Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği

Özet

Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.

Özet

α/β-tübülin dimerlerinden oluşan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde hücre iskeletinin çok önemli bir bileşenidir. Bu tüp benzeri polimerler, tübülin heterodimer alt birimleri tekrarlayan polimerizasyon ve depolimerizasyona uğradıkça dinamik kararsızlık sergiler. Tübülin translasyon sonrası modifikasyonlar ve mikrotübül ile ilişkili proteinler yoluyla elde edilen mikrotübül stabilitesinin ve dinamiğinin hassas kontrolü, çeşitli hücresel fonksiyonlar için gereklidir. Mikrotübüllerdeki işlev bozuklukları, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere patogenezde güçlü bir şekilde rol oynar. Devam eden araştırmalar, stabiliteyi modüle eden ve bu hastalıklar ve kanserler için potansiyel tedavi seçenekleri sunan mikrotübül hedefli terapötik ajanlara odaklanmaktadır. Sonuç olarak, mikrotübüllerin dinamik durumunu anlamak, hastalığın ilerlemesini ve terapötik etkilerini değerlendirmek için çok önemlidir.

Geleneksel olarak, mikrotübül dinamikleri, tübülin sonrası translasyon modifikasyonlarını hedefleyen antikorlar kullanılarak, kaba fraksiyonlama veya immünoassay yoluyla in vitro veya kültürlenmiş hücrelerde değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu tür prosedürleri kullanarak dokulardaki tübülin durumunu doğru bir şekilde analiz etmek zorluklar doğurur. Bu çalışmada, fare dokularında stabil mikrotübülleri, kararsız mikrotübülleri ve serbest tübülleri ayırmak için basit ve yenilikçi bir mikrotübül fraksiyonlama yöntemi geliştirdik.

Prosedür, disseke edilmiş fare dokularının 19:1 hacim oranında bir mikrotübül stabilize edici tampon içinde homojenleştirilmesini içeriyordu. Homojenatlar daha sonra, kalıntıları gidermek için ilk yavaş santrifüjlemeyi (2.400 × g) takiben iki aşamalı bir ultrasantrifüj işlemi ile fraksiyonlandı. İlk ultrasantrifüjleme aşaması (100.000 × g) kararlı mikrotübülleri çökeltirken, elde edilen süpernatant, kararsız mikrotübülleri ve çözünür tübülin dimerlerini fraksiyonlamak için ikinci bir ultrasantrifüj adımına (500.000 × g) tabi tutuldu. Bu yöntem, fare beyninde stabil veya kararsız mikrotübüller oluşturan tübülin oranlarını belirledi. Ek olarak, kurucu hücrelerin proliferatif kapasitesi ile ilişkili olan mikrotübül stabilitesinde farklı doku varyasyonları gözlenmiştir. Bu bulgular, fizyolojik ve patolojik koşullarda mikrotübül stabilitesini analiz etmek için bu yeni yöntemin önemli potansiyelini vurgulamaktadır.

Giriş

Mikrotübüller (MT'ler), α/β-tübülin heterodimer alt birimlerinden oluşan protofilamentlerden oluşan uzun tübüler yapılardır. Hücre bölünmesi, hareketlilik, şekil bakımı ve hücre içi taşıma gibi çeşitli hücresel süreçlerde önemli roller oynarlar ve bu da onları ökaryotik hücre iskeletinin ayrılmaz bileşenleri haline getirir¹. α-tubulin alt biriminin açığa çıktığı MT'lerin eksi ucu nispeten kararlıyken, β-tübülin alt biriminin açığa çıktığı artı uç, dinamik depolimerizasyon ve polimerizasyona^{uğrar 2}. Dinamik kararsızlık olarak adlandırılan artı uçta bu sürekli tübülin dimer ilavesi ve ayrışma döngüsü, tekrarlayan bir kurtarma ve felaket süreciyle sonuçlanır³. MT'ler, kararlı ve kararsız alanlar dahil olmak üzere dinamik istikrarsızlıkta lokalize varyasyonlara sahip odak alanları sergiler⁴.

MT'lerin dinamik kararsızlığının hassas kontrolü, özellikle karmaşık morfolojilerle karakterize edilen nöronlarda, çok sayıda hücresel fonksiyon için çok önemlidir. MT'lerin uyarlanabilirliği ve dayanıklılığı, sinir hücrelerinin gelişiminde ve düzgün çalışmasında hayati bir rol oynar ^5,6,7. MT'lerin dinamik kararsızlığının, asetilasyon, fosforilasyon, palmitoilasyon, detirozinasyon, delta 2, poliglutamin oksidasyonu ve poliglisilasyon gibi tübülinin çeşitli translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Ek olarak, mikrotübül ile ilişkili proteinlerin (MAP'ler) bağlanması, düzenleyici bir mekanizma olarak hizmet eder⁸. Asetilasyon hariç PTM'ler, ağırlıklı olarak MT'lerin dış yüzeyinde yer alan tübülin karboksi-terminal bölgesinde meydana gelir. Bu modifikasyonlar, MT'ler üzerinde çeşitli yüzey koşulları yaratarak MAP'lerle etkileşimlerini etkiler ve nihayetinde MT kararlılığını yönetir⁹. α-tübülin içinde bir karboksi-terminal tirozin kalıntısının varlığı, hızlı bir şekilde serbest tübülin havuzu ile değiştirilen dinamik MT'lerin göstergesidir. Tersine, karboksi terminalinin detirozinasyonu ve Lys40'ın asetilasyonu, azaltılmış dinamik kararsızlığa sahip kararlı MT'leri ifade eder ^9,10.

Tübülin PTM'leri,^MT'lerin 5,7,11,12,13,14,15'in dinamiklerini ve kararlılığını değerlendirmek için deneylerde yaygın olarak kullanılmıştır. Örneğin, hücre kültürü çalışmalarında, tübülinler iki havuza ayrılabilir: serbest tübülin havuzu ve MT havuzu. Bu, kalan MT'leri ^{15,16,17,18,19} sabitlemeden önce hücre geçirgenliği yoluyla serbest tübülin salınarak elde edilir. Biyokimyasal yöntemler, MT'leri felaketten koruyan, MT'lerin ve serbest tübülinin santrifüjleme yoluyla ayrılmasını sağlayan kimyasal MT stabilizatörlerinin kullanımını içerir^20,21,22. Bununla birlikte, bu prosedürler stabil ve daha az stabil (kararsız) MT'ler arasında ayrım yapmaz, bu nedenle beyin gibi dokularda MT'leri veya çözünür tübülini ölçmeyi imkansız hale getirir. Sonuç olarak, fizyolojik ve patolojik koşullar altında organizmalarda MT stabilitesini değerlendirmenin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu deneysel sınırlamayı ele almak için, fare dokusunda MT'leri ve serbest tübülini hassas bir şekilde ayırmak için yeni bir teknik geliştirdik²³.

Bu benzersiz MT fraksiyonlama yöntemi, dokularda tübülin durumunu koruyan koşullar altında doku homojenizasyonunu ve kararlı MT'leri, kararsız MT'leri ve serbest tübülini ayırmak için iki aşamalı santrifüjlemeyi içerir. Bu basit prosedür, canlı organizmalarda MT'ler ve MAP'ler üzerine temel araştırmalar, MT stabilitesi ile ilişkili sağlık ve hastalıkların fizyolojik ve patolojik analizleri ve MT'leri hedef alan ilaçlar ve diğer terapötiklerin geliştirilmesi dahil olmak üzere geniş çalışmalara uygulanabilir.

Protokol

1. MT fraksiyonlama yöntemi

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm deneyler Doshisha Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Burada her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, 3-4 aylık, kullanıldı. Bu protokolde, diseke edilen dokular, örneğin beyin, karaciğer veya timüs, sadece depolimerizasyonu değil, aynı zamanda MT'nin repolimerizasyonunu da önleyen bir konsantrasyonda Taxol (MT stabilizatörü) içeren buz gibi soğuk mikrotübül stabilize edici tampon (MSB) içinde hemen homojenize edildi. Homojenat, iki aşamalı bir ultrasantrifüj işlemi ile üç fraksiyona ayrıldı (Şekil 1). Bu protokoldeki tüm adımlar, soğuk sıcaklıktaki bir ortamda kesintisiz olarak tamamlandı ve dokular ve fraksiyonlar, sodyum dodesil sülfat (SDS) numune tamponunda çözülene kadar dondurulmadı.

1. MSB ve mikrotüplerin hazırlanması
   1. MSB'yi hazırlamak için aşağıdaki reaktifleri karıştırın: 0.1 M 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.8 (KOH ile nötralize edilmiş),% 10 gliserol, 0.1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA,% 0.5 Triton X-100, fosfataz inhibitörleri (1 mM NaF, 1 mM β-gliserofosfat, 1 mM Na₃VO ₄, 0.5 μM okadaik asit), 1x proteaz inhibitör kokteyli, ve proteaz inhibitörleri (0.1 mM PMSF, 0.1 mM DIFP, 1 μg/mL pepstatin, 1 μg/mL antipain, 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin, 50 μg/mL TLCK) (bkz.
   2. Doku diseksiyonundan hemen önce, MSB'ye (-) 10 μM Taxol ve 2 mM GTP (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Bu arabellek MSB(+) olarak gösterilir. Tamponu kullanım günü hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
   3. Mikrotüpleri örnekleme için hazırlayın. Homojenat depolama için boş 2.0 mL mikrotüp; süpernatant1 (S1) lizat, çökelti2 (P2) numunesi ve çökelti3 (P3) numune saklama için boş 1,5 mL mikrotüp; Diseke doku depolaması için 1 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1.5 mL mikrotüp; S1 numunesi ve süpernatant3 (S3) numune saklama için 200 μL 2x SDS numune tamponu (0.16 M Tris pH 6.8; %20 gliserol; %2 2-merkaptoetanol; %4 SDS) içeren 1,5 mL mikrotüp; ve TLA55 ve TLA120.2 santrifüj rotorları için santrifüj mikrotüpü (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüm tüpleri etiketleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
2. Fare dokusu homojenizasyonu
   1. Doku diseksiyonu için soğutulmuş bir masa hazırlayın. İlk olarak, bir kutuyu kırılmış buzla doldurun ve biri iç tarafı yukarı, diğeri dış tarafı yukarı bakacak şekilde iki Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Kesilen dokuların geçici olarak yıkanması ve saklanması için buz gibi soğuk PBS'yi bir kaba doldurun. PBS ile nemlendirilmiş filtre kağıdını ters çevrilmiş başka bir tabağa koyun.
   2. Bir fareyi feda etmek için, derin anestezi altında butorphanol, midazolam ve medetomidin karışık anestezikleri ile servikal çıkık yapın. Ardından, beyin, karaciğer veya timus gibi dokuları hemen inceleyin ve bir Petri kabında buz gibi PBS ile yıkayın.
      NOT: Bu yöntemle her türlü yumuşak doku analiz edilebilir. Bununla birlikte, dokunun boyutu, kullanılan homojenizatörün önerilen hacim aralığı ile sınırlıdır. Örneğin, 2 mL hacimde homojenizatör kullanılıyorsa, 50-100 mg doku önerilir.
   3. Diseke doku depolaması için PBS ile doldurulmuş 1.5 mL mikrotüpleri tarttıktan sonra, dokuları kesin ve mikrotüplerin içinde saklayın ve her bir mikrotüpü yeniden tartın. Her dokunun yaş ağırlığı, doku eklenmeden önce ve sonra tüpün ağırlığı çıkarılarak hesaplanabilir.
   4. Dokuyu buz gibi soğuk MSB(+) içinde soğutulmuş bir homojenizatör ile hemen homojenize edin (bkz. Malzeme Tablosu). MSB (+) volümü doku yaş ağırlığının (mg) 19 katı (μL) idi. Doku parçaları kaybolana kadar 20 vuruşla homojenizasyon yapın.
      NOT: Örneğin, 100 mg doku için 1.900 μL MSB (+) kullanılır. Analiz edilen doku parçalarının her bir yaş ağırlığı için eklenecek MSB(+) hacminin ayarlanması gerektiğinden, her doku parçasının doğru tartılması gerekir.
3. Fare dokusu homojenatlarının santrifüjlenmesi
   1. Tüm homojenatı bir Pasteur pipeti ile 2 mL'lik bir mikrotüpe taşıyın ve kalıntıları çökeltme yoluyla temizlemek için 2,400 × g'da 2 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
   2. Tüm süpernatanı (S1 fraksiyonu) yeni bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın ve girdap yapın. Daha sonra, 200 μL S1 fraksiyonunu bir santrifüj mikrotüpüne ayırın ve nispeten büyük moleküler ağırlıklı proteinleri bir çökelti olarak elde etmek için 2 ° C'de 20 dakika boyunca bir TLA-55 rotoru kullanarak 100.000 × g'da santrifüjleyin (P2 fraksiyonu).
      NOT: Ultrasantrifüj adımlarına tabi tutulan numunenin hacmi, santrifüjleme yarıçapını ve moleküllerin çökeltme verimliliğini etkiler. Yanlış fraksiyonlamayı önlemek için bu adımdan sonra numune hacmini 200 μL veya daha düşük tutun.
   3. Ayrıca, çökeltideki çözünmeyen protein komplekslerini (P3 fraksiyonu) süpernatanttaki (S3 fraksiyonu) çözünür proteinlerden (S3 fraksiyonu) ayırmak için 2 ° C'de 60 dakika boyunca bir TLA-120.2 rotor kullanarak 500.000 × g'da elde edilen tüm süpernatantları (S2 fraksiyonu) santrifüjleyin.
   4. P2 ve P3 fraksiyon tüplerine 400 μL 1x SDS-numune tamponu (0.08 M Tris pH 6.8;% 10 gliserol;% 1 2-merkaptoetanol;% 2 SDS) ekleyin ve çökeltiyi çözmek için kısaca sonikleştirin. Bu fraksiyon örneklerini boş bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın.
   5. Toplam S3 fraksiyonunu 200 μL'lik 2x SDS numune tamponunda çözün.
   6. Kalan S1 fraksiyonlarını, Western blotlama için standart bir eğri olarak kullanmak üzere eşit hacimde 2x SDS numune tamponu ile karıştırın.
   7. Tüm bu numuneleri 100 °C'de 3 dakika kaynatın. Numuneler oda sıcaklığına soğuduktan sonra numuneleri -20 °C'de saklayın.
4. Her fraksiyondaki proteinlerin miktar tayini
   1. P2, P3 ve S3 fraksiyonlarındaki proteinleri Western blotlama ile ölçün. İlk olarak, proteinleri uygun şekilde seyreltilmiş P2, P3 ve S3 fraksiyonlarından ve seri olarak seyreltilmiş S1 örneğini standart bir eğri olarak herhangi bir bireyden ayırmak için %10 SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanın. Ardından, numuneleri poliviniliden florür membranları üzerine elektroblot yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Her fraksiyonun seyreltme oranı, objektif bir proteinin konsantrasyonuna ve antikorun reaktivitesine bağlıdır. (örneğin, beyin dokusunda α-tübülin, TUBB3, β-küvet ve tirozinli tübülin: S3 = 1/400, P3 = 1/2,000, P2 = 1/2,000, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; Beyin dokusunda asetillenmiş tübülin: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; Karaciğerde α-tubulin: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; Timusta α-tubulin: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 doku konsantrasyonu seyreltmesi).
   2. Membranı, 30 dakikadan fazla bir süre boyunca% 0.1 Tween 20 (TBS-T) ile Tris-tamponlu salin (50 mM Tris-HCl pH 7.6; 152 mM NaCl) içinde% 5 yağsız sütle bloke edin.
   3. Membranı 2 saatten fazla bir süre boyunca birincil antikor içeren TBS-T'ye daldırın (Malzeme Tablosuna bakınız). Bundan sonra, membranı TBS-T ile 3 dakika (3 kez) yıkayın.
   4. HRP ile konjuge sekonder antikorları kullanarak primer antikoru etiketleyin (bkz. Malzeme Tablosu) TBS-T'de 1 saatten fazla süredir. Bundan sonra, membranı TBS-T ile 3 dakika (3 kez) yıkayın.
   5. Membranları Gelişmiş Kemilüminesans reaktifi ile geliştirin. Ardından, ilgilenilen bantları ışıldayan bir görüntü analizörü ile analiz edin (bkz.
   6. Görüntü analiz yazılımını kullanarak protein bant yoğunluklarını ölçün (Malzeme Tablosuna bakın) ve X ekseni boyunca standart eğri için kullanılan seyreltilmiş S1 numunelerinin seyreltme birimlerini ve Y ekseni boyunca bant yoğunluklarını çizerek standart bir eğri oluşturun.
   7. Seyreltilmiş fraksiyon örneklerine karşılık gelen protein konsantrasyonunu (birim) okuyun. Her fraksiyonda bir protein birimi elde etmek için okunan konsantrasyonu numune seyreltme faktörü ile çarpın. Bir yüzde elde etmek için her fraksiyonun ölçülen birimini toplam protein birimine (P2 + P3 + S3) bölün.

2. Her fraksiyondaki tübülin özelliklerinin değerlendirilmesi

NOT: Bu biyokimyasal yöntem, sedimantasyon özellikleri ile tanımlanan üç grup tübülin kompleksi sağlar. Burada, bu fraksiyonlarda elde edilen tübülin komplekslerinin durumu, kompleksin ve tübülin-PTM'lerin büyüklüğüne göre tanımlandı. Bu protokoldeki tüm adımları soğuk bir ortamda kesintisiz olarak tamamlayın, ancak fraksiyon numunelerini SDS numune tamponunda çözünene kadar dondurmayın.

1. Filtre tuzağı tahlili
   1. S2 ve S3 fraksiyonlarını (her biri 500 μL) 300 kDa'lık bir ultrafiltrasyon spin kolonu kullanarak filtreleyin (bkz. Tüm süpernatan filtrelenene, ayrıştırılan proteinler alıcı tüplerde toplanana ve sıkışan proteinler rezervuar tüplerinin filtresinde kalana kadar 2 ° C'de 14.000 × g santrifüjleme gerçekleştirin.
   2. Alıcı tüplerdeki tüm filtratları (yaklaşık 500 μL) yeni 1.5 mL mikrotüplere çevirin ve bunları 500 μL 2x SDS numune tamponunda çözün.
   3. Rezervuar tüplerinin filtresindeki kalıntıları, numuneleri pipetleyerek ve yeni bir 1,5 mL mikrotüpe aktararak 1.000 μL 1x SDS numune tamponunda çözündürün.
   4. Numuneleri 100 °C'de 3 dakika kaynatın. Numuneler oda sıcaklığına soğuduktan sonra numuneleri -20 °C'de saklayın.
   5. DM1A (anti-α-tübülin antikoru, bkz.
2. Boyut dışlama kromatografisi
   1. Adım 1.1.1'de açıklandığı gibi 1/10 konsantrasyonda proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş taşıyıcı tamponu (0.1 M MES, pH 6.8; %10 gliserol; 1 mM MgS04; 1 mM EGTA; 0.1 mM DTT) hazırlayın. Ardından, çözeltiyi filtreleyin ve soğuk bir ortamda saklayın.
   2. 4 °C'de bir kromatografi odasında (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayıcı bir sıvı kromatografi sistemi ile donatılmış bir jel filtrasyon kromatografi kolonu hazırlayın.
   3. Numuneleri kolona enjekte etmeden önce, kolonu yıkamak için taşıyıcı tamponun 180 mL'sini akıtın. Akış hızı 3 saat boyunca 1 mL/dk'dır.
   4. Ticari olarak temin edilebilen saflaştırılmış domuz tübülini ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir kontrol olarak veya fare beyinlerinden (her biri 500 μL) S3 fraksiyonunu kolona enjekte edin.
   5. Taşıyıcı tampon ile 1.0 mL/dk akış hızında elute. 1.5 mL'lik fraksiyonları 120 dakika boyunca toplayın. 280 nm'de absorbans ile ayrıştırılmış proteinleri izleyin. Maksimum basıncı 0,3 MPa'nın altında tutun.
   6. Toplanan fraksiyonları vorteksledikten sonra, 50 μL'yi 1.5 mL'lik bir mikrotüp içinde 50 μL 2x SDS numune tamponu ile karıştırın. Tüm numuneleri 100 °C'de 3 dakika kaynatın. Numuneler oda sıcaklığına soğuduktan sonra numuneleri -20 °C'de saklayın.
   7. DM1A, anti-α-tubulin antikoru ve KMX-1, anti-β-tubulin antikoru ile Western blotlama ile tübülin miktarlarını analiz edin (bkz.

Sonuçlar

Fare beyninden P2, P3 ve S3 fraksiyonlarındaki tübülinin MT fraksiyonlama yöntemi ile miktar tayini
Fare dokusundaki tübülin, MT fraksiyonlama yöntemi ile P2, P3 ve S3 fraksiyonlarına ayrıldı ve Western blotlama ile ölçüldü (Şekil 1A). 20 dakika boyunca 100.000 × g'da ultrasantrifüjleme ile P2 fraksiyonunda kalan MT'lerin çökeltisi, bir fare beynindeki toplam tübülinin %34.86 ± %1.68'ini oluşturuyordu. Süpernatan (S2) ayrıca 60 dakika boy...

Tartışmalar

Canlı organizmalardan alınan dokudaki tübülin durumunu araştırırken en önemli görev, hazırlama sırasında kazara MT polimerizasyonunu veya depolimerizasyonunu önlemektir. Numunelerdeki MT'lerin stabilitesi, MSB'deki Taxol konsantrasyonu, doku miktarının tampona oranı ve doku çıkarmadan homojenizasyon ve santrifüjlemeye kadar olan işlem sırasındaki sıcaklık gibi faktörlerden etkilenir. Bu nedenle, 20 kat homojenat hacmine sahip fare dokusunu analiz etmek için protokolün her adımında koşullar o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus	Cytiva	11001313
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1	AS ONE	1-2050-11
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP	Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman	TOMY	KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)	Roche	11873580001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol	LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422