Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Resumo

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Resumo

Sob estado estável, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) permanecem em grande parte quiescentes e acredita-se que são predominantemente dependentes da glicólise para atender às suas necessidades energéticas. No entanto, sob condições de estresse, como infecção ou perda de sangue, os HSCs tornam-se proliferativos e produzem rapidamente células progenitoras a jusante, que por sua vez diferenciam ainda mais, produzindo células sanguíneas maduras. Durante este processo de transição e diferenciação, os HSCs saem da quiescência e passam rapidamente por uma mudança metabólica da glicólise para a fosforilação oxidativa (OxPHOS). Várias condições de estresse, como envelhecimento, câncer, diabetes e obesidade, podem impactar negativamente a função mitocondrial e, assim, podem alterar a reprogramação metabólica e diferenciação de HSCs e progenitores durante a hematopoiese. Insights valiosos sobre funções glicolíticas e mitocondriais de HSCs e progenitores em condições normais e de estresse podem ser obtidos através da avaliação de sua taxa de acidificação extracelular (ECAR) e taxa de consumo de oxigênio (OCR), que são indicadores de glicolise celular e respiração mitocondrial, respectivamente.

Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para medir o ECAR e o OCR em populações de células de linhagem derivada da medula óssea do rato, que incluem tronco hematopoiético e células progenitoras primitivas (HSPCs), usando o analisador de fluxo extracelular. Este protocolo descreve abordagens para isolar as células de linhagem negativas da medula óssea do rato, explica a otimização da densidade de semeadura celular e concentrações de 2-desoxi-D-glicose (2-DG, um análogo de glicose que inibe a glicólise) e várias drogas direcionadas ao OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A) usadas nesses ensaios, e descreve estratégias de tratamento de drogas. Os principais parâmetros do fluxo glicóglitico, como glicólise, capacidade glicóltica e reserva glicóltica, e parâmetros oxphos, como respiração basal, respiração máxima, vazamento de prótons, produção de ATP, capacidade respiratória sobressalente e eficiência de acoplamento, podem ser medidos nestes ensaios. Este protocolo permite medições de ECAR e OCR em HSPCs não aderentes e pode ser generalizado para otimizar condições de análise para qualquer tipo de células de suspensão.

Introdução

Hematopoiese é o processo pelo qual vários tipos de células sanguíneas maduras com funções altamente especializadas são formadas a partir de HSCs¹. Os HSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação em várias populações progenitoras multipotentes e específicas da linhagem. Esses progenitores acabam produzindo células de linhagem linfoide, mieloide, eritróida e megacaito. Para manter sua capacidade de auto-renovação, acredita-se que os HSCs permaneçam em grande parte quiescentes e, como outras células-tronco tecerá-los, dependem da glicólise em vez de OxPHOS mitocondrial para a produção de ATP ^2,3. A entrada no ciclo celular leva a uma respiração melhorada e oxphos, resultando em níveis elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são prejudiciais à manutenção e função do HSC³. A divisão celular repetida, portanto, pode levar à redução da capacidade de auto-renovação dos HSCs e, finalmente, à sua exaustão.

Em hematopoiese adulta, os HSCs são submetidos principalmente à divisão celular assimétrica, durante a qual uma das células filhas mantém o potencial de HSC e continua a depender do metabolismo glicóltico. A outra célula filha torna-se uma célula progenitora primitiva que perde a capacidade de auto-renovação, mas se prolifera e eventualmente dá origem a células hematopoiéticas funcionais diferenciadas⁴. Quando se pensa que os HSCs se diferenciam para produzir progenitores a jusante, acredita-se que uma mudança da glicolise para o metabolismo mitocondrial ocorra para fornecer a energia e os blocos de construção necessários para suportar essa transição rápida⁵, como sugerido pelas observações de que os HSCs possuem massa mitocondrial inativa ^6,7,8,9 . Em contraste, a atividade mitocondrial (indicada pelos níveis de ROS vinculados) é muito maior em progenitores comprometidos com linhagem do que nos HSCs ^9,10,11. Alterações metabólicas que ocorrem durante o primeiro passo da hematopoiese sugerem, assim, um papel direto e crucial das mitocôndrias na regulação do destino do HSC.

Mitocôndrias disfuncionais presentes sob várias condições de estresse, como envelhecimento, câncer, diabetes e obesidade¹², podem interferir na capacidade de autoconstrução do HSC, induzindo um desequilíbrio na diferenciação do HSC/progenitor, produzindo quantidades excessivas de ROS, prejudicando a produção de ATP e/ou alterando outros processos metabólicos ^9,12,13 . Perturbações na homeostase metabólica na diferenciação HSC/progenitor poderia impactar significativamente a hematopoiese, potencialmente contribuindo para o desenvolvimento de anormalidades hematológicas¹³. Dadas as influências críticas da glicólise e do OxPHOS mitocondrial sobre a haste e diferenciação do HSC, é de interesse investigar tanto parâmetros metabólicos em condições normais quanto de estresse. Insights valiosos sobre a função glicolítico e mitocondrial dos HSCs e células progenitoras podem ser obtidos avaliando seu ECAR e OCR, que são indicadores de glicolise celular e respiração mitocondrial, respectivamente.

O analisador de fluxo extracelular seahorse é um poderoso aparelho equipado com duas sondas por poço para medir simultaneamente eCAR e OCR em células vivas e, portanto, pode ser usado para avaliar bioenergésicos celulares em tempo real, em resposta a vários substratos ou inibidores. O cartucho de ensaio usado com o analisador contém portas de injeção para conter até quatro medicamentos para injeção automatizada durante o ensaio. Um esquema de um teste típico de estresse de glicolise é mostrado na Figura 1A. O ensaio começa com a medição do ECAR das células, incubado em meio de teste de estresse de glicolise contendo glutamina, mas não glicose ou piruvato. Isso representa acidificação ocorrida devido a atividades não glicolíticas das células e é relatada como acidificação não glicolítica. Isso é seguido pela injeção de glicose em uma concentração saturada. Via glicolise, a glicose na célula é convertida em piruvato, que é ainda mais metabolizado no citoplasma para produzir lactato, ou em mitocôndrias para produzir CO₂ e água.

A conversão da glicose em lactato causa produção líquida e posterior liberação de prótons no meio extracelular, resultando em um rápido aumento no ECAR 14,15,16. Esta mudança estimulada pela glicose no ECAR é relatada como glicólise em condições basais. A segunda injeção consiste em oligomicina (um inibidor da synthase ATP, também conhecida como complexo V¹⁷), que inibe a produção de ATP mitocondrial. Durante a inibição oxphos mediada pela oligomicina, as células regulam a glicólise para atender às suas demandas energéticas. Isso causa um aumento adicional no ECAR, revelando a capacidade glicoglicítica máxima das células. A diferença entre a capacidade glicolítica máxima e a glicolise basal é referida como reserva glicolítica. Finalmente, 2-DG é injetado, o que causa uma queda significativa no ECAR, geralmente perto dos níveis de acidificação não glicolítico. 2-DG é um análogo de glicose que se liga competitivamente à hexokinase, resultando na inibição da glicólise¹⁸. Assim, a diminuição induzida por 2-DG no ECAR confirma ainda que a glicólise é de fato a fonte de ECAR observada após injeções de glicose e oligomicina.

A Figura 1B exibe o esquema para um típico teste de estresse mitocondrial. O ensaio começa com a medição de OCR de base das células, incubada em meio de teste de estresse mitocondrial contendo glicose, glutamina e piruvato. Após medições basais de OCR, a oligomicina é injetada neste ensaio, o que inibe o complexo V, reduzindo assim o fluxo de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons (ETC)¹⁷. Consequentemente, o OCR é reduzido em resposta à injeção de oligomicina, e essa diminuição no OCR está ligada à produção de ATP mitocondrial. A segunda injeção consiste em cianeto carbonil-4 (trifluorometoxy) fenilhidrazone (FCCP), um prótonophore e um desacoplador de OxPHOS^{mitocondrial 17}. FCCP colapsa o gradiente de próton mitocondrial permitindo o fluxo de prótons através da membrana interior mitocondrial. Devido à injeção de FCCP, o fluxo de elétrons através do ETC é desprimido, e o complexo IV consome oxigênio no nível máximo. A diferença entre OCR máximo e OCR basal é referida como a capacidade respiratória sobressal, que é uma medida da capacidade da célula de responder ao aumento da demanda de energia em condições de estresse. Finalmente, uma mistura de dois inibidores etc (rotenona, um inibidor complexo I, e antimicina A, um inibidor III complexo¹⁷) é injetada, o que desliga completamente o fluxo de elétrons, e o OCR diminui para um nível baixo. OCR medido após a injeção de rotenona e antimicina A corresponde ao OCR não mitocondrial impulsionado por outros processos dentro das células. O OCR não mitocondrial permite o cálculo da respiração basal, vazamento de prótons e respiração máxima.

A respiração basal representa a diferença entre OCR de linha de base e OCR não mitocondrial. O vazamento de prótons refere-se à diferença entre OCR após injeção de oligomicina e OCR não mitocondrial. A respiração máxima representa a diferença entre o OCR após a injeção de FCCP e o OCR não mitocondrial. A eficiência do acoplamento é calculada como a porcentagem da taxa de produção de ATP à taxa de respiração basal. Este documento de método fornece um protocolo detalhado para medir ECAR e OCR em HSPCs negativos de linhagem usando o analisador de fluxo extracelular Seahorse XFe96. Este protocolo descreve abordagens para isolar os HSPCs negativos da linhagem do rato, explica a otimização da densidade de semeadura celular e concentrações de várias drogas usadas em ensaios de fluxo extracelular, e descreve estratégias de tratamento de medicamentos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais vertebrados foram aprovados e realizados de acordo com as normas do Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade de Michigan.

1. Um dia antes do ensaio (Tempo total: ~10 min)

1. Hidratação do cartucho do sensor (Tempo de passo: ~10 min)
   1. Abra o kit de ensaio de fluxo extracelular e remova o cartucho do sensor e o conjunto da placa de utilidade. Guarde os planos de guia de carga para uso no dia seguinte.
   2. Separe manualmente o cartucho do sensor (a parte verde superior com tampa) da placa de utilidade (microplaque inferior de 96 poços) e coloque-o de cabeça para baixo ao lado da placa do utilitário.
   3. Utilizando uma pipeta multicanal, encha cada poço da placa de utilidade com 200 μL de calibrante, incluído com kit de ensaio de fluxo.
   4. Coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade, certificando-se de submergir completamente os sensores no calibrante.
   5. Coloque o cartucho do sensor montado e a placa de utilidade com calibrante em uma incubadora não CO₂ 37 °C durante a noite. Para evitar a evaporação do calibrador, certifique-se de que a incubadora esteja adequadamente umidificada. Se usar uma incubadora de forno regular para incubações não-CO₂ 37 °C, coloque um béquer aberto contendo água dentro da incubadora para umidificá-lo. Se disponível, use uma estação de preparação XF para todas as incubações não CO₂ 37 °C.
      NOTA: Alternativamente, o cartucho do sensor pode ser hidratado durante a noite com 200 μL por poço de água ultrapura estéril em uma incubadora não-CO₂ 37 °C. Substitua a água por 200 μL por poço de calibrante pré-armado de 37 °C, pelo menos 45-60 min antes de carregar as portas de injeção no dia do ensaio.

2. Dia do ensaio (Tempo total: ~9 h 30 min)

NOTA: O tempo total indicado acima inclui durações cumulativas das etapas 2.1-2.4, além da etapa 2.5 ou da etapa 2.6.

1. Preparação de microplacões revestidas de adesivo celular (Tempo de passo: ~1 h 30 min)
   NOTA: Realize todas as etapas em um armário de biossegurança.
   1. Prepare 2,5 mL da solução adesiva celular (22,4 μg/mL, ver a Tabela de Materiais) por microplacão de cultura celular de 96 poços dissolvendo 56 μg do adesivo celular em um volume apropriado de bicarbonato de sódio esterilizado por filtro 0,1 M (pH 8.0) e adicionando imediatamente 1 N de hidróxido de sódio à metade do volume de material adesivo celular utilizado. Vórtice ou pipeta para cima e para baixo para misturar.
   2. Abra a microplacar de cultura celular de 96 poços (incluído com o kit de ensaio de fluxo) e dispense 25 μL da solução de adesivo celular preparada na parte inferior de cada poço. Cubra a microplacão com a tampa e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente dentro do capô.
   3. Após a incubação, remova e descarte a solução de adesivo de célula em excesso usando uma pipeta ou aspirador multicanal, e lave cada poço duas vezes com 200 μL de água ultrapura estéril. Seque a placa, com a tampa removida, dentro do capô por 30-45 min.
      NOTA: As microplacões de cultura celular revestidas de células podem ser armazenadas por até uma semana a 4 °C. Microplacas pré-revestidas armazenadas a 4 °C devem ser permitidas a aquecer até a temperatura ambiente dentro do capô antes de semear células.
2. Preparação de mídia de ensaio (Tempo de passo: ~30 min)
   1. Preparação do teste de glicólise teste de ensaio de ensaio
      1. Suplementar 100 mL de meio base (ver a Tabela de Materiais) com 1 mL de L-glutamina de 200 mM.
         NOTA: A concentração final de L-glutamina no meio de ensaio é de 2 mM.
      2. Aqueça o meio l-glutamina-suplementado a 37 °C em um banho de água.
      3. Ajuste o pH do meio quente para 7,4 com 1 N NaOH.
      4. Esterilize o meio com um filtro de 0,2 μm e mantenha-o a 37 °C até estar pronto para usar.
   2. Preparação do teste de estresse mitocondrial do teste de ensaio
      1. Suplementar 100 mL do meio base com 0,45 g de glicose, 1 mL de L-glutamina de 200 mM e 1 mL de piruvato de sódio de 100 mM.
         NOTA: O médio de ensaio final contém glicose de 25 mM, 2 mM L-glutamina e 1 mM piruvanato de sódio.
      2. Glicose quente, L-glutamina e o meio de piruvato de sódio a 37 °C em banho-maria.
      3. Ajuste o pH do meio quente para 7,4 com 1 N NaOH.
      4. O meio de esterilização do filtro com um filtro de 0,2 μm e mantenha a 37 °C até estar pronto para usar.
3. HSPCs de linhagem de rato de colheita negativos (tempo de passo: ~3 h)
   1. Prepare o tampão de ensaio suplementando a solução de sal balanceada de Hank com 4% de soro bovino fetal. Prepare 1x tampão de enriquecimento diluindo o estoque de 5x com água destilada estéril. Mantenha os dois buffers no gelo até o uso.
   2. Camundongos humanamente eutanizam usando CO₂ seguido de luxação cervical e removem as cascas com tesouras. Remova cuidadosamente todos os tecidos dos ossos e corte as extremidades de ambos os lados do fêmur e da tíbia usando uma tesoura. Limpe as células da medula óssea do fêmur e da tíbia usando o tampão de ensaio. Passe as células lavadas através de um filtro estéril de 70 μm, centrifule o filtrado a 200 × g por 5 min a 4 °C e descarte o supernante.
   3. Lyse os glóbulos vermelhos reutilizando a pelota celular em 500 μL de tampão ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7.2). Seguindo a lise por 1 min no gelo, lave as amostras adicionando 1 mL de tampão de ensaio e centrífuga a 200 × g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
   4. Após a lavagem, incubar as amostras com um coquetel de anticorpos biotiningados direcionados contra CD2 (diluição 1:200), CD3 (diluição 1:200), CD5 (diluição 1:200), CD8 (diluição 1:200), Ter-119 (diluição 1:200), B220 (diluição de 1:200) e Gr-1 (diluição de 1:800) por 45 min no gelo em um volume total de 500 μL de tampão de ensaio.
   5. Lave as amostras com 1 mL de tampão de ensaio com centrifugação conforme acima.
   6. Lave as amostras com 1 mL de 1x tampão de enriquecimento com centrifugação conforme acima.
   7. Incubar as amostras com 20 μL de nanoesferas streptavidinas e 100 μL de tampão de enriquecimento de 1x no gelo por 15 minutos.
   8. Lave as amostras com 1 mL de 1x tampão de enriquecimento com centrifugação conforme acima.
   9. Resuspenda as amostras em 2,5 mL de 1x tampão de enriquecimento. Coloque-os em um ímã de separação por 5 minutos. Colete os supernantes separadamente em tubos cônicos de 15 mL.
   10. Resuspend magnet-separated amostras em um adicional de 2,5 mL de tampão de enriquecimento 1x, e colocá-los novamente no ímã de separação por 5 minutos. Colete e combine supernantes às coleções anteriores em tubos cônicos de 15 mL a partir da etapa 2.3.9.
       NOTA: Os supernantes contêm as frações celulares da linhagem negativa.
   11. Centrifugar os tubos cônicos de 15 mL contendo as células negativamente selecionadas por 5 min a 200 × g a 4 °C.
   12. Resuspenda as pelotas de célula em 1 mL de tampão de ensaio e conte o número de célula usando o azul trypan manualmente ou através de um contador de células automatizado, como uma Condessa 3.
       NOTA: Seguindo a abordagem acima descrita, ~6 × 10⁶ HSPCs de linhagem negativa devem ser facilmente purificados a partir das linhas traseiras de um único mouse. Se os reagentes, como tampão de ensaio, tampão de enriquecimento 1x e coquetel de anticorpos específicos para linhagem, forem preparados no dia anterior ao experimento, é necessário aproximadamente 2,5-3 h para enriquecer HSPCs de 4 ratos. Seria preciso mais 10 minutos para cada mouse além deste número.
4. Células de semeadura em microplacões revestidas de adesivo celular (Tempo de passo: ~1 h)
   1. Células centrífugas da etapa 2.3.12 a 200 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   2. Remova o supernasce e resuspense a pelota celular no meio de ensaio apropriado (meio de teste de estresse glicólise ou meio de teste de estresse mitocondrial). Centrifugar a 200 × g por 5 min a temperatura ambiente.
   3. Repita o passo 2.4.2. Remova o supernaspetivo e resuspenque as células no médio de ensaio aquecido apropriado para a concentração de 2,5 × 10⁵ células por 50 μL ou 5 × 10⁶ por mL.
   4. Pipeta 50 μL da suspensão celular ao longo da lateral de cada poço da microplacão de cultura celular revestida de células revestida de células de 96 poços. Pipeta 50 μL do meio de ensaio nos poços de medição de fundo do canto. Use uma pipeta multicanal para chapeamento celular para garantir a consistência.
   5. Crie uma placa de equilíbrio de centrífugas adicionando 50 μL de água por poço de uma microplacão de cultura celular de 96 poços não revestido.
   6. Centrifugar as células da placa a 200 × g por 1 min a temperatura ambiente. Não aplique freio. Transfira a placa para uma incubadora não-CO₂ 37 °C por 25-30 min para garantir que as células tenham sido completamente anexadas. Confirme visualmente sob um microscópio que as células são aderidas à superfície da microplacão.
      NOTA: Como ~6 × 10⁶ HSPCs de linhagem negativa podem ser colhidos a partir dos blocos traseiros de um único mouse, HSPCs isolados de 4 ratos (~2,4 × 10⁷ células) são necessários para preencher uma placa inteira de 96 poços se o objetivo é telar múltiplas intervenções ex vivo em paralelo. No entanto, se o objetivo é investigar o impacto de uma alteração genética ou uma intervenção nos parâmetros metabólicos dos HSPCs in vivo, então os HSPCs isolados de múltiplos pares de controle e ratos de teste podem ser analisados em múltiplas réplicas técnicas em paralelo usando uma única placa.
5. Realizando o teste de estresse da glicolise usando o analisador de fluxo extracelular (Tempo de passo: ~3 h 30 min)
   1. Cartucho de sensor de carregamento com compostos injetáveis
      1. Prepare 100 mM de glicose, 20 μM de oligomicina e 500 mM 2-DG em teste de estresse de glicolise pré-armado (pH 7.4).
         NOTA: Todas as soluções compostas de injeção são feitas na concentração de 10x. As concentrações finais do poço são de 10 mM para glicose, 2 μM para oligomicina e 50 mM para 2-DG (ver Tabela 1).
      2. Remova o cartucho do sensor hidratado da incubadora não-CO₂ 37 °C da etapa 1.1.5. Remova as bolhas de ar do calibrante na placa do utilitário, levantando o cartucho do sensor para fora do calibrante e substituindo-o na mesma placa de utilidade com o calibrante.
      3. Coloque o guia de carregamento A/D plano (incluído no kit de ensaio de fluxo extracelular) na parte superior do cartucho do sensor, orientando-o para que a letra 'A' esteja localizada no canto superior esquerdo para garantir que apenas as portas A estejam disponíveis para carregamento. Utilizando uma pipeta multicanal, dispense 20 μL de solução de glicose de 100 mM nas portas A.
      4. Substitua o guia de carregamento A/D plano por plano de carga B/C, orientando para que a letra 'B' esteja localizada no canto superior esquerdo para garantir que apenas as portas B estejam disponíveis para carregamento. Utilizando uma pipeta multicanal, dispense 22 μL de solução de oligomicina de 20 μM nas portas B.
      5. Reorientar o guia de carregamento B/C plano para localizar a letra 'C' no canto superior esquerdo para carregar portas C. Usando uma pipeta multicanal, dispense 25 μL de solução 2-DG de 500 mM nas portas C.
      6. Remova e descarte os planos de guia de carga.
         NOTA: É importante que cada série de portas de todos os 96 poços, incluindo os dos poços de fundo, sejam completamente carregados com o mesmo volume do composto de injeção.
   2. Criação, calibração e medições de modelos
      1. Crie ou carregue o modelo para o teste de estresse da glicolise no controlador. Insira detalhes sobre estratégias de injeção, condições de tratamento e tipos de células, e pressione grupos de geração. Vá para o mapa da placa e atribua poços a cada grupo a ser analisado. Atribua os 4 poços de canto para medições de fundo.
      2. No protocolo, certifique-se de que a calibração e o equilíbrio sejam verificados na etapa de inicialização .
      3. Para medição e medidas da linha de base após cada injeção (glicose, oligomicina e 2-DG), defina o número de ciclos de medição para 3 e Misture - Espere - Meça os tempos para 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabela 2).
      4. Remova a tampa dos compostos carregados e o cartucho do sensor hidratado, submerso no calibrante na placa de utilidade. Coloque-o na bandeja de trabalho do analisador de fluxo extracelular e comece a correr.
         NOTA: O primeiro passo é a calibração, que geralmente leva ~20 min.
      5. Retire a microplaca contendo as células da incubadora não-CO₂ 37 °C da etapa 2.4.6 após o fim de 25-30 min de incubação. Sem perturbar as células, adicione lentamente 130 μL do teste de ensaio de estresse de glicolise pré-caçada (pH 7,4) por poço para compor o volume médio em cada poço a 180 μL e devolva a placa à incubadora não-CO₂ 37 °C por 15-20 min adicionais.
         NOTA: É preferível um tempo total de incubação de 45-60 minutos após a centrifugação.
      6. Após o fim da calibração, substitua a placa de utilidade pela microplacão de ensaio (sem tampa) contendo as células. Pressione Carregar a placa celular para iniciar as medições, que levará ~1,5 h para a conclusão do ensaio.
      7. Após o fim das medições, colete a microplacão de ensaio contendo as células e remova o meio de ensaio sem perturbar as células. Lave uma vez suavemente com 250 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato 1x sem desalojar as células.
      8. Adicione 10 μL de tampão de lise RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na desoxicolato, 0,1% de dodecylsulfato de sódio, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), complementado com coquetel inibidor de 1x protease, para cada poço e agitar a placa em um shaker por 10 min. Congele a placa inteira a -80 °C.
      9. Descongele a placa e realize um ensaio de medição de proteínas para normalização dos dados seguindo as instruções do fabricante.
      10. Recuperar e analisar os dados. Abra o arquivo de dados usando o Wave Desktop Software. Clique em Normalizar e cole os valores de normalização para cada poço. Clique em solicitar para normalizar os dados. Clique em Exportar e selecione gerador de relatório de teste de estresse de glicolise para exportar os dados analisados para um gerador de relatórios. Alternativamente, exporte os dados para uma aplicação externa.
          NOTA: Alternativamente, o conteúdo total de DNA nuclear em cada poço pode ser usado para normalizar os dados. Um corante fluorescente, como o CyQuant que se liga ao ácido nucleico, pode ser usado para avaliar o conteúdo total do DNA nuclear por poço.
6. Realizando um teste de estresse mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular (Tempo de passo: ~3 h 30 min)
   1. Cartucho de sensor de carregamento com compostos injetáveis
      1. Prepare 20 soluções de oligomicina μM, 20 μM FCCP e 5 μM rotenone + 5 μM antimicina A em meio de ensaio de teste de estresse mitocondrial pré-armado (pH 7.4).
         NOTA: Todas as soluções compostas de injeção são feitas na concentração de 10x. As concentrações finais do poço são de 2 μM para oligomicina, 2 μM para FCCP e 0,5 μM cada para rotenona e antimicina A (ver Tabela 3).
      2. Remova o cartucho do sensor hidratado da incubadora de 37 °C da etapa 1.1.5 e remova as bolhas de ar como descrito anteriormente na etapa 2.5.1.2.
      3. Seguindo as etapas 2.5.1.3 a 2.5.1.6, dispense 20 μL de 20 μM de oligomicina nas portas A, 22 μL de 20 μM FCCP nas portas B e 25 μL de uma mistura de rotenone de 5 μM e 5 μM antimicina A nas portas C.
         NOTA: É importante que cada série de portas de todos os 96 poços, incluindo os dos poços de fundo, sejam completamente carregados com o mesmo volume de composto de injeção.
   2. Criação, calibração e medições de modelos
      1. Crie ou carregue o modelo para o teste de estresse mitocondrial no controlador. Insira detalhes sobre estratégias de injeção, condições de tratamento e tipos de células, e pressione grupos de geração. Vá para o mapa da placa e atribua poços a cada grupo a ser analisado. Atribua os 4 poços de canto para medições de fundo.
      2. No protocolo, certifique-se de que a calibração e o equilíbrio sejam verificados na etapa de inicialização.
      3. Para medição e medidas da linha de base após cada injeção (oligomicina, FCCP e rotenone + antimicina A), defina o número de ciclos de medição para 3 e Mix - Wait - Measure times to 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabela 4).
      4. Inicie a corrida para realizar a calibração como na etapa 2.5.2.4.
      5. Adicione 130 μL do teste de estresse mitocondrial pré-armado médio (pH 7.4) por bem como na etapa 2.5.2.5.
      6. Iniciar as medições; recuperar e analisar os dados como nas etapas 2.5.2.6 a 2.5.2.10. Exporte os dados analisados para o gerador do relatório de teste de estresse mitocondrial ou para uma aplicação externa.

Resultados

Utilizando este protocolo, o número celular e as concentrações de várias drogas direcionadas ao OxPHOS (usadas nos ensaios de fluxo extracelular) foram otimizadas para medir ecar e OCR de HSPCs isolados de camundongos C57BL/6 fêmeas de 24 semanas de idade. Primeiro, foi realizado o teste de estresse da glicolise para otimizar o número celular e a concentração de oligomicina. Um número variado de HSPCs por poço variando de 5 × 10⁴ a 2,5 × 10⁵ foram utilizados neste ensaio. Como mostrado n...

Discussão

Este artigo de método descreve um protocolo otimizado para a avaliação de bioenergetics celulares (glicólise e OxPHOS) em HSPCs de camundongos usando o analisador de fluxo extracelular do Cavalo Marinho. Este dispositivo é uma ferramenta poderosa que mede simultaneamente o ECAR e o OCR de células vivas, que são métricas de glicolise e respiração mitocondrial, respectivamente. Assim, pode ser usado para avaliar a bioenergética celular em tempo real. Além disso, a plataforma baseada em microplaca de 96 poços o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate