使用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞和原始祖细胞中的细胞生物能量学

摘要

这里介绍的方法总结了使用细胞外通量分析仪实时测量HSPCs的细胞外酸化速率（ECAR）和耗氧速率（OCR）评估非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPC）中细胞生物能量的优化方案。

摘要

在稳态下，造血干细胞（HSC）在很大程度上保持静止，并且被认为主要依靠糖酵解来满足其能量需求。然而，在感染或失血等应激条件下，HSC增殖并迅速产生下游祖细胞，而下游祖细胞又进一步分化，最终产生成熟的血细胞。在这个转变和分化过程中，HSC从静止状态中退出，并迅速经历从糖酵解到氧化磷酸化（OxPHOS）的代谢转换。各种应激条件，如衰老，癌症，糖尿病和肥胖症，会对线粒体功能产生负面影响，从而改变造血过程中HSC和祖细胞的代谢重编程和分化。通过评估HSC和祖细胞在正常和胁迫条件下的糖酵解和线粒体功能，可以获得对其细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）的宝贵见解，这分别是细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标。

在这里，提供了一个详细的方案，以使用细胞外通量分析仪测量小鼠骨髓来源的谱系阴性细胞群中的ECAR和OCR，其中包括造血干细胞和原始祖细胞（HSPC）。该协议描述了从小鼠骨髓中分离谱系阴性细胞的方法，解释了这些测定中使用的细胞接种密度和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，抑制糖酵解的葡萄糖类似物）和各种OxPHOS靶向药物（寡霉素，FCCP，鱼藤酮和抗霉素A）浓度的优化，并描述了药物治疗策略。糖酵解通量的关键参数，如糖酵解、糖酵解容量和糖酵解储备，以及OxPHOS参数，如基础呼吸、最大呼吸、质子泄漏、ATP产生、备用呼吸能力和偶联效率，可以在这些测定中测量。该协议允许在非贴壁性HSPCs上进行ECAR和OCR测量，并且可以推广以优化任何类型悬浮细胞的分析条件。

引言

造血是由HSCs¹形成具有高度专业化功能的各种类型的成熟血细胞的过程。HSC能够自我更新和分化成各种多能和谱系特异性祖细胞群。这些祖细胞最终产生淋巴样、髓系、红细胞和巨核细胞谱系的细胞。为了保持其自我更新能力，HSC在很大程度上保持静止状态，并且与其他组织干细胞一样，被认为依靠糖酵解而不是线粒体OxPHOS来产生ATP^2，3。进入细胞周期导致呼吸和OxPHOS增强，导致活性氧（ROS）水平升高，这对HSC的维持和功能有害³。因此，重复的细胞分裂可能导致HSC的自我更新能力降低，并最终导致其耗尽。

在成人造血中，HSC主要经历不对称细胞分裂，在此期间，其中一个子细胞保留HSC潜力并继续依赖糖酵解代谢。另一个子细胞成为原始的祖细胞，失去自我更新能力，但增殖并最终产生分化的功能性造血细胞⁴。当HSCs分化产生下游祖细胞时，从糖酵解到线粒体代谢的转变被认为是为了提供支持这种快速转变所需的能量和构建块⁵，正如HSC具有无活性线粒体质量^{6，7，8，9}的观察结果所表明的那样。.相反，线粒体活性（由连锁ROS水平表示）在谱系承诺的祖细胞中远高于HSCs^9，10，11。因此，在造血最早阶段发生的代谢变化表明线粒体在调节HSC命运中具有直接和至关重要的作用。

在各种应激条件下（如衰老、癌症、糖尿病和肥胖）下存在的功能失调线粒体¹² 会干扰 HSC 自我更新能力，通过产生过量的 ROS、损害 ATP 生成和/或改变其他代谢过程来诱导 HSC/祖细胞分化的失衡^9，12，13.HSC/祖细胞分化中代谢稳态的扰动可显著影响造血，可能导致血液学异常的发展¹³.鉴于糖酵解和线粒体OxPHOS对HSC干性和分化的关键影响，研究正常和胁迫条件下的代谢参数是有意义的。通过评估其ECAR和OCR，可以获得对HSC和祖细胞的糖酵解和线粒体功能的宝贵见解，它们分别是细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标。

Seahorse细胞外通量分析仪是一种功能强大的仪器，每孔配备两个探针，可同时测量活细胞中的ECAR和OCR，因此可用于实时评估细胞生物能量，以响应各种底物或抑制剂。与分析仪一起使用的检测盒包含进样口，可容纳多达四种药物，以便在测定过程中自动进样。典型的糖酵解压力试验方案如图 1A所示。该测定从测量细胞的ECAR开始，在含有谷氨酰胺但不含有葡萄糖或丙酮酸的糖酵解胁迫测试培养基中孵育。这表示由于细胞的非糖酵解活性而发生的酸化，并且被报道为非糖酵解酸化。接下来以饱和浓度注射葡萄糖。通过糖酵解，细胞中的葡萄糖转化为丙酮酸盐，丙酮酸盐在细胞质中进一步代谢以产生乳酸盐，或在线粒体中产生CO₂ 和水。

葡萄糖转化为乳酸盐导致净产生并随后将质子释放到细胞外培养基中，导致ECAR^14，15，16的快速增加。ECAR中这种葡萄糖刺激的变化被报告为基础条件下的糖酵解。第二次注射由寡霉素（ATP合酶的抑制剂，又名复合物V¹⁷）组成，其抑制线粒体ATP的产生。在寡霉素介导的OxPHOS抑制期间，细胞最大限度地上调糖酵解以满足其能量需求。这导致ECAR进一步增加，揭示了细胞的最大糖酵解能力。最大糖酵解能力与基础糖酵解之间的差异称为糖酵解储备。最后，注射2-DG，这导致ECAR显着下降，通常接近非糖酵解酸化水平。2-DG是一种葡萄糖类似物，具有竞争力地与己糖激酶结合，导致糖酵解¹⁸的抑制。因此，2-DG诱导的ECAR降低进一步证实糖酵解确实是葡萄糖和寡霉素注射后观察到的ECAR的来源。

图1B 显示了典型线粒体压力测试的示意图。该测定从细胞的基线OCR测量开始，在含有葡萄糖，谷氨酰胺和丙酮酸的线粒体压力测试培养基中孵育。在基础OCR测量之后，在该测定中注入寡霉素，其抑制复合物V，从而减少通过电子传递链（ETC）的电子流动¹⁷。因此，OCR在寡霉素注射后降低，OCR的这种降低与线粒体ATP产生有关。第二次注射剂由羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），质子团和线粒体OxPHOS¹⁷的解偶联剂组成。FCCP通过允许质子流过线粒体内膜来折叠线粒体质子梯度。由于FCCP注射，通过ETC的电子流被抑制，复合物IV以最大水平消耗氧气。最大OCR和基础OCR之间的差异被称为备用呼吸能力，这是细胞在压力条件下对增加的能量需求做出反应的能力的衡量标准。最后，注射两种ETC抑制剂（鱼藤酮，复合物I抑制剂和抗霉素A，复合物III抑制剂¹⁷）的混合物，其完全关闭电子流，OCR降低到低水平。鱼藤酮和抗霉素A注射后测量的OCR对应于由细胞内其他过程驱动的非线粒体OCR。非线粒体 OCR 能够计算基底呼吸、质子泄漏和最大呼吸。

基础呼吸代表基线 OCR 和非线粒体 OCR 之间的差异。质子泄漏是指寡霉素注射后的OCR与非线粒体OCR的区别。最大呼吸量表示 FCCP 注射后 OCR 与非线粒体 OCR 之间的差异。耦合效率计算为ATP生产率与基础呼吸速率的百分比。该方法论文提供了使用海马XFe96细胞外通量分析仪测量谱系阴性HSPC中ECAR和OCR的详细方案。该协议描述了分离小鼠谱系阴性HSPC的方法，解释了细胞接种密度和细胞外通量测定中使用的各种药物浓度的优化，并描述了药物治疗策略。

研究方案

所有脊椎动物实验均由密歇根大学动物使用和护理委员会批准并按照其进行。

1.测定前一天（总时间:约10分钟）

1. 传感器滤芯的水化（步骤时间:约 10 分钟）
   1. 打开细胞外通量测定试剂盒，取下传感器盒和实用板组件。保存装载指南单位，以便第二天使用。
   2. 手动将传感器盒（带盖的顶部绿色部分）与实用板（下部96孔微孔板）分开，并将其倒置放在实用板旁边。
   3. 使用多通道移液器，用200μL校准剂填充实用板的每个孔，包含在通量测定试剂盒中。
   4. 将传感器盒放回多功能板上，确保将传感器完全浸入校准器中。
   5. 将组装好的传感器盒和带有校准剂的实用板放入非CO₂ 37°C培养箱中过夜。为防止校准剂蒸发，请确保培养箱适当加湿。如果使用常规烘箱培养箱进行非CO₂ 37°C培养，请在培养箱内放置一个装有水的开放式烧杯以加湿。如果可用，请使用XF制备站进行所有非CO₂ 37°C孵育。
      注:或者，传感器滤芯可在非 CO 2 37 °C 培养箱中用每孔₂₀₀ μL 无菌超纯水水合过夜。用每孔200μL的37°C预热校准剂代替水，至少在测定当天加载注射口前45-60分钟。

2.测定当天（总时间:〜9小时30分钟）

注:除步骤2.5或步骤2.6外，上述总时间还包括步骤2.1-2.4的累计持续时间。

1. 制备细胞粘合剂包被的微孔板（步骤时间:〜1小时30分钟）
   注:在生物安全柜中执行所有步骤。
   1. 通过将56μg细胞粘合剂溶解在适当体积的0.1M碳酸氢钠（pH 8.0）中，并立即以所用细胞粘合剂原液的一半体积加入1 N氢氧化钠，每96孔细胞培养微孔板制备2.5mL细胞粘合剂溶液（22.4μg/ mL，参见 材料表）。涡旋或移液器上下搅拌以混合。
   2. 打开96孔细胞培养微孔板（包含在助焊剂测定试剂盒中），并在每个孔的底部分配25μL制备的细胞粘合剂溶液。用盖子盖住微孔板，并在室温下在罩内孵育30分钟。
   3. 孵育后，使用多通道移液器或吸出器除去多余的细胞粘合剂溶液，并用200μL无菌超纯水洗涤每个孔两次。将板风干，取下盖子，在罩内30-45分钟。
      注意:细胞粘合剂包被的细胞培养微孔板可以在4°C下储存长达一周。 在接种细胞之前，必须允许储存在4°C下的预涂微孔板在罩内加热至室温。
2. 制备测定培养基（步骤时间:约30分钟）
   1. 糖酵解负荷试验测定培养基的制备
      1. 补充100毫升基础培养基（见 材料表）与1毫升200毫升L-谷氨酰胺。
         注意:测定培养基中的最终L-谷氨酰胺浓度为2mM。
      2. 在水浴中将L-谷氨酰胺补充的培养基加热至37°C。
      3. 用1 N NaOH将温介质的pH值调节至7.4。
      4. 用0.2μm过滤器对培养基进行过滤灭菌，并将其保持在37°C直至准备使用。
   2. 线粒体负荷试验测定培养基的制备
      1. 补充100毫升基础培养基，含0.45克葡萄糖，1毫升200毫升L-谷氨酰胺和1毫升100毫升丙酮酸钠。
         注意:最终的测定培养基含有25 mM葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。
      2. 在水浴中将葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠补充培养基加热至37°C。
      3. 用1 N NaOH将温介质的pH值调节至7.4。
      4. 用0.2μm过滤器过滤灭菌培养基，并保持在37°C直至准备使用。
3. 收获小鼠谱系阴性 HSPC（步骤时间:约 3 小时）
   1. 通过将Hank的平衡盐溶液与4%胎牛血清补充来制备测定缓冲液。通过用无菌蒸馏水稀释5x储备液来制备1x富集缓冲液。将两种缓冲液放在冰上，直到使用。
   2. 使用CO₂ 人道地安乐死小鼠，然后使用宫颈脱位并用剪刀去除后肢。小心地从骨骼中取出所有组织，并用剪刀从股骨和胫骨两侧切开末端。使用测定缓冲液从股骨和胫骨中冲洗出骨髓细胞。将冲洗的细胞通过无菌的70μm过滤器，在4°C下以200× g 离心滤液5分钟，并丢弃上清液。
   3. 通过将细胞沉淀重悬于500μLACK缓冲液（150mM NH₄Cl，10mM KHCO₃，0.1mM EDTA，pH 7.2）中来裂解红细胞。在冰上裂解1分钟后，通过加入1mL测定缓冲液洗涤样品，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 弃去上清液。
   4. 洗涤后，将样品与针对CD2（1:200稀释），CD3（1:200稀释），CD5（1:200稀释），CD8（1:200稀释），Ter-119（1:200稀释），B220（1:200稀释）和Gr-1（1:800稀释）的混合物一起孵育样品，在总体积为500μL测定缓冲液的冰上孵育45分钟。
   5. 如上所述，用1mL测定缓冲液离心样品。
   6. 如上所述，用1 mL 1x富集缓冲液洗涤样品并进行离心。
   7. 将样品与20μL链霉亲和素纳米珠和100μL1x富集缓冲液在冰上孵育15分钟。
   8. 如上所述，用1 mL 1x富集缓冲液洗涤样品并进行离心。
   9. 将样品重悬于2.5 mL 1x富集缓冲液中。将它们放在分离磁铁上5分钟。将上清液分别收集在15 mL锥形管中。
   10. 将磁铁分离的样品重悬于另外的2.5mL 1x富集缓冲液中，并再次将其放在分离磁铁上5分钟。从步骤2.3.9开始，在15mL锥形管中收集并组合上清液到先前的收集物中。
       注意:上清液含有谱系阴性细胞组分。
   11. 在4°C下以200× g 离心含有负选择细胞的15mL锥形管5分钟。
   12. 将细胞沉淀重悬于1 mL测定缓冲液中，并使用台盼蓝手动或通过自动细胞计数器（如Countess 3）计数细胞数。
       注意:按照上述方法，应从单个小鼠的后肢中轻松纯化约^{6×10 6} 谱系阴性HSPC。如果在实验前一天制备试剂，例如测定缓冲液，1x富集缓冲液和谱系特异性抗体混合物，则大约需要2.5-3小时才能从4只小鼠中富集HSPCs。超过此数字的每只小鼠需要额外的10分钟。
4. 在细胞粘合剂包被的微孔板中接种细胞（步骤时间:〜1小时）
   1. 从步骤2.3.12中在室温下以200× g 离心细胞5分钟。
   2. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于适当的测定培养基（糖酵解压力测试培养基或线粒体压力测试培养基）中。在室温下以200× g 离心5分钟。
   3. 重复步骤 2.4.2。除去上清液并将细胞重悬于适当的加热测定培养基中至每50μL2.5×10⁵ 个细胞或每mL5×10⁶ 个浓度。
   4. 移液管50μL细胞悬浮液沿着室温细胞粘合剂包被的96孔细胞培养微孔板的一侧。将50μL测定培养基移入角落背景测量孔中。使用多通道移液器进行细胞接种，以确保一致性。
   5. 通过每孔非包被的96孔细胞培养微孔板加入50μL水来创建离心平衡板。
   6. 在室温下以200× g 离心平板中的细胞1分钟。不要踩刹车。将板转移到非CO₂ 37°C培养箱中25-30分钟，以确保细胞完全附着。在显微镜下目视确认细胞稳定地粘附在微孔板表面。
      注意:由于可以从单个小鼠的后肢收获约^6×10个6谱系阴性HSPC，因此如果目的是并行筛选多个体外干预，则需要从4只小鼠（约2.4×10^个7个细胞）中分离出的HSPC来填充整个96孔板。然而，如果目的是研究遗传改变或干预对体内HSPC代谢参数的影响，那么从多对对照和测试小鼠中分离的HSPC可以使用单个板在多个技术重复中并行分析。
5. 使用细胞外通量分析仪进行糖酵解压力测试（步骤时间:〜3小时30分钟）
   1. 带注射化合物的装载传感器盒
      1. 在预热糖酵解胁迫测试测定培养基（pH 7.4）中制备100mM葡萄糖，20μM寡霉素和500mM 2-DG溶液。
         注意:所有注射化合物溶液均在10倍浓度下制成。最终孔浓度为葡萄糖10 mM，寡霉素为2μM，2-DG为50 mM（见 表1）。
      2. 从步骤1.1.5中的非CO₂ 37°C培养箱中取出水合传感器盒。通过将传感器盒从校准器中取出并将其与校准器更换到同一功能板上，从实用板上清除校准器上的气泡。
      3. 将A / D加载指南平放（包含在细胞外通量测定试剂盒中）放在传感器盒的顶部，使其定向，使字母"A"位于左上角，以确保只有端口A可用于加载。使用多通道移液器，在端口A中分配20μL100mM葡萄糖溶液。
      4. 将 A/D 装载导轨平放，将 B/C 装载导轨平放，使字母"B"位于左上角，以确保只有端口 B 可用于装载。使用多通道移液器，在端口B中分配22μL20μM寡霉素溶液。
      5. 将 B/C 上样导轨重新定向平整，以将字母"C"定位在左上角的上角，用于装样口 C.使用多通道移液器，在端口 C 中分配 25 μL 的 500 mM 2-DG 溶液。
      6. 卸下并丢弃装载导轨平板。
         注意:重要的是，所有96个孔的每个端口系列，包括背景孔的端口系列，都要完全加载相同体积的注入化合物。
   2. 模板创建、校准和测量
      1. 在控制器上创建或加载糖酵解压力测试的模板。输入有关注射策略，治疗条件和细胞类型的详细信息，然后按 生成组。转到 板块图 并将孔分配给要分析的每个组。分配 4 个角孔进行背景测量。
      2. 在协议中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。
      3. 对于基线测量和每次注射后的测量（葡萄糖，寡霉素和2-DG），将 测量周期 数设置为 3 ， 混合 - 等待 - 测量时间 至 3分钟 - 0分钟 - 3 分钟（见 表2）。
      4. 从装填的化合物和水合传感器盒中取下盖子，浸没在实用板中的校准剂中。将其放在细胞外通量分析仪的工作托盘上并开始运行。
         注意:第一步是校准，通常需要约20分钟。
      5. 从步骤2.4.6的非CO₂ 37°C培养箱中取出含有细胞的微孔板，孵育25-30分钟结束后。在不干扰细胞的情况下，每孔缓慢加入130μL预热糖酵解胁迫试验培养基（pH 7.4），以将每个孔中的培养基体积补足至180μL，并将板返回到非CO₂ 37°C培养箱中，再增加15-20分钟。
         注意:离心后的总孵育时间为45-60分钟是优选的。
      6. 校准结束后，用含有细胞的测定微孔板（无盖）替换实用板。按 称重传感器板开始测量，完成测定需要约1.5小时。
      7. 测量结束后，收集含有细胞的测定微孔板并除去测定培养基而不干扰细胞。用250μL1x磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤一次，而不会使细胞脱落。
      8. 加入10μLRIPA裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 7.4，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，150mM NaCl，2mM EDTA，50mM NaF），补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在振荡器上搅拌板10分钟。将整个板在-80°C下冷冻。
      9. 解冻板，并按照制造商的说明进行蛋白质测量测定以进行数据归一化。
      10. 检索和分析数据。使用Wave桌面软件打开数据文件。单击" 归一化" 并粘贴每个孔的归一化值。单击" 应用 "以规范化数据。单击" 导出 "并选择" 糖酵解压力测试报告生成器 "，将分析的数据导出到报告生成器。或者，将数据导出到外部应用程序。
          注意:或者，每个孔中的总核DNA含量可用于使数据归一化。与核酸结合的荧光染料，如CyQuant，可用于评估每孔的总核DNA含量。
6. 使用细胞外通量分析仪进行线粒体压力测试（步骤时间:〜3小时30分钟）
   1. 带注射化合物的装载传感器盒
      1. 在预热线粒体压力测试测定培养基（pH 7.4）中制备20μM寡霉素，20μM FCCP和5μM鱼藤酮+ 5μM抗霉素A溶液。
         注意:所有注射化合物溶液均在10倍浓度下制成。寡霉素的最终孔浓度为2μM，FCCP为2μM，鱼藤酮和抗霉素A的终孔浓度为0.5μM（见 表3）。
      2. 从步骤1.1.5的37°C培养箱中取出水合物传感器盒，并按照前面的步骤2.5.1.2所述除去气泡。
      3. 通过执行步骤2.5.1.3至2.5.1.6，在端口A中分配20μL的20μM寡霉素，在端口B中分配22μL的20μM FCCP，在端口C中分配25μL的5μM鱼藤酮和5μM抗霉素A的混合物。
         注意:重要的是，所有96个孔的每个端口系列，包括背景孔的端口系列，都要完全加载相同体积的注入化合物。
   2. 模板创建、校准和测量
      1. 在控制器上创建或加载线粒体压力测试的模板。输入有关注射策略，治疗条件和细胞类型的详细信息，然后按 生成组。转到 板块图 并将孔分配给要分析的每个组。分配 4 个角孔进行背景测量。
      2. 在协议中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。
      3. 对于基线测量和每次注射后的测量（寡霉素，FCCP和鱼藤酮+抗霉素A），将 测量周期 数设置为 3 和 混合 - 等待 - 测量时间 至 3分钟 - 0分钟 - 3分钟 （见 表4）。
      4. 启动运行以执行校准，如步骤 2.5.2.4 所示。
      5. 在步骤2.5.2.5中每孔加入130μL预热线粒体压力试验培养基（pH 7.4）。
      6. 开始测量;检索和分析数据，如步骤 2.5.2.6 到 2.5.2.10 所示。将分析的数据导出到 线粒体压力测试报告生成器 或外部应用程序。

结果

使用该协议，优化各种OxPHOS靶向药物（用于细胞外通量测定）的细胞数量和浓度，以测量从24周龄雌性C57BL / 6小鼠中分离的HSPC的ECAR和OCR。首先，进行糖酵解胁迫试验，以优化细胞数量和寡霉素浓度。在该测定中使用每孔不同数量的HSPC，范围从5×^{10 4} 到2.5×^{10 5} 。如图 2A 和 图2C所示，非糖酵解酸化速率随着细胞数量的增加而升高，从5×10<...

讨论

该方法论文描述了一种优化的方案，用于使用Seahorse细胞外通量分析仪评估小鼠HSPC中的细胞生物能量（糖酵解和OxPHOS）。该装置是一种强大的工具，可同时测量活细胞的ECAR和OCR，分别是糖酵解和线粒体呼吸的指标。因此，它可用于实时评估细胞生物能量学。此外，基于96孔微孔板的平台提供高灵敏度的高通量定量，允许使用单个板同时分析多个样品，而另一种高分辨率呼吸计Oroboros O2k只能同时分?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate