Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Zusammenfassung

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Zusammenfassung

Im stationären Zustand bleiben hämatopoetische Stammzellen (HSCs) weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Unter Stressbedingungen wie Infektionen oder Blutverlust werden HSCs jedoch proliferativ und produzieren schnell nachgeschaltete Vorläuferzellen, die sich wiederum weiter differenzieren und schließlich reife Blutzellen produzieren. Während dieses Übergangs- und Differenzierungsprozesses verlassen HSCs die Ruhephase und durchlaufen schnell einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung (OxPHOS). Verschiedene Stresszustände wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit können sich negativ auf die mitochondriale Funktion auswirken und somit die metabolische Reprogrammierung und Differenzierung von HSCs und Vorläufern während der Hämatopoese verändern. Wertvolle Einblicke in die glykolytischen und mitochondrialen Funktionen von HSCs und Vorläufern unter Normal- und Stressbedingungen können durch die Beurteilung ihrer extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) und Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in Mausknochenmark-abgeleiteten liniennegativen Zellpopulationen bereitgestellt, die sowohl hämatopoetische Stamm- als auch primitive Vorläuferzellen (HSPCs) umfassen, mit dem extrazellulären Flussanalysator. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von liniennegativen Zellen aus dem Knochenmark der Maus, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG, ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt) und verschiedener OxPHOS-zielgerichteter Medikamente (Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin A), die in diesen Assays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien. Schlüsselparameter des glykolytischen Flusses, wie Glykolyse, glykolytische Kapazität und glykolytische Reserve, und OxPHOS-Parameter wie Basalatmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, freie Atemkapazität und Kopplungseffizienz können in diesen Assays gemessen werden. Dieses Protokoll ermöglicht ECAR- und OCR-Messungen an nicht adhärenten HSPCs und kann verallgemeinert werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren.

Einleitung

Hämatopoese ist der Prozess, bei dem verschiedene Arten von reifen Blutzellen mit hochspezialisierten Funktionen aus HSCs¹ gebildet werden. HSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und in verschiedene multipotente und linienspezifische Vorläuferpopulationen zu differenzieren. Diese Vorläufer produzieren letztendlich Zellen von lymphatischen, myeloischen, erythroiden und Megakaryozytenlinien. Um ihre Selbsterneuerungskapazität aufrechtzuerhalten, bleiben HSCs weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie, wie andere Gewebestammzellen, auf Glykolyse und nicht auf mitochondriales OxPHOS für die ATP-Produktion angewiesen sind ^2,3. Der Eintritt in den Zellzyklus führt zu einer verbesserten Atmung und OxPHOS, was zu erhöhten Werten an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt, die sich nachteilig auf die HSC-Aufrechterhaltung und -Funktion^{auswirken 3}. Eine wiederholte Zellteilung kann daher zu einer verminderten Selbsterneuerungskapazität von HSCs und letztlich zu deren Erschöpfung führen.

Bei der adulten Hämatopoese durchlaufen HSCs hauptsächlich eine asymmetrische Zellteilung, bei der eine der Tochterzellen das HSC-Potenzial behält und weiterhin auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen ist. Die andere Tochterzelle wird zu einer primitiven Vorläuferzelle, die die Selbsterneuerungsfähigkeit verliert, sich aber vermehrt und schließlich zu differenzierten funktionellen hämatopoetischen Zellen führt⁴. Wenn HSCs differenzieren, um nachgeschaltete Vorläufer zu produzieren, wird angenommen, dass ein Wechsel von der Glykolyse zum mitochondrialen Stoffwechsel erfolgt, um die Energie und die Bausteine zu liefern, die zur Unterstützung dieses schnellen Übergangs benötigt werden⁵, wie die Beobachtungen nahelegen, dass HSCs inaktive mitochondriale Masse^{besitzen 6,7,8,9} . Im Gegensatz dazu ist die mitochondriale Aktivität (angezeigt durch verknüpfte ROS-Spiegel) bei der Abstammung gebundenen Vorläufer viel höher als bei HSCs 9,10,11. Metabolische Veränderungen, die während des frühesten Schritts der Hämatopoese auftreten, deuten daher auf eine direkte und entscheidende Rolle der Mitochondrien bei der Regulierung des HSC-Schicksals hin.

Dysfunktionale Mitochondrien, die unter verschiedenen Stressbedingungen wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit auftreten 12, können die HSC-Selbsterneuerungskapazität beeinträchtigen und ein Ungleichgewicht in der HSC / Vorläuferdifferenzierung induzieren, indem sie übermäßige Mengen an ROS produzieren, die ATP-Produktion beeinträchtigen und / oder andere Stoffwechselprozesse verändern^9,12,13 . Störungen in der metabolischen Homöostase bei der HSC/Vorläufer-Differenzierung könnten die Hämatopoese signifikant beeinflussen und möglicherweise zur Entwicklung hämatogischer Anomalien beitragen^13. Angesichts der kritischen Einflüsse von Glykolyse und mitochondrialem OxPHOS auf die HSC-Stammheit und -Differenzierung ist es von Interesse, sowohl metabolische Parameter unter normalen als auch unter Stressbedingungen zu untersuchen. Wertvolle Einblicke in die glykolytische und mitochondriale Funktion von HSCs und Vorläuferzellen können durch die Bewertung ihrer ECAR und OCR gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.

Der extrazelluläre Flussanalysator von Seahorse ist ein leistungsstarkes Gerät, das mit zwei Sonden pro Bohrung ausgestattet ist, um ECAR und OCR in lebenden Zellen gleichzeitig zu messen und somit zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in Echtzeit als Reaktion auf verschiedene Substrate oder Inhibitoren verwendet werden kann. Die mit dem Analysator verwendete Assay-Kartusche enthält Injektionsanschlüsse, um bis zu vier Medikamente für die automatisierte Injektion während des Assays aufzunehmen. Ein Schema eines typischen Glykolyse-Stresstests ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Assay beginnt mit der Messung von ECAR von Zellen, die in Glykolyse-Stresstestmedium inkubiert werden, das Glutamin, aber nicht Glucose oder Pyruvat enthält. Dies stellt eine Versauerung dar, die aufgrund nicht-glykolytischer Aktivitäten der Zellen auftritt, und wird als nicht-glykolytische Versauerung berichtet. Es folgt die Injektion von Glukose in einer gesättigten Konzentration. Über die Glykolyse wird Glukose in der Zelle in Pyruvat umgewandelt, das im Zytoplasma weiter metabolisiert wird, um Laktat zu produzieren, oder in Mitochondrien, um CO 2 und Wasser zu produzieren_.

Die Umwandlung von Glukose in Laktat verursacht eine Nettoproduktion und anschließende Freisetzung von Protonen in das extrazelluläre Medium, was zu einem raschen Anstieg des ECAR^14,15,16 führt. Diese glukosestimulierte Veränderung der ECAR wird als Glykolyse unter basalen Bedingungen berichtet. Die zweite Injektion besteht aus Oligomycin (einem Inhibitor der ATP-Synthase, auch bekannt als Komplex V¹⁷), das die mitochondriale ATP-Produktion hemmt. Während der Oligomycin-vermittelten OxPHOS-Hemmung regulieren die Zellen die Glykolyse maximal, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Dies führt zu einem weiteren Anstieg der ECAR, der die maximale glykolytische Kapazität der Zellen offenbart. Die Differenz zwischen der maximalen glykolytischen Kapazität und der basalen Glykolyse wird als glykolytische Reserve bezeichnet. Schließlich wird 2-DG injiziert, was zu einem signifikanten Rückgang der ECAR führt, in der Regel in der Nähe von nicht-glykolytischen Säuerungsgraden. 2-DG ist ein Glukoseanalogon, das kompetitiv an die Hexokinase bindet, was zu einer Hemmung der Glykolyse¹⁸ führt. Somit bestätigt die 2-DG-induzierte Abnahme der ECAR weiter, dass die Glykolyse tatsächlich die Quelle von ECAR ist, die nach Glukose- und Oligomycin-Injektionen beobachtet wurde.

Abbildung 1B zeigt den Schaltplan für einen typischen mitochondrialen Stresstest. Der Assay beginnt mit der OCR-Basismessung der Zellen, die in mitochondrialem Stresstestmedium, das Glukose, Glutamin und Pyruvat enthält, inkubiert werden. Nach basalen OCR-Messungen wird Oligomycin in diesen Assay injiziert, das den Komplex V hemmt und dadurch den Elektronenfluss durch die Elektronentransportkette (ETC) ^reduziert17. Folglich wird die OCR als Reaktion auf die Oligomycin-Injektion reduziert, und diese Abnahme der OCR ist mit der mitochondrialen ATP-Produktion verbunden. Die zweite Injektion besteht aus Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP), einem Protonophor und einem Entkoppler des mitochondrialen OxPHOS¹⁷. FCCP kollabiert den mitochondrialen Protonengradienten, indem es den Fluss von Protonen durch die mitochondriale innere Membran ermöglicht. Aufgrund der FCCP-Injektion wird der Elektronenfluss durch das ETC unterdrückt, und Komplex IV verbraucht Sauerstoff auf dem maximalen Niveau. Der Unterschied zwischen maximaler OCR und basaler OCR wird als freie Atemkapazität bezeichnet, die ein Maß für die Fähigkeit der Zelle ist, auf einen erhöhten Energiebedarf unter Stressbedingungen zu reagieren. Schließlich wird eine Mischung aus zwei ETC-Inhibitoren (Rotenon, ein Komplex-I-Inhibitor, und Antimycin A, ein Komplex-III-Inhibitor¹⁷) injiziert, wodurch der Elektronenfluss vollständig abgeschaltet wird, und die OCR sinkt auf ein niedriges Niveau. OCR, gemessen nach Rotenon und Antimycin A-Injektion entspricht einer nicht-mitochondrialen OCR, die durch andere Prozesse in den Zellen angetrieben wird. Die nicht-mitochondriale OCR ermöglicht die Berechnung der Basalatmung, des Protonenlecks und der maximalen Atmung.

Die Basalatmung stellt den Unterschied zwischen der Baseline-OCR und der nicht-mitochondrialen OCR dar. Protonenleck bezieht sich auf den Unterschied zwischen OCR nach Oligomycin-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR. Die maximale Atmung stellt den Unterschied zwischen OCR nach FCCP-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR dar. Die Kopplungseffizienz wird als Prozentsatz der ATP-Produktionsrate zur Basalatmungsrate berechnet. Dieses Methodenpapier enthält ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in liniennegativen HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XFe96. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von Mauslinien-negativen HSPCs, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen verschiedener Medikamente, die in extrazellulären Flussassays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien.

Protokoll

Alle Tierversuche mit Wirbeltieren wurden von den Vorschriften des Ausschusses für die Verwendung und Pflege von Tieren der University of Michigan genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt.

1. Tag vor dem Assay (Gesamtzeit: ~10 min)

1. Hydratation der Sensorkartusche (Schrittzeit: ~10 min)
   1. Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit, und entfernen Sie die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe. Speichern Sie Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.
   2. Trennen Sie die Sensorkassette (den oberen grünen Teil mit Deckel) manuell von der Utility-Platte (untere 96-Well-Mikroplatte) und legen Sie sie kopfüber neben die Utility-Platte.
   3. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung der Gebrauchsplatte mit 200 μL Kalibrant, das im Lieferumfang des Flow-Assay-Kits enthalten ist.
   4. Setzen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Gebrauchsplatte und stellen Sie sicher, dass die Sensoren vollständig in das Kaliber eingetaucht sind.
   5. Legen Sie die montierte Sensorpatrone und die Gebrauchsplatte mit Kalibrant über Nacht in einen Nicht-CO₂ 37 °C Inkubator. Um eine Verdunstung des Kalibers zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Inkubator ordnungsgemäß befeuchtet ist. Wenn Sie einen normalen Ofeninkubator für Nicht-CO₂ 37 °C-Inkubationen verwenden, stellen Sie ein offenes Becherglas mit Wasser in den Inkubator, um ihn zu befeuchten. Falls verfügbar, verwenden Sie eine XF-Vorbereitungsstation für alle Nicht-CO₂ 37 °C-Inkubationen.
      HINWEIS: Alternativ kann die Sensorkartusche über Nacht mit 200 μL sterilem Reinstwasser pro Bohrung in einem Nicht-CO₂ 37 °C Inkubator hydratisiert werden. Ersetzen Sie Wasser durch 200 μL pro Bohrung von 37 °C vorgewärmtem Kalibrant, mindestens 45-60 Minuten, bevor Sie die Injektionsöffnungen am Tag des Assays laden.

2. Tag des Assays (Gesamtzeit: ~9 h 30 min)

HINWEIS: Die oben angegebene Gesamtzeit beinhaltet die kumulative Dauer der Schritte 2.1-2.4 zusätzlich zu Schritt 2.5 oder Schritt 2.6.

1. Herstellung von zellklebebeschichteten Mikrotiterplatten (Schrittzeit: ~1 h 30 min)
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitskabine durch.
   1. Pro 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte werden 2,5 ml der Zellklebelösung (22,4 μg/ml, siehe Materialtabelle) hergestellt, indem 56 μg des Zellklebers in einem geeigneten Volumen filtersterilisiertes 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,0) gelöst und sofort 1 N Natriumhydroxid bei halbem Volumen des verwendeten Zellklebstoffs zugegeben werden. Vortex oder Pipette auf und ab pipettieren, um zu mischen.
   2. Öffnen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte (im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten) und dosieren Sie 25 μL der vorbereiteten Zellklebelösung am Boden jeder Vertiefung. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 min bei Raumtemperatur in der Haube.
   3. Entfernen und verwerfen Sie nach der Inkubation überschüssige Zellklebelösung mit einer Mehrkanalpipette oder einem Aspirator und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 μL sterilem Reinstwasser. Trocknen Sie die Platte an der Luft, wobei der Deckel entfernt wurde, in der Kapuze für 30-45 min.
      HINWEIS: Zellkleberbeschichtete Zellkultur-Mikrotiterplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Vorbeschichtete Mikrotiterplatten, die bei 4 °C gelagert werden, müssen vor dem Aussäen der Zellen auf Raumtemperatur in der Haube erwärmt werden.
2. Aufbereitung von Assay-Medien (Schrittzeit: ~30 min)
   1. Erstellung von Glykolyse-Stresstest-Assay-Medium
      1. Ergänzen Sie 100 mL Basismedium (siehe Materialtabelle) mit 1 ml 200 mM L-Glutamin.
         HINWEIS: Die endgültige L-Glutaminkonzentration im Assay-Medium beträgt 2 mM.
      2. Das mit L-Glutamin versetzte Medium im Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
      3. Stellen Sie den pH-Wert des warmen Mediums mit 1 N NaOH auf 7,4 ein.
      4. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter und halten Sie es bei 37 °C, bis es gebrauchsfertig ist.
   2. Erstellung von mitochondrialem Stresstest-Assay-Medium
      1. Ergänzen Sie 100 ml des Basismediums mit 0,45 g Glukose, 1 ml 200 mM L-Glutamin und 1 ml 100 mM Natriumpyruvat.
         HINWEIS: Das endgültige Assay-Medium enthält 25 mM Glukose, 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat.
      2. Erwärmen Sie Glukose, L-Glutamin und das mit Natriumpyruvat versetzte Medium bis 37 °C in einem Wasserbad.
      3. Stellen Sie den pH-Wert des warmen Mediums mit 1 N NaOH auf 7,4 ein.
      4. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter und lagern Sie es bei 37 °C, bis es gebrauchsfertig ist.
3. Ernte von Maus-Linien-negativen HSPCs (Schrittzeit: ~3 h)
   1. Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie Hank's ausgewogene Salzlösung mit 4% fetalem Rinderserum ergänzen. Bereiten Sie den 1x-Anreicherungspuffer vor, indem Sie den 5x-Bestand mit sterilem destilliertem Wasser verdünnen. Halten Sie beide Puffer bis zum Gebrauch auf Eis.
   2. Euthanasieren Sie Mäuse auf humane Weise mit CO_2, gefolgt von zervikaler Dislokation und entfernen Sie die Hinterbeine mit einer Schere. Entfernen Sie vorsichtig alle Gewebe von den Knochen und schneiden Sie die Enden von beiden Seiten des Femurs und der Tibia mit einer Schere. Spülen Sie Knochenmarkzellen aus dem Femur und der Tibia mit dem Assay-Puffer aus. Führen Sie die gespülten Zellen durch einen sterilen 70-μm-Filter, zentrifugieren Sie das Filtrat bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C und entsorgen Sie den Überstand.
   3. Die roten Blutkörperchen werden lysiert, indem das Zellpellet in 500 μL ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2₎resuspendiert wird. Nach der Lyse für 1 min auf Eis waschen Sie die Proben mit 1 ml Assay-Puffer und zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
   4. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Proben mit einem Cocktail aus biotinylierten Antikörpern, die gegen CD2 (1:200-Verdünnung), CD3 (1:200-Verdünnung), CD5 (1:200-Verdünnung), CD8 (1:200-Verdünnung), Ter-119 (1:200-Verdünnung), B220 (1:200-Verdünnung) und Gr-1 (1:800-Verdünnung) gerichtet sind, für 45 min auf Eis in einem Gesamtvolumen von 500 μL Assay-Puffer.
   5. Waschen Sie die Proben mit 1 ml Assay-Puffer mit Zentrifugation wie oben.
   6. Waschen Sie die Proben mit 1 ml 1x Anreicherungspuffer mit Zentrifugation wie oben.
   7. Inkubieren Sie die Proben mit 20 μL Streptavidin-Nanokügelchen und 100 μL 1x Anreicherungspuffer auf Eis für 15 min.
   8. Waschen Sie die Proben mit 1 ml 1x Anreicherungspuffer mit Zentrifugation wie oben.
   9. Resuspendieren Sie die Proben in 2,5 ml 1x Anreicherungspuffer. Legen Sie sie für 5 min auf einen Trennmagneten. Sammeln Sie die Überstände separat in 15 ml konischen Röhrchen.
   10. Magnetgetrennte Proben in einem zusätzlichen 1-fachen Anreicherungspuffer von 2,5 ml suspendieren und für 5 min wieder auf den Trennmagneten legen. Überstände sammeln und kombinieren Sie die vorherigen Sammlungen in 15 ml konischen Röhrchen aus Schritt 2.3.9.
       HINWEIS: Die Überstände enthalten die liniennegativen Zellanteile.
   11. Zentrifugieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit den negativ ausgewählten Zellen für 5 min bei 200 × g bei 4 °C.
   12. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 1 ml Assay-Puffer und zählen Sie die Zellzahl mit trypan blue manuell oder über einen automatisierten Zellzähler wie eine Countess 3.
       HINWEIS: Nach dem oben beschriebenen Ansatz sollten ~ 6 ×^{10 6} liniennegative HSPCs leicht von den Hinterbeinen einer einzelnen Maus gereinigt werden. Wenn Reagenzien wie Assay-Puffer, 1x-Anreicherungspuffer und Lineage-spezifischer Antikörpercocktail am Tag vor dem Experiment hergestellt werden, dauert es ungefähr 2,5-3 Stunden, um HSPCs von 4 Mäusen anzureichern. Es würde zusätzliche 10 Minuten für jede Maus über diese Zahl hinaus dauern.
4. Seeding-Zellen in zellklebebeschichteten Mikrotiterplatten (Schrittzeit: ~1 h)
   1. Zentrifugenzellen aus Schritt 2.3.12 bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet im entsprechenden Assay-Medium (Glykolyse-Stresstestmedium oder mitochondriales Stresstestmedium). Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im entsprechenden erwärmten Assay-Medium bis zur Konzentration von 2,5 × 10 5 Zellen pro 50 μL oder⁵ × 10⁶ pro ml.
   4. Pipette 50 μL der Zellsuspension entlang der Seite jeder Vertiefung der mit Zellkleber beschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur. Pipette 50 μL des Assay-Mediums in die Eck-Hintergrundmesstöpfe. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für die Zellbeschichtung, um Konsistenz zu gewährleisten.
   5. Erstellen Sie eine Zentrifugenbilanzplatte, indem Sie 50 μL Wasser pro Bohrloch einer unbeschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte hinzufügen.
   6. Zentrifugieren Sie die Zellen in der Platte bei 200 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Bremsen Sie nicht. Überführen Sie die Platte für 25-30 min in einen Nicht-CO₂ 37 °C Inkubator, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig angeschlossen sind. Bestätigen Sie visuell unter dem Mikroskop, dass die Zellen stabil auf der Mikrotiterplattenoberfläche haften.
      HINWEIS: Da ~ 6 × 10⁶ lineage-negative HSPCs aus den Hinterbeinen einer einzelnen Maus geerntet werden können, werden HSPCs, die von 4 Mäusen (~ 2,4 × 10⁷ Zellen) isoliert wurden, benötigt, um eine ganze 96-Well-Platte zu füllen, wenn das Ziel darin besteht, mehrere Interventionen ex vivo parallel zu screenen. Wenn es jedoch darum geht, die Auswirkungen einer genetischen Veränderung oder eines Eingriffs auf die metabolischen Parameter von HSPCs in vivo zu untersuchen, können HSPCs, die aus mehreren Paaren von Kontroll- und Testmäusen isoliert wurden, in mehreren technischen Replikaten parallel mit einer einzigen Platte analysiert werden.
5. Durchführung eines Glykolyse-Stresstests mit dem extrazellulären Flussanalysator (Schrittzeit: ~3 h 30 min)
   1. Beschickungssensorpatrone mit Injektionsmassen
      1. Es werden 100 mM Glukose, 20 μM Oligomycin und 500 mM 2-DG-Lösungen in vorgewärmtem Glykolyse-Stresstest-Assay-Medium (pH 7,4) hergestellt.
         HINWEIS: Alle injizierenden Verbindungslösungen werden in 10-facher Konzentration hergestellt. Die Endkonzentrationen der Vertiefung betragen 10 mM für Glukose, 2 μM für Oligomycin und 50 mM für 2-DG (siehe Tabelle 1).
      2. Entfernen Sie die hydratisierte Sensorkartusche aus dem Nicht-CO₂ 37 °C-Inkubator aus Schritt 1.1.5. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Kalibrant in der Gebrauchsplatte, indem Sie die Sensorpatrone aus dem Kalibrant herausheben und auf derselben Gebrauchsplatte mit dem Kalibrant ersetzen.
      3. Platzieren Sie die A/D-Ladeführung flach (im extrazellulären Flux-Assay-Kit enthalten) auf der Oberseite der Sensorkassette und richten Sie sie so aus, dass sich der Buchstabe "A" in der oberen linken Ecke befindet, um sicherzustellen, dass nur Anschlüsse A zum Laden zur Verfügung stehen. Mit einer Mehrkanalpipette 20 μL 100 mM Glucoselösung in Port A dosieren.
      4. Ersetzen Sie die A/D-Ladeführung flach durch die B/C-Ladeführung flach und orientieren Sie sich so, dass sich der Buchstabe "B" in der oberen linken Ecke befindet, um sicherzustellen, dass nur Anschlüsse B zum Laden verfügbar sind. Mit einer Mehrkanalpipette 22 μL 20 μM Oligomycinlösung in Port B dosieren.
      5. Richten Sie die B/C-Ladeführung flach aus, um den Buchstaben "C" in der oberen linken Ecke für Ladeanschlüsse C zu finden. Dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 μL 500 mM 2-DG-Lösung in Ports C.
      6. Entfernen und entsorgen Sie die Ladeführungsflats.
         HINWEIS: Es ist wichtig, dass jede Portreihe aller 96 Wells, einschließlich derjenigen der Hintergrundwellen, vollständig mit dem gleichen Volumen der injizierenden Verbindung geladen wird.
   2. Vorlagenerstellung, Kalibrierung und Messungen
      1. Erstellen oder laden Sie die Vorlage für den Glykolyse-Stresstest auf dem Controller. Geben Sie Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu. Weisen Sie die 4 Eckvertiefungen für Hintergrundmessungen zu.
      2. Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden.
      3. Stellen Sie für die Basismessung und die Messungen nach jeder Injektion (Glukose, Oligomycin und 2-DG) die Anzahl der Messzyklen auf 3 und Mischen - Warten - Messzeiten auf 3 min - 0 min - 3 min ein (siehe Tabelle 2).
      4. Entfernen Sie den Deckel von der mit Compounds beladenen und hydratisierten Sensorpatrone, die in Kalibrant in die Utility-Platte eingetaucht ist. Legen Sie es auf das Arbeitsfach des extrazellulären Flussanalysators und beginnen Sie den Lauf.
         HINWEIS: Der erste Schritt ist die Kalibrierung, die normalerweise ~ 20 Minuten dauert.
      5. Nehmen Sie die Mikrotiterplatte mit den Zellen aus dem Nicht-CO 2 37 °C Inkubator aus Schritt 2.4.6 heraus, nachdem 25-30 min Inkubation vorbei ist. Ohne die Zellen zu stören, fügen Sie langsam 130 μL des vorerwärmten Glykolyse-Stresstestmediums (pH 7,4) pro Vertiefung hinzu, um das Mediumsvolumen in jeder Vertiefung auf 180 μL zu erhöhen, und bringen Sie die Platte für weitere 15-20 min in den Nicht-CO₂ 37 °C-Inkubator zurück.
         HINWEIS: Eine Gesamtinkubationszeit von 45-60 min nach der Zentrifugation wird bevorzugt.
      6. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Utility-Platte durch die Assay-Mikroplatte (ohne Deckel), die die Zellen enthält. Drücken Sie die Wägezellenplatte, um die Messungen zu starten, die ~ 1,5 Stunden für den Abschluss des Assays benötigen.
      7. Nachdem die Messungen abgeschlossen sind, sammeln Sie die Assay-Mikroplatte, die die Zellen enthält, und entfernen Sie das Assay-Medium, ohne die Zellen zu stören. Einmal vorsichtig mit 250 μL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, ohne die Zellen zu verdrängen.
      8. 10 μL RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na-Desoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), ergänzt mit 1x Proteaseinhibitor-Cocktail, zu jeder Vertiefung geben und die Platte auf einem Shaker für 10 min rühren. Den ganzen Teller bei -80 °C einfrieren.
      9. Tauen Sie die Platte auf und führen Sie einen Proteinmesstest zur Datennormalisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      10. Abrufen und Analysieren der Daten. Öffnen Sie die Datendatei mit der Wave Desktop Software. Klicken Sie auf Normalisieren und fügen Sie die Normalisierungswerte für jedes Bohrloch ein. Klicken Sie auf Übernehmen , um die Daten zu normalisieren. Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Glykolyse-Stresstest-Berichtsgenerator, um die analysierten Daten in einen Berichtsgenerator zu exportieren. Alternativ können Sie die Daten in eine externe Anwendung exportieren.
          HINWEIS: Alternativ kann der gesamte Kern-DNA-Gehalt in jedem Bohrloch verwendet werden, um die Daten zu normalisieren. Ein fluoreszierender Farbstoff wie CyQuant, der an Nukleinsäure bindet, kann verwendet werden, um den gesamten Kern-DNA-Gehalt pro Bohrloch zu beurteilen.
6. Durchführung eines mitochondrialen Stresstests mit dem extrazellulären Flussanalysator (Schrittzeit: ~3 h 30 min)
   1. Beschickungssensorpatrone mit Injektionsmassen
      1. Es werden 20 μM Oligomycin, 20 μM FCCP und 5 μM Rotenon + 5 μM Antimycin A-Lösungen in vorgewärmtem mitochondrialem Stresstest-Assay-Medium (pH 7,4) hergestellt.
         HINWEIS: Alle injizierenden Verbindungslösungen werden in 10-facher Konzentration hergestellt. Die Endkonzentrationen der Vertiefung betragen 2 μM für Oligomycin, 2 μM für FCCP und jeweils 0,5 μM für Rotenon und Antimycin A (siehe Tabelle 3).
      2. Entfernen Sie die hydratisierte Sensorpatrone aus dem 37 °C Inkubator aus Schritt 1.1.5 und entfernen Sie Luftblasen, wie zuvor in Schritt 2.5.1.2 beschrieben.
      3. Durch Ausführen der Schritte 2.5.1.3 bis 2.5.1.6 werden 20 μL 20 μM Oligomycin in Port A, 22 μL 20 μM FCCP in Port B und 25 μL einer Mischung aus 5 μM Rotenon und 5 μM Antimycin A in Port C abgegeben.
         HINWEIS: Es ist wichtig, dass jede Portreihe aller 96 Wells, einschließlich derjenigen der Hintergrundwellen, vollständig mit dem gleichen Volumen der injizierenden Verbindung geladen wird.
   2. Vorlagenerstellung, Kalibrierung und Messungen
      1. Erstellen oder laden Sie die Vorlage für den mitochondrialen Stresstest auf dem Controller. Geben Sie Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu. Weisen Sie die 4 Eckvertiefungen für Hintergrundmessungen zu.
      2. Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden.
      3. Für die Baseline-Messung und die Messungen nach jeder Injektion (Oligomycin, FCCP und Rotenon + Antimycin A) legen Sie die Anzahl der Messzyklen auf 3 fest und Mischen - Warten - Messzeiten auf 3 min - 0 min - 3 min (siehe Tabelle 4).
      4. Starten Sie den Lauf, um die Kalibrierung wie in Schritt 2.5.2.4 durchzuführen.
      5. 130 μL des vorgewärmten mitochondrialen Stresstestmediums (pH-Wert 7,4) werden wie in Schritt 2.5.2.5 zugegeben.
      6. Starten Sie die Messungen; Abrufen und Analysieren der Daten wie in den Schritten 2.5.2.6 bis 2.5.2.10. Exportieren Sie die analysierten Daten in den mitochondrialen Stresstestberichtsgenerator oder eine externe Anwendung.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll wurden die Zellzahl und die Konzentrationen verschiedener OxPHOS-Targeting-Medikamente (die in den extrazellulären Flussassays verwendet werden) optimiert, um ECAR und OCR von HSPCs zu messen, die aus 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Zunächst wurde der Glykolyse-Stresstest durchgeführt, um die Zellzahl und die Oligomycinkonzentration zu optimieren. In diesem Assay wurde eine unterschiedliche Anzahl von HSPCs pro Bohrloch im Bereich von 5 × 10⁴ bis 2,5 × 10

Diskussion

Diese Methodenarbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik (Glykolyse und OxPHOS) in Maus-HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse. Dieses Gerät ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das gleichzeitig die ECAR und OCR lebender Zellen misst, bei denen es sich um Metriken der Glykolyse bzw. der mitochondrialen Atmung handelt. So kann es verwendet werden, um die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die 96-Well-Microplate-basierte P...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate