采用气培系统进行大麻的克隆繁殖

摘要

该协议旨在通过实施气培系统为 大麻苜蓿 L.的克隆繁殖提供指导信息。这里描述的方法包括成功再现大麻属中理想的形态学和化学性质所需的所有用品和 方案。

摘要

该协议描述了通过利用气培系统实现大麻有效克隆繁殖技术的标准化。从两个大麻品种中切除了主要的芽插条，命名为"樱桃酒"和"红罗宾"（17-20%w / w CBD），作为"母株"。在放入系统之前，应用生长素前体（吲哚-3-丁酸）来刺激切除插条基部的根系发育。插条每三天用营养雾溶液轻轻喷雾，以提供营养支持，因为溶液含有必需的常量营养素，包括氮，磷和钾。气培系统储水器的pH值范围保持在5.0-6.0之间，水温在20-22°C之间。 使用潜水水泵将水输送到岩屑中。每天为芽尖插条提供24小时的光照，持续10天，直到根部发育发生，在此上移植根部插条用于研究目的。这些气培系统已被证明可以为 大麻 的繁殖产生理想的结果。这里描述的方法减轻了传统方法产生的潜在时间限制，以便为 大麻的无性繁殖提供更有效的手段。

引言

大麻 L.是一种一年生的，雌雄异株的开花植物，属于大麻科。大麻素主要在位于雌性花序苞片组织外表皮层的腺体毛状体内产生¹，正在成为越来越受欢迎的研究课题，主要是因为它们逐渐认识到药用特性。大麻二酚（CBD）是 大麻 中仅次于^Δ9-四氢大麻酚（THC）的第二大最突出的大麻素，具有许多药用益处，包括镇痛特性²，抗癫痫特性³，抗抑郁特性⁴，降低糖尿病风险⁵和治疗各种睡眠障碍⁶。由于 大麻 植物的代谢物具有多种健康益处，因此对其商业规模生产的需求不断增长⁷。为了满足这一需求，种植方法不断得到改进和重塑，以不断为新兴的 大麻 行业提供一致，高质量的植物材料。

大麻的繁殖可以通过两种方式促进:有性繁殖或无性繁殖。有性繁殖的一个例子是用雄性雄蕊的花粉为雌性胚珠授粉，从而产生可以发芽的种子。种子发芽是一种可靠的栽培方法，已用于育种和栽培目的，其中在亲本系中选择理想的表型性状，以提高后代大麻植物的质量，包括耐旱性状，抗虫性状，增加产量和增加效力等性状⁸.然而，在进行有性繁殖时，意外的异花授粉是一种固有的风险，导致不良后代，从而导致理想性状的潜在丧失或引入不需要的性状。大麻种植者接受用THC生产花粉授粉的大麻种子，导致由于不合规的植物（>0.3%总THC w / w）而导致的重大经济损失，突出了这种意外授粉的一个例子⁹。此外，为了生产仅由雌性组成的作物，必须播种女性化的种子而不是非女性化的种子，这可能导致雌雄同体和其他不良特征，从而导致经济损失。为了克服大麻有性繁殖的局限性，无性繁殖已在大麻行业的商业生产模式中广泛实施¹⁰。

大麻的无性繁殖只需要一种植物，这允许单一基因型的繁殖，从而允许商业生产具有理想农艺和药物性状的植物。无性大麻繁殖的一种常见形式是将雌性植物的一小部分切割并插入无土基质¹¹中，该基质被湿度圆顶覆盖以诱导根的形成。虽然这种方法已被证明是成功的，但一个共同的缺点是圆顶内积聚了高水平的湿度（通常为80%或更高），为真菌病原体提供了理想的生长环境，这可能对新的敏感插条有害。另一种形式的无性繁殖是使用组织培养的微繁殖，其中无菌技术允许昆虫，微生物和无病毒的大麻植物材料在有限的空间内繁殖¹²。然而，这个过程是昂贵，耗时的，需要训练有素的实验室技术人员，而大型大麻设施通常无法进入。

关于 大麻克隆繁殖的已发表研究报告很少。为了为理解用于研究目的和工业生产的 大麻 的无性繁殖提供基础，本研究旨在证明采用气培系统进行 大麻克隆繁殖的易用性和可及性。气培系统是 大麻无性繁殖的理想选择，始终如一地为插条提供营养丰富的水，及时诱导早期根系形成，并在需要时允许植物无限期地维持。

研究方案

1. 生成用于克隆繁殖的母株

1. 选择一种健康的雌性母株，该母株表现出与其预期用途特有的理想形态和化学特征。
2. 让母株达到适当的大小（大约25个成熟芽）以进行克隆繁殖（即插条）。
3. 让母株保持在营养生长阶段（浅色:深色= 18小时:6小时），以促进芽生长以备将来繁殖。

2. 气培系统的建设和制备

1. 首先将盖子放在容器顶部（38.1 厘米 x 25.4 厘米 x 30.48 厘米）。在盖子上钻所需数量的孔，同时在每个孔之间提供足够的空间（最好是3厘米）。
2. 将水泵（物料表）放置在容器的中心。
3. 将7-8升蒸馏水倒入容器中，使泵喷嘴保持在水线上方约2.5厘米处。
   注意:这可确保潜水水泵（材料表）能够以足够的力推动水以扩散到容器盖上。建议使用蒸馏水;但是，也可以使用普通的自来水。
4. 将适量的岩棉立方体（3.81厘米）（材料表）或所选的培养基立方体放入每个插槽中。打开泵，让它运行24小时。
   注意:岩棉立方体是首选，因为它们在新根的插条上具有"锚定"能力，有助于在移植后保持植物直立。

3. 选择和切除合适的芽

1. 使用无菌的手术刀或剪刀收集根尖分生组织附近的芽。扦插长度约为10厘米，理想情况下有几个节点。
   注意:以 45° 角切割阀杆。以45°角切割会增加切割基部的表面积，为根系发育留出更多空间。在45°切割的中间做一个小切口（1-2厘米）是可选的，以进一步增加表面积。
2. 除前三个节点上存在的树叶外，除所有树叶外。
3. 将新切除的切口浸入含有吲哚-3-丁酸（IBA）的生根溶液中（材料表），从茎基部向上约2-5厘米约5秒。
4. 将切口插入位于气培系统中的岩棉立方体的中心。
   注意:切割插入深度应保持在距岩棉立方体底部约1-2厘米的位置。
5. 每3天用营养雾溶液（材料表）喷洒未连根的插条。
6. 在24-29°C和40-60%相对湿度下，每天用光照18-24小时光照，光合光子通量密度（PPFD）为100μmol^/m2/s，每天生长插条。

4. 气培系统维护和繁殖体健康

1. 每2-5天用pH值在5.0-6.0之间的水补充系统。
2. 每3天用营养雾溶液（材料表）轻轻喷洒插条（每次切割一次雾）。
3. 每3-5天向储液罐中加入5 mL每种营养液（材料表）。
   注意:营养添加导致水呈棕色和浑浊。
4. 每5天每10升水加入15毫升含有次氯酸（0.028%）的藻类和细菌清洁溶液（材料表）。

5. 移植繁殖体

1. 选择具有长，白色，纤维状根的插条。
   注意:避免使用棕色，粘稠和短根系的插条，因为这是根腐病存在的指标，通常需要更长的时间才能适应新的生长介质，并可能带来不必要的疾病。
2. 小心地将岩棉立方体从系统中移开并解开根部。
3. 将 大麻 繁殖体移植到充满营养土壤混合物的4L育苗盆中（材料表）。
   注意:建议立即浇水，以防止根部变干。

6. 气培系统的清洁和储存

1. 当系统不再使用时，用水清洗，并用70%乙醇或其他消毒剂清洁。
2. 从水泵上取下过滤器，然后用水冲洗以清除碎屑。
3. 用纸巾或毛巾擦拭系统，擦干系统。
4. 将泵放在盖上盖子的浴缸内，然后将其存放直至需要为止。

结果

为了验证所描述的气培系统的效率，分别从母株中切除了10个和12个健康的14厘米长的芽，分别是"樱桃酒"和"红罗宾"（图1A，B）。浸入生根诱导培养基后，将克隆放入系统（图2A）。气培系统的构造和运行如图 2A所示。

适应2天后，所有克隆在3-7天内开始发育根系，并在系统上10-14天后完全发育出37 ...

讨论

随着对大麻素含量一致的 大麻 植物的需求不断增加 ，大麻工业 中已经利用了各种克隆繁殖方法。与有性方法相比，无性繁殖显示出大规模，一致生产的几个优点。气培繁殖系统是水培系统的改良版本，利用充气的营养丰富的水雾来提供快速的根部发育。所描述的气培系统由三个关键步骤组成，1）产生健康的雌性 大麻 "母"植物作为所需物理/化学性状的遗传源，2）切割芽（?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-part Fox Farm	Fox Farm		Soil Mix
1-part Promix	Promix		Soil Mix
1-part Roots Organic Original	Auora Innovations		Soil Mix
1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings	UNCO Industries		Soil Mix
Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez)	EZ Clone	SKU#: 225	8 fl. Oz.
Artificial Lighting	AgroBrite	SKU#: 1399	T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps
Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine)	Summit CBD	N/A	Donated material
Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine)	Trilogene	SKU: 0101RR
Corresponding Plastic Lid	Office Depot	N/A	38.1 cm x 25.4 cm
Drill Bit 1	Dewalt	DW1586	38.1 mm spade drill bit
Drill Bit 2	Dewalt	DW1308	3.175 mm drill bit
Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL	General Hydroponics	SKU#: 726	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%)
FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL	General Hydroponics	SKU#: 724	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%))
FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL	General Hydroponics	SKU#: 759	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%))
Horticultural Scissors	Shear Perfection	SKU#: 12620	Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4")
Isopropyl Alcohol	Equate	Walmart # 574133562	70% concentration
Nutrient Mist Solution (Clonex Mist)	Growth Technology	SKU#: 4889	10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %)
pH Down	General Hydroponics	SKU#: 733	946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg)
pH Up	General Hydroponics	SKU#: 730	946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg)
Plastic Container	Office Depot	N/A	38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm
Power Drill	Dewalt	DCD709B	20-Volt Max ½” Drill
Rockwool Cubes	Grodan	SKU#: 830	38.1 mm
Rooting Solution (Clonex Rooting Gel)	Growth Technology	SKU#: 939	3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%)
Statistic Software (Prism)	GraphPad Inc.
Submersible Water Pump	ActiveAQUA	SKU: AAPW250	Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W