Использование аэропонных систем для клонального распространения каннабиса

Резюме

Этот протокол предназначен для предоставления инструктивной информации для клонального распространения Cannabis sativa L. путем реализации аэропонных систем. Способ, описанный здесь, включает в себя все необходимые материалы и протоколы для успешного воспроизведения желаемых морфологических и химических свойств в роде Cannabis.

Аннотация

Этот протокол описывает стандартизацию эффективного метода клонального распространения конопли с использованием аэропонных систем. Первичные побеги черенков были вырезаны из двух сортов конопли, названных «Вишневое вино» и «Красный робин» (17-20% мас./мас. КБД), которые служили «материнским растением». Предшественник ауксина (индол-3-масляная кислота) применяли для стимуляции развития корней в базальной части иссеченных черенков перед помещением в систему. Черенки слегка запотевали раствором питательного тумана каждые три дня, чтобы обеспечить питательную поддержку, поскольку раствор содержит необходимые макроэлементы, включая азот, фосфор и калий. Резервуар для воды аэропонной системы поддерживал диапазон рН между 5,0-6,0 и температурой воды между 20-22 °C. Погружной водяной насос использовался для подачи воды к черенкам. Черенка кончика побега обеспечивали 24 ч света в сутки в течение 10 дней до тех пор, пока не произошло развитие корней, на что корневые черенки пересаживали в исследовательских целях. Эти аэропонные системы доказали, что дают желаемые результаты для распространения каннабиса . Метод, описанный здесь, смягчает потенциальные временные ограничения, возникающие в результате традиционных методов, чтобы обеспечить более эффективные средства для бесполого распространения каннабиса.

Введение

Каннабис сатива L. является однолетним, двудомным, цветущим растением, классифицированным в семействе Cannabaceae. Каннабиноиды, продуцируемые преимущественно в железистых трихомах, расположенных на наружном эпидермальном слое прицветных тканей на женских соцветиях1, становятся все более популярной темой исследований, прежде всего благодаря их прогрессивно признанным лекарственным свойствам. Каннабидиол (КБД) является вторым наиболее заметным каннабиноидом, обнаруженным в каннабисе после Δ9-тетрагидроканнабинола (ТГК), и приписывается множеству лекарственных преимуществ, включая обезболивающие ^{свойства2}, противосудорожные ^{свойства3}, антидепрессивные ^{свойства4}, снижение риска развития ^{диабета5} и лечение различных расстройств ^сна6. Из-за множества преимуществ для здоровья, связанных с метаболитами растения каннабис, существует растущий спрос на его коммерческое ^{производство7}. Чтобы удовлетворить этот спрос, методы выращивания постоянно совершенствуются и изобретаются заново, чтобы постоянно поставлять последовательный, высококачественный растительный материал для развивающейся индустрии каннабиса.

Размножение каннабиса может быть облегчено двумя способами: половым или бесполым размножением. Примером полового размножения является опыление женской яйцеклетки пыльцой из тычинки самца, в результате чего получается семя, которое может прорастать. Прорастание семян является надежным методом выращивания, который использовался для целей селекции и культивирования, где желательные фенотипические признаки выбираются в родительских линиях для улучшения качества потомства растений каннабиса, включая такие черты, как засухоустойчивость, устойчивость к насекомым, повышение урожайности и повышение потенции8 . Однако непреднамеренное перекрестное опыление является неотъемлемым риском при выполнении полового размножения, вызывая нежелательное потомство, что приводит к потенциальной потере желательных признаков или введению нежелательных признаков. Примером этого непреднамеренного опыления являются производители конопли, получающие семена конопли, опыляемые пыльцой, производящей ТГК, что приводит к значительным экономическим потерям из-за несоответствующих растений (>0,3% общего содержания ТГК по весу)⁹. Кроме того, чтобы создать культуру, состоящую только из самок, необходимо посеять феминизированное семя вместо нефеминизированного семени, что может привести к гермафродитизму и другим нежелательным признакам, приводящим к экономическим потерям. Чтобы преодолеть ограничение полового размножения каннабиса, бесполое размножение широко практикуется в коммерческих моделях производства индустрии каннабиса10.

Бесполое размножение каннабиса требует только одного растения, что позволяет размножаться на один генотип, что позволяет производить коммерческие растения, несущие желаемые агрономические и фармацевтические признаки. Распространенной формой бесполого размножения каннабиса является вырезание и вставка небольших частей женского растения в беспочвенный ^{субстрат11} , который покрыт куполом влажности, чтобы вызвать образование корней. Хотя этот метод оказался успешным, общим недостатком является накопление высокого уровня влажности (обычно 80% или выше) внутри купола, обеспечивая идеальную среду роста для грибковых патогенов, которые могут быть вредными для новых, чувствительных черенков. Другой формой бесполого размножения является микроразмножение с использованием культуры тканей, где стерильные методы позволяют размножать растительный материал каннабиса без насекомых, микробов и вирусов в ограниченном ^{пространстве12}. Этот процесс, однако, является дорогостоящим, трудоемким и требует подготовки лаборантов, которые, как правило, недоступны для крупномасштабных объектов каннабиса .

Существует очень мало опубликованных отчетов об исследованиях по клональному размножению каннабиса. Чтобы обеспечить основу для понимания бесполого размножения каннабиса в исследовательских целях и промышленном производстве, это исследование было направлено на демонстрацию простоты и доступности использования аэропонных систем для клонального распространения каннабиса. Аэропонные системы идеально подходят для бесполого размножения каннабиса, последовательно поставляя богатую питательными веществами воду черенкам, своевременно вызывая раннее корнеобразование и позволяя поддерживать растение бесконечно, если это необходимо.

протокол

1. Генерация материнского растения для клонального размножения

1. Выберите здоровое женское материнское растение, которое проявляет желательные морфологические и химические характеристики, характерные для его предполагаемого использования.
2. Дайте материнскому растению достичь соответствующего размера (примерно 25 зрелых побегов) для клонального размножения (т.е. черенков).
3. Позвольте материнским растениям оставаться в вегетативной стадии роста (светлый: темнота = 18 ч: 6 ч), чтобы способствовать росту побегов для будущего размножения.

2. Конструирование и подготовка аэропонной системы

1. Начните с размещения крышки поверх контейнера (38,1 см x 25,4 см x 30,48 см). Просверлите нужное количество отверстий в крышке, обеспечивая при этом достаточное пространство (предпочтительно 3 см) между ними.
2. Расположите водяной насос (Таблицу материалов) в центре контейнера.
3. Налейте 7-8 л дистиллированной воды в емкость так, чтобы сопло насоса оставалось примерно на 2,5 см выше ватерлинии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что погружной водяной насос (Таблица материалов) способен толкать воду с достаточным усилием, чтобы распространиться по крышке контейнера. Рекомендуется дистиллированная вода; тем не менее, обычная водопроводная вода также может быть использована.
4. Поместите соответствующее количество кубиков минеральной ваты (3,81 см) (Таблица материалов) или кубиков носителей по выбору в каждый слот. Включите насос и дайте ему работать в течение 24 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кубики минеральной ваты предпочтительны из-за их способности «закреплять» на недавно укоренившихся черенках, которые помогают поддерживать растения в вертикальном положении после пересадки.

3. Отбор и вырезание соответствующих побегов

1. Собирайте побеги возле апикальной меристемы с помощью стерилизованного скальпеля или ножниц. Черенки имеют длину ~10 см, в идеале с несколькими узлами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обрежьте стебель под углом 45°. Резка под углом 45° увеличивает площадь поверхности базальной части черенка, предоставляя больше пространства для развития корней. Необязательно сделать небольшую щель (1-2 см) в середине разреза на 45° для дальнейшего увеличения площади поверхности.
2. Удалите всю листву, кроме листвы, присутствующей на трех верхних узлах.
3. Окуните вновь иссеченный черенок в раствор для укоренения, содержащий индол-3-масляную кислоту (IBA) (Таблица материалов) ~2-5 см вверх от основания стебля на ~5 с.
4. Вставьте разрез в центр куба Rockwool, расположенного в аэропонной системе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина режущей вставки должна оставаться ~1-2 см от дна куба Rockwool.
5. Опрыскивайте неукорененные черенки раствором питательного тумана (Таблица материалов) каждые 3 дня.
6. Выращивают черенки с 18-24 ч света в сутки с плотностью потока фотонов фотосинтеза (PPFD) 100 мкмоль/^м2/с при 24-29 °C и относительной влажности 40-60%.

4. Обслуживание аэропонной системы и здоровье пропагулы

1. Пополняйте систему водой при рН между 5,0-6,0 каждые 2-5 дней.
2. Слегка опыляйте черенки (по одному туману на черенок) раствором питательного тумана (Таблица материалов) каждые 3 дня.
3. Добавляйте 5 мл каждого питательного раствора (таблица материалов) в резервуар каждые 3-5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление питательных веществ приводит к тому, что вода становится коричневой и мутной.
4. Добавляйте 15 мл раствора для очистки водорослей и бактерий, содержащего хлорноватистую кислоту (0,028%), на 10 л воды каждые 5 дней (Таблица материалов).

5. Пересадка пропагул

1. Выбирайте черенки с длинными, белыми, волокнистыми корнями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте черенков с коричневой, слизистой и короткой корневой системой, так как это является показателем наличия корневой гнили и обычно занимает больше времени для акклиматизации к новой питательной среде и может принести нежелательные заболевания.
2. Осторожно вытесните куб Rockwool из системы и распутайте корни.
3. Пересадите пропагулы каннабиса в детский горшок объемом 4 л, наполненный питательной почвенной смесью (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленно поливать, чтобы предотвратить высыхание корней.

6. Очистка и хранение аэропонной системы

1. Когда система больше не используется, промойте водой и очистите 70% этанолом или другим дезинфицирующим средством.
2. Снимите фильтр с водяного насоса и промойте водой, чтобы удалить мусор.
3. Высушите систему, протерев ее бумажными полотенцами или мочалкой.
4. Поместите насос внутрь ванны с крышкой и храните его до тех пор, пока он не понадобится.

Результаты

Чтобы проверить эффективность описанной аэропонной системы, в общей сложности 10 и 12 здоровых побегов длиной 14 см были вырезаны из материнских растений, «Вишневое вино» и «Красный робин», соответственно (рисунок 1A, B). После погружения в индукционные среды укоре?...

Обсуждение

С ростом спроса на растения каннабиса с постоянным содержанием каннабиноидов, различные методы клонального размножения были использованы в индустрии каннабиса . Бесполое размножение показывает несколько преимуществ перед сексуальными методами для крупномасштабного, посл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-part Fox Farm	Fox Farm		Soil Mix
1-part Promix	Promix		Soil Mix
1-part Roots Organic Original	Auora Innovations		Soil Mix
1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings	UNCO Industries		Soil Mix
Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez)	EZ Clone	SKU#: 225	8 fl. Oz.
Artificial Lighting	AgroBrite	SKU#: 1399	T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps
Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine)	Summit CBD	N/A	Donated material
Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine)	Trilogene	SKU: 0101RR
Corresponding Plastic Lid	Office Depot	N/A	38.1 cm x 25.4 cm
Drill Bit 1	Dewalt	DW1586	38.1 mm spade drill bit
Drill Bit 2	Dewalt	DW1308	3.175 mm drill bit
Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL	General Hydroponics	SKU#: 726	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%)
FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL	General Hydroponics	SKU#: 724	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%))
FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL	General Hydroponics	SKU#: 759	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%))
Horticultural Scissors	Shear Perfection	SKU#: 12620	Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4")
Isopropyl Alcohol	Equate	Walmart # 574133562	70% concentration
Nutrient Mist Solution (Clonex Mist)	Growth Technology	SKU#: 4889	10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %)
pH Down	General Hydroponics	SKU#: 733	946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg)
pH Up	General Hydroponics	SKU#: 730	946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg)
Plastic Container	Office Depot	N/A	38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm
Power Drill	Dewalt	DCD709B	20-Volt Max ½” Drill
Rockwool Cubes	Grodan	SKU#: 830	38.1 mm
Rooting Solution (Clonex Rooting Gel)	Growth Technology	SKU#: 939	3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%)
Statistic Software (Prism)	GraphPad Inc.
Submersible Water Pump	ActiveAQUA	SKU: AAPW250	Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W