定量微管分离技术分离小鼠组织中稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白

摘要

微管是微管蛋白聚合物，在真核细胞中作为细胞骨架成分起着至关重要的作用，并以其动态不稳定性而闻名。本研究开发了一种将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白的方法，以评估微管在各种小鼠组织中的稳定性。

摘要

微管由α/β-微管蛋白二聚体组成，是真核细胞细胞骨架的重要组成部分。这些管状聚合物表现出动态不稳定性，因为微管蛋白异二聚体亚基会经历重复聚合和解聚。通过微管蛋白翻译后修饰和微管相关蛋白实现微管稳定性和动力学的精确控制，对于各种细胞功能至关重要。微管功能障碍与发病机制密切相关，包括神经退行性疾病。正在进行的研究集中在调节稳定性的微管靶向治疗剂上，为这些疾病和癌症提供了潜在的治疗选择。因此，了解微管的动态状态对于评估疾病进展和治疗效果至关重要。

传统上，微管动力学是通过粗分离或免疫测定在 体外 或培养细胞中评估的，使用靶向微管蛋白翻译后修饰的抗体。然而，使用此类程序准确分析组织中的微管蛋白状态存在挑战。在这项研究中，我们开发了一种简单而创新的微管分离方法，用于分离小鼠组织中的稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白。

该过程涉及以19:1的体积比在微管稳定缓冲液中匀浆解剖的小鼠组织。然后，在初始慢速离心（2,400 × g）之后，通过两步超速离心过程对匀浆进行分馏以除去碎屑。第一个超速离心步骤（100,000 × g）沉淀出稳定的微管，而所得上清液则进行第二个超速离心步骤（500,000 × g）以分馏不稳定的微管和可溶性微管蛋白二聚体。该方法测定了微管蛋白在小鼠大脑中构成稳定或不稳定微管的比例。此外，观察到微管稳定性的明显组织变化与组成细胞的增殖能力相关。这些发现突出了这种新方法在分析生理和病理条件下微管稳定性方面的巨大潜力。

引言

微管 （MTs） 是细长的管状结构，由α/β-微管蛋白异二聚体亚基组成的原丝组成。它们在细胞分裂、运动、形状维持和细胞内运输等各种细胞过程中发挥着重要作用，使其成为真核细胞骨架¹ 的组成部分。暴露α-微管蛋白亚基的 MT 负端相对稳定，而暴露β-微管蛋白亚基的正端经历动态解聚和聚合²。这种微管蛋白二聚体在正端加成和解离的连续循环，称为动态不稳定性，导致重复的救援和灾难过程³.MT 表现出具有动态不稳定性局部变化的焦点域，包括稳定域和不稳定域⁴。

精确控制MT的动态不稳定性对于许多细胞功能至关重要，特别是在以复杂形态为特征的神经元中。MT 的适应性和耐久性在神经细胞的发育和正常功能中起着至关重要的作用 ^5,6,7。已发现 MT 的动态不稳定性与微管蛋白的各种翻译后修饰 （PTM） 有关，例如乙酰化、磷酸化、棕榈酰化、去酪氨酸化、δ 2、聚谷氨酰胺氧化和聚甘氨酰化。此外，微管相关蛋白 （MAP） 的结合是一种调节机制⁸。PTM（不包括乙酰化）主要发生在位于 MT 外表面的微管蛋白羧基末端区域。这些修饰在 MT 上创造了不同的表面条件，影响了它们与 MAP 的相互作用，并最终控制了 MT 的稳定性⁹。α-微管蛋白中羧基末端酪氨酸残基的存在表明存在动态 MT，其迅速被游离微管蛋白池取代。相反，羧基末端的去酪氨酸化和 Lys40 的乙酰化表明稳定的 MT 具有降低的动态不稳定性 ^9,10。

微管蛋白的PTM已被广泛用于评估MTs^的动力学和稳定性的实验5,7,11,12,13,14,15。例如，在细胞培养研究中，微管蛋白可以分为两个池:游离微管蛋白池和MT池。这是通过在固定剩余的 MT^15、16、17、^18、19 之前通过细胞通透性释放游离微管蛋白来实现的。生化方法涉及使用化学 MT 稳定剂来保护 MT 免受灾难，从而通过离心分离 MT 和游离微管蛋白^20,21,22。然而，这些程序无法区分稳定和不太稳定（不稳定）的 MT，因此无法量化 MT 或大脑等组织中的可溶性微管蛋白。因此，在生理和病理条件下评估生物体的MT稳定性已被证明具有挑战性。为了解决这一实验局限性，我们开发了一种新技术，用于精确分离小鼠组织中的 MT 和游离微管蛋白²³。

这种独特的 MT 分离方法涉及在维持组织中微管蛋白状态的条件下进行组织匀浆，以及两步离心以分离稳定的 MT、不稳定的 MT 和游离微管蛋白。这种简单的程序可以应用于广泛的研究，包括生物体中 MT 和 MAP 的基础研究、与 MT 稳定性相关的健康和疾病的生理和病理分析，以及开发靶向 MT 的药物和其他疗法。

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研究方案

1.MT分馏法

注:本研究中进行的所有实验均已获得同志社大学动物伦理委员会的批准。这里使用3-4个月大的C57BL / 6J小鼠。在该方案中，解剖的组织，例如脑，肝脏或胸腺，立即在冰冷的微管稳定缓冲液（MSB）中匀浆，其含有紫杉醇（MT稳定剂）的浓度，其浓度不仅阻止了解聚，而且阻止了MT的再聚合。通过两步超速离心过程将匀浆分离成三部分（图1）。该方案中的所有步骤均在低温环境中不间断地完成，并且组织和级分在溶解在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中之前不会冷冻。

1. MSB和微管的制备
   1. 要制备MSB，请混合以下试剂:0.1M 2-（N-吗啉基）乙磺酸（MES），pH 6.8（通过KOH中和），10%甘油，0.1mM DTT，1mM MgSO 4,1mM EGTA，0.5%Triton X-100，磷酸酶抑制剂（1mM NaF，1mM β-甘油磷酸，1mM Na₃VO_4,0.5μM冈田酸），1x蛋白酶抑制剂混合物， 和蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSF、0.1 mM DIFP、1 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂、1 μg/mL 止痛药、10 μg/mL 抑肽酶、10 μg/mL 亮肽酶、50 μg/mL TLCK）（参见材料表），表示为 MSB（-）。
   2. 在组织解剖之前，向MSB（-）中加入10μM紫杉醇和2mM GTP（参见 材料表）。此缓冲区表示为 MSB（+）。在使用当天准备缓冲液并将其放在冰上。
   3. 准备微管进行取样。空的 2.0 mL 微管用于匀浆储存;空的 1.5 mL 微管，用于储存上清液 1 （S1） 裂解物、沉淀物 2 （P2） 样品和沉淀物 3 （P3） 样品;1.5 mL 微管和 1 mL 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS），用于解剖组织储存;1.5 mL 微管，含有 200 μL 2x SDS 样品缓冲液（0.16 M Tris pH 6.8;20% 甘油;2% 2-巯基乙醇;4% SDS），用于 S1 样品和上清液 3 （S3） 样品储存;以及用于 TLA55 和 TLA120.2 离心机转子的离心微管（参见 材料表）。标记所有试管并将它们放在冰上。
2. 小鼠组织匀浆
   1. 准备一个冷藏的床进行组织解剖。首先，用碎冰装满一个盒子，然后将两个培养皿放在冰上，一个内侧朝上，另一个外侧朝上。将冰冷的PBS装入一个培养皿中，用于解剖组织的瞬时洗涤和储存。将用PBS润湿的滤纸放在另一个翻过来的盘子上。
   2. 为了牺牲小鼠，在深度麻醉下使用布托啡诺，咪达唑仑和美托咪定的混合麻醉剂进行颈椎脱位。然后，立即解剖组织，例如脑、肝脏或胸腺，并在培养皿中用冰冷的 PBS 清洗它们。
      注意:任何类型的软组织都可以通过这种方法进行分析。然而，组织的大小受到所用均质器的推荐体积范围的限制。例如，如果使用 2 mL 体积的匀浆器，则建议使用 50-100 mg 的组织。
   3. 称量装有PBS的1.5mL微管用于解剖组织储存后，切出组织并将其储存在微管内，并重新称量每个微管。每个组织的湿重可以通过减去添加组织前后的管重量来计算。
   4. 立即用冷冻均质器在冰冷的MSB（+）中匀浆组织（参见 材料表）。MSB（+）的体积是组织湿重（mg）的19倍（μL）。以 20 次冲程进行均质化，直到组织碎片消失。
      注:例如，1,900 μL MSB（+） 用于 100 mg 组织。由于必须根据所分析的组织块的每个湿重调整要添加的MSB（+）的体积，因此有必要准确称量每个组织块。
3. 小鼠组织匀浆的离心
   1. 用巴斯德移液管将整个匀浆移至2mL微管中，并在2°C下以2,400× g 离心3分钟， 以通过 沉淀除去碎片。
   2. 将整个上清液（S1 级分）转移到新的 1.5 mL 微管中并涡旋。然后，将200μL的S1级分分装到离心微管中，并使用TLA-55转头在2°C下以100,000× g 离心20分钟，以获得相对较大的分子量蛋白质作为沉淀物（P2级分）。
      注:经过超速离心步骤的样品体积会影响离心半径和分子的沉淀效率。在此步骤后，将样品体积保持在 200 μL 或更低，以防止分离不准确。
   3. 进一步使用TLA-120.2转子在2°C下以500,000× g 离心所有所得的上清液（S2级分）60分钟，以将沉淀物（P3级分）中的不溶性蛋白质复合物与上清液（S3级分）中的可溶性蛋白质分离。
   4. 向P2和P3馏分管中加入400μL的1x SDS样品缓冲液（0.08M Tris pH 6.8;10%甘油;1%2-巯基乙醇;2%SDS），并短暂超声处理以溶解沉淀物。将这些馏分样品转移到空的 1.5 mL 微管中。
   5. 将总 S3 级分溶解在 200 μL 的 2x SDS 样品缓冲液中。
   6. 将剩余的 S1 级分与等体积的 2x SDS 样品缓冲液混合，用作蛋白质印迹的标准曲线。
   7. 将所有这些样品在100°C下煮沸3分钟。样品冷却至室温后，将样品储存在-20°C。
4. 每个组分中蛋白质的定量
   1. 通过蛋白质印迹法定量 P2、P3 和 S3 组分中的蛋白质。首先，使用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 将蛋白质从适当稀释的 P2、P3 和 S3 馏分中分离出来，并将连续稀释的 S1 样品作为标准曲线从任何个体中分离出来。然后，将样品电印迹到聚偏二氟乙烯膜上（参见 材料表）。
      注:每个馏分的稀释率取决于客观蛋白的浓度和抗体的反应性。（例如，脑组织中的α-微管蛋白、TUBB3、β-tub 和酪氨酸化微管蛋白:S3 = 1/400，P3 = 1/2,000，P2 = 1/2,000，S1 = 1/50,000,1/20,000,1/10,000,1/5,000,1/2,000; 脑组织中乙酰化微管蛋白: S3 = 1/200， P3 = 1/400， P2 = 1/8,000， S1 = 1/100,000， 1/40,000， 1/20,000， 1/10,000， 1/4,000; 肝脏中的α-微管蛋白: S3 = 1/20， P3 = 1/100， P2 = 1/20， S1 = 1/50,000， 1/20,000， 1/10,000， 1/5,000， 1/2,000; 胸腺中的α-微管蛋白: S3 = 1/100，P3 = 1/400，P2 = 1/20，S1 = 1/50,000,1/20,000,1/10,000,1/5,000,1/2,000 稀释度）。
   2. 用5%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水（50mM Tris-HCl pH 7.6;152mM NaCl）和0.1%吐温20（TBS-T）中封闭膜超过30分钟。
   3. 将膜浸入含有一抗的TBS-T中（参见 材料表）2小时以上。之后，用TBS-T洗涤膜3分钟（3次）。
   4. 在TBS-T中使用HRP偶联的二抗（参见 材料表）标记一抗超过1小时。之后，用TBS-T洗涤膜3分钟（3次）。
   5. 用增强型化学发光试剂显影膜。然后，使用发光图像分析仪分析感兴趣的条带（参见 材料表）。
   6. 使用图像分析软件（参见 材料表）量化蛋白质条带强度，并通过绘制稀释的S1样品的稀释单位来创建标准曲线，用于沿X轴的标准曲线和沿Y轴的条带强度。
   7. 读取与稀释馏分样品相对应的蛋白质浓度（单位）。将读数的浓度乘以样品稀释因子，以获得每个馏分中的蛋白质单位。将每个部分的测量单位除以总蛋白质单位（P2 + P3 + S3）以获得百分比。

2. 评估微管蛋白在各馏分中的性质

注:该生化方法提供了由沉降特性定义的三组微管蛋白复合物。在这里，根据复合物和微管蛋白-PTM的大小来确定在这些馏分中获得的微管蛋白复合物的状态。在低温环境中不间断地完成本协议中的所有步骤，但在馏分样品溶解在SDS样品缓冲液中之前不要冷冻。

1. 滤器捕集测定
   1. 使用300 kDa超滤离心柱过滤S2和S3级分（各500μL）（参见 材料表）。在2°C下进行14,000× g 离心，直到过滤整个上清液，将洗脱的蛋白质收集到接收管中，并且捕获的蛋白质保留在储液管的过滤器上。
   2. 将接收管中的整个滤液（约500μL）翻译成新的1.5mL微管，并将其溶解在500μL的2x SDS样品缓冲液中。
   3. 通过将样品移液并转移到新的1.5mL微管中，将储液管过滤器上的残留物溶解在1,000μL的1x SDS样品缓冲液中。
   4. 将样品在100°C下煮沸3分钟。样品冷却至室温后，将样品储存在-20°C。
   5. 通过用DM1A（抗α-微管蛋白抗体，参见 材料表）进行蛋白质印迹分析微管蛋白的量。
2. 体积排阻色谱法
   1. 如步骤1.1.1所述，制备补充有1/10浓度的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的载体缓冲液（0.1M MES，pH 6.8;10%甘油;1mM MgSO₄;1mM EGTA;0.1mM DTT）。然后，过滤溶液并将其储存在寒冷的环境中。
   2. 在4°C的色谱室（见 材料表）中制备配备有制备液相色谱系统的凝胶过滤色谱柱。
   3. 在将样品注入色谱柱之前，流入 180 mL 载体缓冲液以洗涤色谱柱。流速为1mL / min，持续3小时。
   4. 将市售的纯化猪微管蛋白（参见 材料表）作为对照或来自小鼠脑的S3级分（每个500μL）注射到色谱柱上。
   5. 用载体缓冲液以 1.0 mL/min 的流速洗脱。收集 1.5 mL 馏分 120 分钟。通过在280nm处的吸光度监测洗脱的蛋白质。将最大压力保持在 0.3 MPa 以下。
   6. 涡旋收集的馏分后，在1.5mL微管中将其50μL与50μL的2x SDS样品缓冲液混合。将所有样品在100°C下煮沸3分钟。样品冷却至室温后，将样品储存在-20°C。
   7. 用DM1A，抗α-微管蛋白抗体和KMX-1，抗β-微管蛋白抗体通过蛋白质印迹分析微管蛋白的量（参见 材料表）。

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结果

通过MT分馏法定量小鼠脑中P2，P3和S3组分中的微管蛋白
通过MT分馏方法将小鼠组织中的微管蛋白分离为P2，P3和S3级分，并通过蛋白质印迹进行定量（图1A）。在小鼠脑中以100,000 × g 超速离心20 min，残留在P2组分中的MTs沉淀物占总微管蛋白的34.86%±1.68%。将上清液（S2）进一步以500,000 × g 离心60分钟。获得沉淀物（P3级分）和上清液（S3级分），分别占...

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讨论

在研究微管蛋白在活生物体组织中的状态时，最重要的任务是防止制备过程中意外的MT聚合或解聚。从组织去除到匀浆和离心过程中，MTS在样品中的稳定性受MSB中紫杉醇浓度、组织与缓冲液的比例、温度等因素的影响。因此，在用20倍体积的匀浆分析小鼠组织的方案的每个步骤中优化条件。较高浓度的紫杉醇可以在 体外诱导MT聚合，即使在冷却条件下也是如此²⁵。当分析微?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus	Cytiva	11001313
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1	AS ONE	1-2050-11
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP	Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman	TOMY	KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)	Roche	11873580001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol	LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422