Esrarın Klonal Yayılımı için Aeroponik Sistemlerin Kullanımı

Özet

Bu protokol, aeroponik sistemler uygulayarak Esrar sativa L.'nin klonal yayılımı için eğitici bilgiler sağlamak üzere tasarlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, Esrar cinsinde arzu edilen morfolojik ve kimyasal özellikleri başarıyla çoğaltmak için gerekli tüm malzemeleri ve protokolleri içerir.

Özet

Bu protokol, aeroponik sistemler kullanılarak kenevirin verimli bir klonal yayılma tekniğinin standardizasyonunu açıklar. Birincil sürgün kesimleri, 'ana bitki' olarak hizmet veren "Cherry Wine" ve "Red Robin" (17-20% w/ w CBD) adlı iki kenevir çeşidinden çıkarıldı. Sisteme yerleştirilmeden önce eksizyon kesimlerinin bazal kısmında kök gelişimini teşvik etmek için bir yardımcı öncül (indole-3-bütirik asit) uygulandı. Çözelti azot, fosfor ve potasyum da dahil olmak üzere temel makro besin maddelerini içerdiğinden, kesimler her üç günde bir besin buharı çözeltisi ile hafifçe buğulandı. Aeroponik sistem su rezervuarı 5.0-6.0 arasında pH aralığını ve 20-22 °C arasında bir su sıcaklığını korudu. Kesimlere su ulaştırmak için dalgıç su pompası kullanıldı. Sürgün ucu kesimleri, kök gelişimi gerçekleşene kadar 10 gün boyunca günde 24 saat ışıkla sağlandı ve köklenmiş kesimler araştırma amacıyla nakledildi. Bu aeroponik sistemlerin Esrar yayılımı için arzu edilen sonuçlar ürettiği kanıtlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, Esrarın aseksüel yayılması için daha verimli bir araç sağlamak için geleneksel yöntemlerden kaynaklanan potansiyel zaman kısıtlamalarını hafifletir.

Giriş

Esrar sativa L. Cannabaceae familyasında sınıflandırılan yıllık, dioecious, çiçekli bir bitkidir. Ağırlıklı olarak kadın çiçeklenmeleri üzerindeki bract dokuların dış epidermal tabakasında bulunan glandüler trikomlar içinde üretilen kannabinoidler1, öncelikle giderek tanınan tıbbi özellikleri nedeniyle giderek daha popüler bir araştırma konusu haline gelmektedir. Kannabidiol (CBD), Esrar'da Δ9-tetrahidrokannabinolden (THC) sonra bulunan ikinci en belirgin kannabinoiddir ve analjezik ^özellikler2, anti-nöbet ^{özellikleri3}, antidepresan ^{özellikleri4}, diyabet riskini ^azaltmak5 ve çeşitli uyku bozukluklarını tedavi etmek dahil olmak üzere bir dizi tıbbi faydaya ^atfedilir6. Esrar bitkisinin metabolitleri ile ilişkili sağlık yararlarının çokluğu nedeniyle, ticari ölçekli üretimine artan bir talep ^var7. Bu talebi karşılamak için, gelişmekte olan Kenevir endüstrisine sürekli tutarlı, yüksek kaliteli bitki materyali tedarik etmek için yetiştirme yöntemleri sürekli olarak geliştirilmekte ve yeniden icat edilmektedir.

Esrarın yayılması iki şekilde kolaylaştırılabilir: cinsel veya aseksüel üreme. Cinsel üremeye bir örnek, bir erkeğin stameninden polen içeren bir dişi ovül tozlaşmasıdır ve bu da çimlenebilen bir tohumla sonuçlanır. Tohum çimlenmesi, kuraklık toleransı, böcek direnci, artan verim ve artan potens gibi özellikler de dahil olmak üzere, yavruların kalitesini artırmak için ebeveyn hatlarında arzu edilen fenotipik özelliklerin seçildiği üreme ve yetiştirme amacıyla kullanılan güvenilir bir yetiştirme ^yöntemidir8 . Bununla birlikte, istenmeyen çapraz tozlaşma, cinsel üreme yaparken doğal bir risktir, istenmeyen yavrulara neden olarak, arzu edilen özelliklerin potansiyel kaybına veya istenmeyen özelliklerin tanıtılmasına neden olan. Bu istenmeyen tozlaşmanın bir örneği, THC üreten polenlerle tozlaşmış kenevir tohumu alan kenevir yetiştiricileri tarafından vurgulanır ve bu da uyumsuz bitkiler nedeniyle önemli ekonomik kayba neden olur (>0.3% toplam THC w/ w)⁹. Ek olarak, sadece dişilerden oluşan bir ürün üretmek için, kadınsı olmayan bir tohum yerine kadınsı bir tohum ekilmelidir, bu da hermafroditme ve ekonomik kayba yol açan diğer istenmeyen özelliklere yol açabilir. Esrarın cinsel üreme sınırlamasının üstesinden gelmek için, aseksüel üreme Esrar endüstrisinin ticari üretim modellerinde yaygın olarak ^{uygulanmıştır10}.

Esrarın aseksüel üremesi, arzu edilen agronomik ve farmasötik özellikler taşıyan bitkilerin ticari üretimine izin veren tek bir genotipin çoğalması için sadece tek bir bitki gerektirir. Aseksüel Esrar üremesinin yaygın bir şekli, kök oluşumunu teşvik etmek için bir nem kubbesi ile kaplı topraksız bir ^substrat11'e dişi bir bitkinin küçük kısımlarını kesmek ve eklemektir. Bu yöntemin başarılı olduğu kanıtlansa da, yaygın bir dezavantaj, kubbenin içinde yüksek düzeyde nem (genellikle% 80 veya daha yüksek) birikmesidir ve mantar patojenleri için yeni, hassas kesimlere zarar verebilen ideal bir büyüme ortamı sağlar. Aseksüel yayılmanın bir başka şekli, steril tekniklerin sınırlı alanda böcek, mikrop ve virüs içermeyen Esrar bitki materyalinin yayılmasına izin verdiği doku kültürü kullanılarak mikropropagasyondur12. Bununla birlikte, bu işlem pahalı, zaman alıcıdır ve genellikle büyük ölçekli Esrar tesisleri için erişilemeyen eğitimli laboratuvar teknisyenleri gerektirir.

Esrarın klonal yayılımı hakkında çok az yayınlanmış araştırma raporu bulunmaktadır. Araştırma amacıyla ve endüstriyel üretim için Esrarın aseksüel üremesinin anlaşılmasına zemin oluşturmak amacıyla, bu çalışma Esrarın klonal yayılımı için aeroponik sistemlerin kullanım kolaylığını ve erişilebilirliğini göstermeyi amaçlamıştır. Aeroponik sistemler, Esrarın aseksüel olarak yayılması, kesimlere sürekli olarak besin bakımından zengin su sağlanması, erken kök oluşumunun zamanında teşvik edilmesi ve gerekirse bir bitkinin süresiz olarak muhafaza edilmesine izin verilmesi için idealdir.

Protokol

1. Klonal yayılma için bir ana bitkinin üretimi

1. Kullanım amacına özgü arzu edilen morfolojik ve kimyasal özellikler gösteren sağlıklı, dişi bir anne bitkisi seçin.
2. Ana bitkinin klonal yayılma (yani kesimler) için uygun boyuta (kabaca 25 olgun sürgün) ulaşmasına izin verin.
3. Gelecekteki yayılma için sürgün büyümesini teşvik etmek için ana bitkilerin vejetatif büyüme aşamasında (ışık: karanlık = 18 saat: 6 saat) kalmasına izin verin.

2. Aeroponik sistemin inşası ve hazırlanması

1. Kapağı kabın üzerine (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm) yerleştirip başlayın. Her biri arasında yeterli alan (tercihen 3 cm) sağlarken istenen sayıda deliği kapağın içine delin.
2. Su pompasını (Malzeme Masası) kabın ortasına yerleştirin.
3. Pompa nozülün su hattından yaklaşık 2,5 cm yukarıda kalması için kabın içine 7-8 L damıtılmış su dökün.
   NOT: Bu, dalgıç su pompasının (Malzeme Masası) suyu kap kapağına yayılacak kadar kuvvetle itebilmesini sağlar. Damıtılmış su önerilir; bununla birlikte, düzenli musluk suyu da kullanılabilir.
4. Her yuvaya uygun miktarda Rockwool küpü (3,81 cm) (Malzeme Masası) veya medya küpleri yer alın. Pompayı açın ve 24 saat çalışmasına izin verin.
   NOT: Taşyünü küpleri, ekimden sonra bitkileri dik tutmaya yardımcı olan yeni köklü kesimlerde "ankraj" yetenekleri nedeniyle tercih edilir.

3. Uygun sürgünlerin seçilmesi ve çıkarılması

1. Sterilize edilmiş bir neşter veya makas kullanarak apikal meristemin yakınındaki sürgünleri toplayın. Kesimler ~ 10 cm uzunluğundadır, ideal olarak birkaç düğümle.
   NOT: Gövdeyi 45° açıyla kesin. 45° açıyla kesim, kesimin bazal kısmının yüzey alanını artırarak kök gelişimi için daha fazla alan sağlar. Yüzey alanını daha da artırmak için 45° kesimin ortasında küçük bir yarık (1-2 cm) yapmak isteğe bağlıdır.
2. İlk üç düğümde bulunan yapraklar hariç tüm yaprakları çıkarın.
3. Yeni eksilen kesimi, hint-3-bütirik asit (IBA) (Malzeme Tablası) içeren köklenme çözeltisine ~5 s için gövdenin tabanından ~2-5 cm yukarı daldırın.
4. Kesimi aeroponik sisteme yerleştirilmiş bir Rockwool küpünün ortasına yerleştirin.
   NOT: Kesme ekleme derinliği, Rockwool küpünün altından ~1-2 cm uzakta kalacaktır.
5. Köksüz kesimleri her 3 günde bir besin buğusu çözeltisi (Malzeme Masası) ile püskürtün.
6. Kesimleri günde 18-24 saat ışıkla, 24-29 °C'de 100 μmol/^m2/s fotonitetik foton akı yoğunluğu (PPFD) ve % 40-60 bağıl nem ile büyütün.

4. Aeroponik sistem bakımı ve propagule sağlığı

1. Sistemi her 2-5 günde bir 5,0- 6,0 arasında bir pH'da suyla doldurun.
2. Kesimleri (kesim başına bir sis) her 3 günde bir besin sisi çözeltisi (Malzeme Masası) ile hafifçe buğulayın.
3. Her besin çözeltisinin (Malzeme Tablosu) 5 mL'yi her 3-5 günde bir rezervuara ekleyin.
   NOT: Besin ilavesi suyun kahverengi ve bulanık olmasına neden olur.
4. Her 5 günde bir 10 L su başına hipokloröz asit (%0,028) içeren alg ve bakteri temizleme çözeltisinin 15 mL'sini ekleyin (Malzeme Tablosu).

5. Propagüllerin nakledilme

1. Uzun, beyaz, lifli kökleri olan kesimleri seçin.
   NOT: Kök çürüklüğü varlığı için bir gösterge olduğu ve genellikle yeni büyüyen ortama alışması daha uzun süreceği ve istenmeyen hastalıkları beraberinde getirebileceği için kahverengi, sümüklü ve kısa kök sistemleri ile kesimlerden kaçının.
2. Rockwool küpünü sistemden dikkatlice sökün ve kökleri çözün.
3. Esrar profillerini besleyici bir toprak karışımı (Malzeme Masası) ile dolu 4 L fidanlık kabına nakledin.
   NOT: Köklerin kurumasını önlemek için hemen sulama yapılması önerilir.

6. Aeroponik sistemin temizlenmesi ve depolanmasının

1. Sistem artık kullanılmadığında, suyla yıkayın ve% 70 etanol veya başka bir dezenfektanla temizleyin.
2. Filtreyi su pompasından çıkarın ve döküntüleri gidermek için suyla durulayın.
3. Sistemi kağıt havlu veya bezle silerek kurulayın.
4. Pompayı kapağı açık küvetin içine yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın.

Sonuçlar

Açıklanan aeroponik sistemin verimliliğini doğrulamak için, ana bitkilerden sırasıyla 'Cherry Wine' ve 'Red Robin' olmak üzere toplam 10 ve 12 sağlıklı 14 cm uzunluğunda sürgünler çıkarıldı (Şekil 1A,B). Köklendirme indüksiyon ortamına daldıktan sonra klonlar sisteme yerleştirildi (Şekil 2A). Bir aeroponik sistemin inşası ve çalışması Şekil 2A'da şematik bir diyagram olarak gösteril...

Tartışmalar

Tutarlı kannabinoid içeriğine sahip Esrar bitkilerine artan taleple birlikte, Esrar endüstrisinde çeşitli klonal yayılma yöntemleri istismar edilmiştir. Aseksüel yayılma, büyük ölçekli, tutarlı üretim için cinsel yöntemlere göre çeşitli avantajlar göstermektedir. Aeroponik yayılma sistemi, hızlı kök gelişimi sağlamak için havalandırılmış besin bakımından zengin bir su sisi kullanan bir hidroponik sistemin değiştirilmiş bir versiyonudur. Tanımlanan aeroponik sistem...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-part Fox Farm	Fox Farm		Soil Mix
1-part Promix	Promix		Soil Mix
1-part Roots Organic Original	Auora Innovations		Soil Mix
1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings	UNCO Industries		Soil Mix
Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez)	EZ Clone	SKU#: 225	8 fl. Oz.
Artificial Lighting	AgroBrite	SKU#: 1399	T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps
Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine)	Summit CBD	N/A	Donated material
Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine)	Trilogene	SKU: 0101RR
Corresponding Plastic Lid	Office Depot	N/A	38.1 cm x 25.4 cm
Drill Bit 1	Dewalt	DW1586	38.1 mm spade drill bit
Drill Bit 2	Dewalt	DW1308	3.175 mm drill bit
Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL	General Hydroponics	SKU#: 726	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%)
FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL	General Hydroponics	SKU#: 724	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%))
FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL	General Hydroponics	SKU#: 759	946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%))
Horticultural Scissors	Shear Perfection	SKU#: 12620	Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4")
Isopropyl Alcohol	Equate	Walmart # 574133562	70% concentration
Nutrient Mist Solution (Clonex Mist)	Growth Technology	SKU#: 4889	10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %)
pH Down	General Hydroponics	SKU#: 733	946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg)
pH Up	General Hydroponics	SKU#: 730	946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg)
Plastic Container	Office Depot	N/A	38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm
Power Drill	Dewalt	DCD709B	20-Volt Max ½” Drill
Rockwool Cubes	Grodan	SKU#: 830	38.1 mm
Rooting Solution (Clonex Rooting Gel)	Growth Technology	SKU#: 939	3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%)
Statistic Software (Prism)	GraphPad Inc.
Submersible Water Pump	ActiveAQUA	SKU: AAPW250	Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W