Poseen piezas bucales perforadoras-chupadoras y se alimentan de la savia del floema y el xilema, y secretan su saliva 1,2,3,4. Con el desarrollo y la mejora de las técnicas, la identificación y el análisis funcional de los componentes salivales se están convirtiendo en un nuevo foco de investigación intensiva. Las proteínas salivales conocidas en la saliva incluyen numerosas enzimas, como pectinesterasa, celulasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, polifenol oxidasa y sacarasa, entre otras 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las proteínas en la saliva también incluyen elicitores que desencadenan la respuesta de defensa del huésped, alterando así el rendimiento de los insectos, y efectores que suprimen la defensa del huésped, lo que mejora la aptitud del insecto y los componentes que inducen respuestas patológicas del huésped^14,15,16,17. Por lo tanto, las proteínas de la saliva son materiales vitales para la comunicación entre insectos y huéspedes. Durante la transmisión de virus, la saliva secretada por las glándulas salivales de los insectos virulíferos penetrantes y chupadores también contiene proteínas virales. Los componentes virales utilizan el flujo de saliva para liberarlos del insecto al huésped de la planta. Por lo tanto, la saliva del insecto une la interacción tritrófica virus-vector-huésped. Investigar la función biológica de las proteínas de la saliva secretadas por insectos virulíferos ayuda a comprender la relación virus-vector-huésped.

Para los virus animales, se informa que la saliva de los mosquitos media la transmisión y patogenicidad del virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus del dengue (DENV). La proteína salival AaSG34 promueve la replicación y transmisión del virus del dengue-2, mientras que la proteína salival AaVA-1 promueve la transmisión del virus DENV y Zika (ZIKV) mediante la activación de la autofagia^18,19. La proteína salival D7 de los mosquitos puede inhibir la infección por DENV in vitro e in vivo a través de la interacción directa con los viriones DENV y la proteína²⁰ de la envoltura DENV recombinante. En virus vegetales, el begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteína salival de mosca blanca Bsp9, que suprime la inmunidad mediada por WRKY33 de la planta huésped, para aumentar la preferencia y el rendimiento de las moscas blancas, aumentando eventualmente la transmisión de virus²¹. Debido a que los estudios sobre el papel que desempeñan las proteínas salivales de los insectos en los huéspedes de las plantas se han quedado atrás de los de los huéspedes animales, se requiere urgentemente un sistema estable y confiable para detectar las proteínas salivales en los huéspedes de las plantas.

El virus vegetal conocido como virus enano del arroz (RDV) es transmitido por el saltahojas Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con alta eficiencia y de manera persistentemente propagativa^22,23. Se informó por primera vez que el RDV era transmitido por un insecto vector y causa una enfermedad grave del arroz en Asia^24,25. El virión es icosaédrico y esférico de doble capa, y la capa externa contiene la proteína²² de la cápside externa P8. El período de transmisión circulativa de RDV en N. cincticeps es de 14 días 26,27,28,29,30. Cuando el RDV llega a las glándulas salivales, los viriones se liberan en las cavidades almacenadas en saliva en las glándulas salivales a través de un mecanismo similar a la exocitosis²³. La vitelogenina (Vg) es el precursor proteico vitelino esencial para el desarrollo de ovocitos en insectos hembra^31,32,33. La mayoría de las especies de insectos tienen al menos una transcripción Vg de 6-7 kb, que codifica una proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Los precursores proteicos de Vg generalmente se pueden escindir en fragmentos grandes (140 a 190 kDa) y pequeños (<50 kDa) antes de ingresar al ovario^18,19. Análisis proteómicos previos revelaron la presencia de los péptidos derivados de Vg en la saliva secretada del saltahojas Recilia dorsalis, aunque se desconoce su función (datos inéditos). Se ha informado recientemente que Vg, que es secretada por vía oral de los saltamontes, funciona como un efector para dañar las defensas de las plantas³⁴. Se desconoce si el Vg de N. cincticeps también podría liberarse al huésped de la planta con flujo salival, y luego podría desempeñar un papel en la planta para interferir con las defensas de la planta. Para abordar si N. cincticeps explota proteínas salivales, como Vg, para inhibir o activar las defensas de la planta, el primer paso es identificar las proteínas liberadas a la planta durante la alimentación. Comprender el método para identificar las proteínas salivales presentes en la planta es potencialmente esencial para explicar la función de las proteínas de la saliva y las interacciones entre los hemípteros y las plantas.

En el protocolo presentado aquí, N. cincticeps se utiliza como ejemplo para proporcionar un método para examinar la presencia de proteínas salivales en la planta huésped introducidas a través de la alimentación de insectos. El protocolo detalla principalmente la recolección y detección de proteínas salivales y es útil para una mayor investigación en la mayoría de los hemípteros.

Protocolo

Los saltahojas adultos no virulíferos se propagaron en el Centro de Investigación de Virus Transmitidos por Vectores en la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian, China.

1. Cría de insectos no virulíferos

1. Críe a los adultos en plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (largo x ancho x alto). Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación.
   1. Mantener las jaulas con saltahojas en una incubadora que contenga un controlador de humedad incorporado a 26 °C con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
2. Use un aspirador para transferir suavemente a todos los adultos de su jaula a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz fresco cada semana.
   1. Deje que más de 200 adultos se apareen y pongan huevos en el arroz.
   2. Retenga las viejas plántulas de arroz para que emerjan las ninfas. Cría a estas nuevas ninfas no virulíferas a la etapa de 2 estrellas.

2. Adquisición de virus y recolección de insectos virulíferos

1. Transfiera cuidadosamente las ninfas no virulíferas de 2 estadios a un tubo de cultivo de vidrio (2,5 cm de diámetro por 15 cm de alto) durante 1-2 h para la inanición con el aspirador.
   1. Libere a las ninfas en una jaula que contenga una planta de arroz infectada con RDV cultivada en una maceta.
   2. Permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante 2 días.
      NOTA: Riegue cuidadosamente la planta de arroz y evite lavar las ninfas. Las ninfas de 2 estrellas miden aproximadamente 1.6-2 mm de largo.
2. Transfiera cuidadosamente estas ninfas a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz frescas libres de virus con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante 12 días para completar el período de transmisión circulativa de RDV.

3. Recolección de proteínas salivales usando una jaula de alimentación

1. Prepare cinco pequeñas jaulas de alimentación en forma de tubo (2,5 cm de diámetro por 4 cm de alto) en las que un extremo esté cubierto con una red a prueba de insectos.
2. Confine 15-20 saltahojas en cada jaula de alimentación, y luego cubra el otro extremo de la jaula con una estera de espuma delgada.
   1. Fije una plántula de arroz (5-6 cm de altura) entre el extremo de la jaula y una estera de espuma con cintas. Asegúrese de que los saltahojas en la jaula de alimentación puedan alimentarse de las plántulas de arroz expuestas al interior de la jaula.
3. Sumerja las raíces de las plántulas en agua para que la planta de arroz permanezca viva. Permita que los saltahojas se alimenten de ellos durante 2 días.
4. Retire los saltahojas de sus jaulas de alimentación y recoja las plántulas de arroz de las que se alimentaron. Corte las partes de las plántulas fuera de la jaula y recupere las regiones de alimentación de las plántulas.
   NOTA: Esta muestra se puede almacenar a -80 °C durante 3 meses como máximo, si no se utiliza instantáneamente para la detección.

4. Preparación del reactivo

1. Disuelva 15.1 g de Tris-base, 94 g de glicina y 5 g de SDS en 1 L de agua estéril para preparar 5xTris-glicina tampón. Diluir 200 ml de tampón 5xTris-glicina con 800 mL de agua estéril para preparar 1xTampón Tris-glicina (ver Tabla 1 para la composición tampón).
2. Disuelva 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base y 2 g de KCl en 1 L de agua estéril para preparar 10xTris-buffered saline (TBS). Autoclave de la solución a 121 °C durante 15 min.
3. Disolver 8 g de SDS, 4 ml de ß-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol y 40 ml de glicerol en 40 ml de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6,8) para preparar 4x tampón de muestra de proteína.
4. Mezcle 800 ml de tampón de tris-glicina con 200 ml de metanol para preparar el tampón de transferencia.
5. Agregue 100 ml de solución de 10xTBS y 3 ml de Tween 20 a 900 ml de agua estéril para preparar el tampón TBS con solución de Tween 20 (TBST).

5. Western blot para detectar la saliva y las proteínas virales

1. Moler 0,1 g de las muestras de arroz con nitrógeno líquido hasta que el tejido se convierta en polvo. Agregue 200 μL de tampón de muestra de proteína 4x a la muestra y hiérvala durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
   1. Retire el sobrenadante y colóquelo en un vial nuevo. Cargue 10 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecútela en tampón Tris-glicina a 150 V durante 45-60 min.
      NOTA: El residuo después de la centrifugación puede desecharse.
2. Coloque una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm y otros suministros sándwich en el búfer de transferencia durante 30 minutos.
   NOTA: Este paso se puede hacer antes de que el gel haya completado su ejecución.
3. Coloque el gel en un sándwich y transfiéralo durante 90-120 min a 100 V en el búfer de transferencia.
4. Tome la membrana y colóquela en una solución bloqueadora de leche en polvo sin grasa al 7% en solución TBST durante 20 minutos. Agregue el anticuerpo específico contra RDV P8 o Vg a una solución al 7% de leche en polvo descremada en TBST. Incubar con el anticuerpo para teñir la membrana durante 2 h o durante la noche.
5. Lave la membrana con solución TBST tres veces, con 5 minutos de lavado cada vez.
6. Agregue la IgG anti-conejo de cabra como anticuerpo secundario a la leche en polvo descremada al 7% con TBST. Incubar con el anticuerpo durante 60-90 min a temperatura ambiente.
7. Lave la membrana con solución TBST tres veces durante 5 minutos cada vez.
8. Utilice el kit ECL Western para el método quimioluminiscente. Reactivos de detección de mezcla 1 y 2 en el kit en una proporción de 1:1 en un tubo. Coloque el reactivo mezclado en la membrana e incube el blot durante 5 min.
9. Drene el exceso de reactivo y tome una imagen colorimétrica de la imagen quimioluminiscente. Combínalos para ver la escalera con bandas de proteínas.

Resultados

La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: la cría de insectos, la adquisición de virus, la recolección de proteínas salivales a través de la alimentación con arroz y el western blot. Los resultados de Western blots mostraron que se observaron bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kDa en las muestras de arroz y glándulas salivales de alimentación de insectos en la membrana incubada con anticuerpos contra Vg. En contraste, no se observó ninguna b...

Discusión

La saliva secretada directamente por las glándulas salivales de los insectos perforadores-chupadores juega un papel fundamental porque predigiere y desintoxica los tejidos del huésped y los factores biológicos de los vectores en los huéspedes ^1,3,4. Los factores biológicos entre reinos, incluyendo elicitores, efectores y ARN pequeño, son críticos para la comunicación insecto-huésped^14,15,16<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10×TBS buffer preparation
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4× protein sample buffer preparation
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4× protein sample buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer	Composition		Comments/Description
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L sterile water		Stock solution
1×Tris-glycine buffer	200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution	100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	For rearing leafhoppers
Electrophoresis	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module	BIO-RAD	1703935	For SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4x protein sample buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	For grinding plant tissues
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10x TBS buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough	BIO-RAD	1703930	For SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
Protein color instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	For detecting proteins
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base	Roche	D609K69032	For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank	BIO-RAD	1658001	For SDS-PAGE
Water bath	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	For boil the protein samples
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4x protein sample buffer preparation